一种新型蛋白质生物素连接酶及基于其的邻近标记系统PhastID的制作方法

一种新型蛋白质生物素连接酶及基于其的邻近标记系统phastid
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及新型蛋白质生物素连接酶bpl及经过突变的蛋白质生物素连接酶融合蛋白bpl*及基于上述蛋白质生物素连接酶bpl或bpl*的邻近标记系统phastid。


背景技术：

2.蛋白质生物素连接酶可以通过活化生物素(biotin)形成生物素酰-5
’‑
腺苷酸biotinyl-5
’‑
amp，将生物素标记到其底物上。而经过人工改造，该连接酶可失去对底物的特异性标记，释放的biotinyl-5
’‑
amp化学性质极不稳定，可随机与邻近的赖氨酸残基发生反应，使其共价标记生物素，该范围约为10nm以内。结合生物素与链霉亲和素之间的高亲和力和稳定性，可对蛋白进行示踪、纯化等操作。由于其标记半径约为10nm，该距离恰好是蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,ppi)的前提，因此在蛋白质组学中具有广泛的应用前景。近年来，利用生物素连接酶进行邻近蛋白标记技术发展迅猛，这种技术首先将目的蛋白与生物素连接酶形成融合蛋白，经过一定时间的biotin标记后，通过生物素-链霉亲和素系统，纯化出目的蛋白周围被生物素连接酶标记的蛋白，再通过高通量的方法进一步鉴定出与之有相互作用的蛋白。目前，已有多种物种的生物素连接酶，经突变后发展为邻近标记技术被报道，包括bioid(bira*，来自escherichia coli，参考文献：roux k j,kim d i,raida m,et al.a promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells[j].j cell biol,2012,196(6):801-810.)、bioid2(bpl，来自aquifex aeolicus，参考文献：kim d i,jensen s c,noble k a,et al.an improved smaller biotin ligase for bioid proximity labeling[j].molecular biology of the cell,2016,27(8):1188-1196.)、rapid(basu，来自bacillus subtilis，参考文献：ramanathan m,majzoub k,rao d s,et al.rna
–
protein interaction detection in living cells[j].nature methods,2018,15(3):207.)和turboid(突变自bira*，参考文献：branon t c,bosch j a,sanchez ad,et al.efficient proximity labeling in living cells and organisms with turboid[j].nature biotechnology,2018,36(9):880-887)。但由于这些邻近标记技术均存在一定缺陷，如：标记能力较弱，故所需时间较长，在检测瞬时或弱相互作用蛋白时能力较弱；或酶的蛋白分子量较大。因此，寻找一种新型的，在结构及功能上都更具优势的生物连接酶具有十分重要的意义。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种新型蛋白质生物素连接酶bpl。
[0004]
本发明的第二个目的在于提供一种突变蛋白质生物素连接酶bpl*。
[0005]
本发明的第三个目的在于提供所述蛋白质生物素连接酶bpl或突变蛋白质生物素连接酶bpl*的应用。
[0006]
本发明的第四个目的在于提供一种包含上述蛋白质生物素连接酶bpl或突变蛋白质生物素连接酶bpl*的邻近标记系统。
[0007]
本发明的第五个目的在于提供所述邻近标记系统的应用。
[0008]
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0009]
一种蛋白质生物素连接酶(biotin protein ligase，bpl)，包括来源于古细菌pyrococcus horikoshii的bpl，称为phbpl；来源于古细菌pyrococcus kukulkanii的bpl，称为pkbpl；或来源于古细菌methanocaldococcus fervens的bpl，称为mfbpl；
[0010]
(a)其氨基酸序列分别依次如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所述；
[0011]
或
[0012]
(b)与seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所述氨基酸序列具有70％以上同源性且具有生物素蛋白连接酶活性的蛋白。
[0013]
