一种白色肺形侧耳及其栽培方法与流程

1.本发明属于食用菌领域，具体涉及一种白色肺形侧耳菌株，以及该白色肺形侧耳菌株的栽培方法。


背景技术：

2.肺形侧耳(又名秀珍菇。别名：凤尾菇、凤尾侧耳、印度平菇或喜马拉雅平菇等；其拉丁名为：pleurotus pulmonarius(fr.)qu
é
l.)属于侧耳科侧耳属。肺形侧耳外形小巧秀美，不仅质地细嫩，味道鲜美，而且营养丰富，含有丰富的蛋白质、糖类、不饱和脂肪酸、维生素、叶酸和多种微量元素等；肺形侧耳的蛋白质含量比香菇、草菇都高；其子实体中含有18种氨基酸，其中天冬氨酸和谷氨酸含量较高。另外，肺形侧耳具有的蛋白含量高、低脂肪酸特性，可作为减肥保健食品；其含有的多糖成分具有抗肿瘤功能，还能用于提高人体免疫力。故肺形侧耳被视为是一种营养价值极高的珍稀食用菌，有“菇中极品”的美誉。
3.目前，已知肺形侧耳的子实体菌盖颜色为灰色或褐色，颜色较为单一；其次，肺形侧耳品种较少，国家认定的肺形侧耳品种仅有2个；此外，栽培周期长。难以满足人们高水平生活的消费需求。
4.我国从南到北的原始森林中具有丰富的野生食用菌资源，其中包括野生的肺形侧耳资源。对野生的肺形侧耳资源进行开发，不仅可以丰富人们的餐桌，而且还可以利用食用菌药食兼用的特性，开发出附加值更高的食品、饮料和保健品等，从而大大提高菇农的收入和出口创汇能力。
5.经检索，没有发现菌盖颜色为白色的肺形侧耳。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供一种白色的肺形侧耳菌株。
7.本发明另一目的在于提供上述肺形侧耳菌株的栽培方法。
8.本发明的目的通过如下技术方案实现：
9.本发明提供一种肺形侧耳(pleurotus pulmonarius(fr.)qu
é
l.)菌株黔侧02，已于2021年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，其保藏编号为cctcc no:m2021259。
10.上述菌株黔侧02，其子实体菌盖颜色为白色。
11.本发明还提供上述菌株黔侧02在食品或保健品中的应用。
12.本发明还提供一种食品或保健品，其所述的食品或保健品中含有上述菌株黔侧02或黔侧02的提取物。
13.本发明还提供上述菌株黔侧02在饮料中的应用。
14.本发明还提供一种饮料，其所述的饮料中含有上述菌株黔侧02或黔侧02的提取物。
15.本发明还提供上述菌株黔侧02在制备提高人体免疫力药物中的应用。
16.本发明还提供一种肺形侧耳基因工程菌株，所述的基因工程菌株的出发菌为上述菌株黔侧02。
17.本发明还提供了上述肺形侧耳菌株黔侧02的栽培方法，包括如下步骤：
18.(1)母种培养：将黔侧02菌种接种于母种培养基上，在25℃、空气相对湿度60～75％、避光条件下培养8天，得黔侧02母种；
19.(2)原种培养：按照1:30的质量比将步骤(1)中所得的黔侧02母种接种于原种培养基上，在25℃、空气相对湿度60～75％、避光条件下培养25～30天，得黔侧02原种；
20.(3)栽培种培养：按照1:30的质量比将步骤(2)中所得的黔侧02原种接种到栽培种培养基上，在25℃、空气相对湿度60～75％、避光条件下培养25～30天，得黔侧02栽培种；
21.(4)栽培培养料接种：在无菌环境中，取出菌袋中心的塑料棒，按照1:30的质量比将步骤(3)中所得的黔侧02栽培种接种到栽培培养料中心的棒孔中，再用套环和棉塞封口；在25℃、空气相对湿度60～75％、避光条件下培养30～35天，菌丝长满培养料；
22.(5)搔菌：将菌袋袋口打开，再用灭菌后的小铲刀将表面的老菌皮挖去，露出新鲜菌丝；
23.(6)低温刺激：将菌袋置于4℃环境中低温刺激12小时，低温刺激促进出菇整齐；