一种突变蛋白质生物素连接酶bpl*，为蛋白质生物素连接酶bpl(phbpl、pkbpl、mfbpl)的突变体；具体为seq id no.1所述phbpl r48氨基酸残基的突变：r48g或r48s突变，即phbpl(r48g)或phbpl(r48s)，称为phbpl*；或seq id no.2所述pkbpl r48氨基酸残基的突变：r48g或r48s突变，即pkbpl(r48g)或pkbpl(r48s)，称为pkbpl*；或seq id no.3所述mfbpl r40氨基酸残基的突变：r40g，即mfbpl(r40g)，称为mfbpl*。
[0014]
本发明将phbpl r48氨基酸残基，pkbpl r48氨基酸残基及mfbpl r40氨基酸残基进行了突变，从而获得了较传统的bioid标记强度更高，所需标记时间更短的蛋白质生物素连接酶bpl*。
[0015]
本发明还提供一种编码上述突变蛋白质生物素连接酶bpl*的核苷酸序列。
[0016]
优选地，phbpl(r48g)、pkbpl(r48g)及mfbpl(r40g)的编码核苷酸序列依次如seq id no.4～6所示。
[0017]
一种包含所述突变蛋白质生物素连接酶bpl*编码核苷酸序列的重组表达载体。例如：pcdna3.1(-)-bpl*、plenti-ha-bpl*。
[0018]
一种包含上述重组表达载体的宿主细胞。例如：293t细胞、hek293t细胞、hela细胞。
[0019]
上述每一种蛋白质生物素连接酶bpl*均可单独建立一套bpl*标记系统。具体地，bpl*可快速催化atp与生物素形成biotinyl-5
’‑
amp并将之释放，后者可与邻近蛋白质赖氨酸残基发生反应，并将生物素共价结合在赖氨酸残基上，从而在生物素存在的情况下，在体内或体外对邻近蛋白质进行生物素标记。
[0020]
因此本发明保护上述蛋白质生物素连接酶bpl或突变蛋白质生物素连接酶bpl*在邻近蛋白标记或在制备邻近蛋白标记系统中的应用。
[0021]
一种包含上述蛋白质生物素连接酶bpl或突变蛋白质生物素连接酶bpl*的邻近蛋白标记系统。具体为包含待研究的“诱饵蛋白”(bait protein)、融合表达在诱饵蛋白n-端或c-端的新型蛋白质生物素连接酶bpl*。
[0022]
一种邻近蛋白标记方法，先将待研究的目的蛋白与上述的突变蛋白质生物素连接酶bpl*形成融合蛋白，经生物素标记，通过生物素-链霉亲和素系统，纯化出目的蛋白周围
被生物素连接酶标记的蛋白，再通过高通量的方法进一步鉴定出与之有相互作用的蛋白。
[0023]
具体为：
[0024]
(1)通过重组或敲入等方法，在待研究的“诱饵蛋白”的n端或c端融合表达蛋白质生物素连接酶bpl*；
[0025]
(2)在体外或体内，具有atp和biotin等底物存在的情况下，标记15min以上；
[0026]
(3)将细胞或组织裂解，用偶联在固相上的(strept-)avidin亲和纯化被biotin标记的蛋白；
[0027]
(4)利用elisa、western blot、质谱等方法鉴定被标记的蛋白，以发现新的互作蛋白。
[0028]
优选地，所述生物素浓度为5μm～50μm。
[0029]
优选地，所述标记时间为10min～16h。
[0030]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0031]
本发明提供了一种蛋白质生物素连接酶bpl、改造后的突变蛋白质生物素连接酶bpl*及基于其的邻近标记系统。所述包含蛋白质生物素连接酶bpl*的标记系统，相比与传统的bioid邻近标记系统，其标记强度更高，所需标记时间更短。具有较大的应用前景。
附图说明
[0032]
图1为新型生物素酶标记蛋白免疫印迹(western blot)检测结果图(左为检测结果图，右为统计图)。
[0033]
图2为新型生物素酶在不同时间标记蛋白免疫印迹(western blot)检测结果图(图a)及统计图(图b)。
[0034]
图3为具有核定位信号的新型生物素酶phbpl*与bioid2标记强度比较图(左为检测结果图，右为统计图)。
[0035]
图4为新型生物素酶在不同浓度标记蛋白免疫印迹(western blot)检测结果图。
[0036]
图5为体外利用亲和链霉素检测新型生物素酶融合蛋白(trf1)与端粒结合蛋白rap1的相互作用图。
具体实施方式
[0037]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0038]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0039]
实施例1蛋白质生物素连接酶bpl*(phbpl*、pkbpl*和mfbpl*)的获得
[0040]
在ncbi上获取多种物种的生物素连接酶序列，包括来源于古细菌pyrococcus horikoshii的bpl，称为phbpl，其氨基酸序列如seq id no.1所示；来源于古细菌pyrococcus kukulkanii的bpl，称为pkbpl，其氨基酸序列如seq id no.2所示；和来源于古细菌methanocaldococcus fervens的bpl，称为mfbpl，其氨基酸序列如seq id no.3所示；分析其gngr motif(n表示碱性氨基酸)，并将上述蛋白突变为gngg形式；phbpl r48氨基酸残基突变：r48g或r48s突变，即phbpl(r48g)或phbpl(r48s)，称为phbpl*；pkbpl r48氨基酸
残基突变：r48g或r48s突变，即pkbpl(r48g)或pkbpl(r48s)，称为pkbpl*；mfbpl r40氨基酸残基突变：r40g，即mfbpl(r40g)，称为mfbpl*。
[0041]
phbpl(r48g)、pkbpl(r48g)及mfbpl(r40g)的编码核苷酸序列依次如seq id no.4～6所示。
[0042]
seq id no.1：
[0043]
mlglktsiigrrviyfqeitstnefaktsyleegtvivadkqtmghgrlnrkwespegglwlsivlspkvpqkdlpkivflgavgvvetlkefsidgrikwpndvlvnykkiagvlvegkgdkivlgiglnvnnkvpngatsmklelgsevpllsvfrslitnldrlylnflknpmdilnlvrdnmilgvrvkilgdgsfegiaediddfgrliirldsgevkkviygdvslrfl；
[0044]
seq id no.2：
[0045]
mlslktsiigkkviyyqeisstndvaksldveegtvivadrqtkgrgrlnrkwispegglwlsvvlkpkvapqdipkivflgaigvvrtleelsipgrikwpndvlvnfrkisgiltekvgekvilgiginvnnntpengiavknvlgkevslvhvfkillenldelyeiylkspgtivelarelmilnvpvkvlgngevvgiaedidedgrlvlrlgngeirkiiygdvslrfl；
[0046]
seq id no.3：
[0047]
meiihlsevdstneyakklakegkrnfvvladkqstgkgrwgrvwysdegglyftivldsneydpkvinlitpisiietlknytdkelgikfpndimvkvngdykklggilaelingymiigiginvnnpirkeireiavslkevvgkeidrveifndflkrfedylkklknneiddyeilknykkysitigrtvkillsnnevitgkvydidfdgivlgteegiekiptgicihvr；
[0048]
seq id no.4
[0049]
atgctgggcctgaagacaagcatcatcggccggcgggtcatctacttccaggagatcaccagcaccaacgagttcgccaagaccagctacctggaggagggaaccgtgatcgtggccgataagcagaccatgggccacggaggcctgaacagaaagtgggagtccccagaaggaggcctgtggctgtctatcgtgctcagccctaaagtgccccagaaggacctgcctaagatcgtgttcctgggagcagtgggcgtggtggaaaccctgaaggagttcagcatcgacggcagaatcaagtggcccaacgacgtgctcgtgaactacaagaagatcgccggcgtgctggtcgagggcaaaggcgacaagatcgtgctgggcatcggcctgaacgtgaacaacaaggtgcccaacggcgccacaagcatgaaactggagctgggatcagaagtgcctctgctgagcgtgttcaggagcctgatcaccaacctggaccggctgtacctgaacttcctgaagaaccccatggacatcctgaacctcgtgcgggacaacatgatcctgggcgtgagagtgaagatcctgggcgacggcagcttcgagggcatcgccgaggatatcgacgacttcgggcggctgatcatcaggctggacagcggcgaggtcaagaaggtcatctacggcgacgtgtccctgagattcctgtag；
[0050]
seq id no.5：
[0051]
atgctgagcctgaagaccagcatcatcggcaagaaggtcatctactaccaggagatcagcagcaccaacgacgtggctaagagcctggacgtggaggaaggaaccgtgatcgtggccgataggcagaccaagggaaggggaggcctgaatcgcaagtggatcagcccagaaggaggactctggctgtcagtggtgctcaagcctaaagtggcccctcaggacatccccaagatcgtgtttctgggcgccatcggcgtcgtgagaacactggaggagctgagcatccccggcagaatcaagtggcccaacgacgtgctcgtgaacttccggaagatcagcggcatcctgaccgagaaggtcggcgagaaggtcatcctgggcatcggcatcaacgtgaacaacaacacccccgagaacggcattgccgtgaagaacgtgctgggcaaggaagtgtctctggtgcacgtgttcaagatcctgctggagaacctggacgagctgtacgagatctacctgaagagccccggcaccatcgtggaactggccagggagctgatgatcctgaacgtgcccgtgaaggtgctgggaaacggagaggtc
gtgggaatcgccgaggatatcgacgaggacggcagactggtgctgagactgggaaacggcgagatccggaagatcatctacggcgacgtgtccctgagattcctgtag；
[0052]
seq id no.6：
[0053]
atggagatcatccacctgagcgaagtggacagcaccaacgagtacgccaagaagctggccaaggagggcaagcggaacttcgtggtgctggccgacaagcagagcacaggaaaaggcggctggggcagagtgtggtatagcgacgagggaggcctgtacttcaccatcgtgctggacagcaacgagtacgaccccaaggtcatcaacctgatcacccccatcagcatcatcgagaccctgaagaactacaccgacaaggagctgggcatcaagttccccaacgacatcatggtgaaggtcaacggcgactacaagaagctgggcggaatcctggccgaactgatcaacggctacatgatcatcggcatcggcatcaacgtgaacaaccccatccggaaggagatccgggagatcgcagtgtccctgaaggaggtcgtgggaaaggagatcgaccgggtggagatcttcaacgacttcctgaagcgcttcgaggactacctgaagaagctgaagaacaacgagatcgacgactacgagatcctgaagaactacaagaagtacagcatcaccatcggccggaccgtgaagatcctgctgagcaacaacgaggtcatcaccggcaaggtgtacgacatcgacttcgacggcatcgtgctgggaacagaggagggcatcgagaagatccccaccggcatttgcatccacgtccgatag。
[0054]
实施例2蛋白质生物素连接酶bpl*重组质粒构建及表达
[0055]
(1)重组质粒的构建
[0056]
将真核表达载体pcdna3.1(-)用bamhi和hindiii双酶切后回收，然后与经bamhi和hindiii双酶切后回收的新型生物素连接酶bpl*(phbpl*、pkbpl*和mfbpl*)pcr片段(seq id no.4～6)在t4连接酶作用下连接，转化dh5α感受态细胞后涂布在含氨苄的lb平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，进行测序鉴定，鉴定的阳性质粒即为所需重组质粒。
[0057]
(2)哺乳动物细胞瞬时表达新型生物素连接酶
[0058]
为构建表达新型生物素连接酶的哺乳细胞系，利用lipofectamine 2000转染法将步骤(1)的pcdna3.1重组质转染入293t细胞，具体步骤如下：
[0059]
转染前一天，在六孔板中接种293t细胞，于37℃、5％co2、含有10％胎牛血清的dmem完全培养基中培养，至转染时细胞密度为40％～60％。在250μl opti-mem减血清培养基中稀释2μg重组质粒，并轻轻混匀。另取10μl lipofectamine 2000，稀释于250μl opti-mem减血清培养基中。室温下静置5分钟。混合lipofectamine 2000和线性化质粒的稀释液。轻轻混匀并在室温下静置20分钟。向细胞板上接种293t细胞的孔中加混合液500μl，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀，转入co2培养箱中培养。次日更换新鲜的含有10％胎牛血清的dmem完全培养基中继续培养。
[0060]
(3)western blotting检测生物素标记
[0061]
转染24h后收取细胞，western blot检测标记效果，如图1(左为检测结果图，右为统计图)所示，phbpl*、pkbpl*和mfbpl*同已被发表的aabpl*(bioid2)类似，均展现出标记活性。
[0062]
western blotting具体实施方法如下：
[0063]
(a)sds—page胶的配制
[0064]
首先选取合适厚度的长玻璃板(1mm或0.75mm)，与短玻璃板对齐夹在制胶夹上，用洗瓶向两板间空隙加满ddh2o进行验漏，如一至两分钟水平面没有下降说明两胶板配合严密，此时将水倒出并用吸水纸吸干。取干净烧杯按下表1配制分离胶(以一块10％的分离胶
为例)：
[0065]
表1分离胶配制成分
[0066][0067]
将分离胶溶液倒入两板间空隙，用洗瓶沿着玻璃板壁在胶上层加入ddh2o，约20min后可看到胶与水明显分层，说明胶已凝固；
[0068]
将上层水倒出并用吸水纸吸干，准备与胶板厚度对应的梳子(10孔or 15孔)，按下表2配制浓缩胶：
[0069]
表2浓缩胶配制成分
[0070][0071]
将浓缩胶溶液小心加入分离胶上层，尽量避免气泡产生。胶板加满后，小心插上梳子，约10min后可见梳齿边缘明显轮廓，说明胶已凝固。将胶板从制胶夹中拿出，用水冲洗后待用。
[0072]
(b)sds-page凝胶电泳
[0073]
将胶连同胶板安装在电泳槽上，内槽加满电泳缓冲液，外槽加至指示刻度。将准备好的蛋白样品点入胶孔后盖好盖子连接电源，设置两步电泳程序：80v15min，150v 45min,待溴酚蓝指示带跑至胶的下边缘是停止。在流水下撬开两玻璃板，将胶取出，根据需要泡入不同溶液中，如考马斯亮蓝染液，硝酸银染色固定液或转膜缓冲液。
[0074]
(c)膜转印
[0075]
准备与胶差不多大小的nc膜，并准备滤纸，同样泡入预冷的转膜缓冲液中。依照海绵、滤纸、nc膜、胶、滤纸、海绵的顺序将其叠放好(注意胶与膜间不应有气泡)，用转膜夹夹紧后安装在转膜槽，加满转膜液。转膜槽置于冰浴中或者放入4度冰箱，200-250ma转膜1小
时。
[0076]
(d)蛋白信号检测
[0077]
将转膜完毕的nc膜置于封闭液中摇动1h，转移至稀释的streptavidin-hrp中孵育1h或者4度过夜，孵育后将膜在tbst溶液中漂洗3次，采用luminata
tm forte作为底物显色，在biorad chemidoc xrs 凝胶成像系统中拍照。
[0078]
或者，封闭后的nc膜用稀释的streptavidin-alexa fluor 680孵育1h，孵育后将膜在tbst溶液中漂洗3次。蛋白条带信号用odyssey双色红外激发光成像系统检测并记录。
[0079]
实施例3采用蛋白质生物素连接酶bpl*标记邻近蛋白的条件探索
[0080]
分别将新型生物素连接酶bpl*(phbpl*、pkbpl*和mfbpl*)(seq id no.4～6)与端粒结合蛋白trf1一起重组克隆到慢病毒载体上，在其n端加入ha抗原，形成plenti-ha-bpl*-trf1载体，同时构建plenti-ha-bpl*-nls载体。
[0081]
将hek293t细胞传至6cm2培养皿，代其密度达到70％-80％进行转染。转染前，根据需要选择配制表3所示下列转染体系：
[0082]
表3转染体系
[0083][0084]
体系配好后用移液枪吹打混匀，室温静置15min。加至培养的细胞培养基中，前后摇动混匀；6小时后换新鲜培养基，继续培养至48小时；收集病毒液上清。
[0085]
病毒收集后，进行病毒感染目的细胞。首先要将hela细胞进行铺板，保证细胞的浓度低于60％，在病毒液中加入浓度为10mg/ml的polybrene，使得终浓度为8μg/ml，均匀混合好。吸取目的细胞中的培养基，加入病毒混合液，并加入新鲜培养基补充至5ml，将细胞静置于37度培养箱中。感染结束后，收取样品进行western blot检测融合蛋白的表达。
[0086]
确认细胞过表达生物素连接酶-端粒结合蛋白trf1融合蛋白后，采用去除内源性biotin的培养基培养细胞，进行以下条件的摸索：
[0087]
(1)标记时间：0min，1min，10min，30min，1h，2h，4h，8h和16h；
[0088]
结果如图2～3所示，图2为新型生物素酶bpl*在不同时间标记蛋白免疫印迹(western blot)检测结果图(图2a)及统计图(图2b)，结果表明，标记强度随标记时间加长而更强，phbpl*-trf1在2h就趋近标记饱和，pkbpl*、mfbpl*和aabpl*(bioid2)则不存在饱和现象。图3为具有核定位信号的新型生物素酶phbpl*与bioid2标记强度比较图(左为检测结果图，右为统计图)，结果表明，phbpl*-nls标记活性远远强于aabpl*(bioid2)，phbpl*标记10分钟即可具有一定效果，4h可以达到aabpl*标记16h效果。
[0089]
(2)生物素浓度：0μm，0.5μm，5μm和50μm
[0090]
图4为新型生物素酶bpl*在不同生物素浓度下，对蛋白质进行标记的效果。结果表明，新型生物素酶bpl*在0.5μm，5μm和50μm均显示出标记活性，其中，优选的生物素浓度为5μm-50μm。
[0091]
(3)链霉亲和素纯化实验
[0092]
裂解过表达生物素连接酶-trf1的hela细胞，利用链霉亲和素纯化被标记上biotin的蛋白，检测基于新型生物素连接酶的标记系统，是否可以标记到trf1的邻近(而非直接互作)蛋白rap1。
[0093]
具体实施流程如下：
[0094]
收集细胞样品(6cm培养皿)，使用480μl ripa裂解细胞15min，于4℃15,000g离心15min。取400μl上清与偶联链霉亲和素的磁珠于4℃三维旋转孵育2h。取40μl作为input样品。完成下拉的磁珠样品用1ml 2％sds、500μl tbst和500μl tbs分别洗涤两次。将洗涤过的磁珠样品加入含sds的洗脱液在沸水中煮10分钟后进行western blot检测。
[0095]
结果如图5所示，表明基于phbpl*、pkbpl*和mfbpl*的标记系统，同bioid2类似，均展现出对rap1的标记能力，其中phbpl*标记能力最强，pkbpl*的标记特异能力较高。