24.(7)出菇管理和采收：出现原基后，在温度23℃、空气相对湿度80～90％、散射光500～600lx，通风良好条件下培养6～8天；当子实体菌盖平展，孢子未弹射时，采收子实体。
25.上述栽培方法步骤(1)中所述的母种培养基的组成成分及其比例为：去皮马铃薯200g取汁，葡萄糖20g，琼脂18g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，混匀，用纯净水定容至1000ml。
26.所述的母种培养基的制备方法：将马铃薯200g去皮切成1.5cm左右方块，放入800ml纯净水中煮沸20min，3层纱布过滤，取浸提液，再加入葡萄糖20g，琼脂18g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，混匀；用纯净水定容至1000ml，121℃灭菌30min；倒入直径9cm平板，备用。
27.上述栽培方法步骤(2)中所述原种培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米芯40％，棉籽壳40％，麦麸15％，豆粨2％，石灰2％，轻质碳酸钙1％；培养基含水量为60～65％。
28.所述步骤(2)中原种培养基的制备方法：按步骤比例取玉米芯40％，棉籽壳40％，麦麸15％，豆粨2％，石灰2％，轻质碳酸钙1％，混合均匀；然后按照比例加水，搅拌均匀，装入聚丙烯塑料袋(规格15cm
×
33cm
×
0.005cm)，121℃灭菌2小时，备用。
29.上述栽培方法步骤(3)中所述栽培种培养基的组成成分及其重量百分比与步骤(2)中所述的原种培养基相同，制备方法亦相同。
30.上述方法步骤(4)中所述的栽培培养料的组成成分及其重量百分比与步骤(2)中所述的原种培养基相同，制备方法也相同，区别是在将栽培料装入袋中时，袋口中心插入13cm空心塑料棒，3.5cm套环配套棉塞封口，121℃灭菌2小时，再冷却至常温；备用。
31.本发明具有的优点和有益技术效果：(1)本发明肺形侧耳黔侧02的子实体呈纯白色，洁白美观，商品价值高，而已知的肺形侧耳菌株的子实体一般为灰色或褐色，尚无白色肺形侧耳，本发明为消费者提供了一种新的肺形侧耳类型。(2)本发明菌株黔侧02的子实体质地紧密，口感清脆，食用品质好。(3)本发明菌株黔侧02栽培周期短，从栽培培养料接种到出菇采收的周期为50～60天，而现有的肺形侧耳主栽品种凤尾菇、京秀1号、秀03、夏秀004、中农秀珍(国品认菌2008027)、秀珍菇5号(国品认菌2008026)的栽培周期分别为60～80天、
60～70天、70～90天、70～80、70～90天、70～90天；黔侧02比现有肺形侧耳主栽品种栽培周期缩短10～20天。(4)黔侧02产量高，其农业式栽培每袋平均产量为310.7g，菇农经济效益高。
32.生物保藏：本发明肺形侧耳(pleurotus pulmonarius(fr.)qu
é
l.)菌株黔侧02是本发明人在贵州省铜仁梵净山地区采集，并经筛选、培育而成；该菌株已于2021年3月22日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：地址中国武汉武汉大学；其保藏编号为cctcc no:m2021259。
附图说明:
33.图1.本发明菌株黔侧02的子实体照片。
34.图2.本发明菌株黔侧02的系统发育树图。
35.图3.采用rapd引物s18扩增的不同肺形侧耳菌种的papd对比电泳图谱；其中m为dna分子量标准，1为黔侧02；2为凤尾菇；3为京秀1号；4为秀03；5为夏秀004。
36.图4.采用rapd引物s2056扩增的不同肺形侧耳菌种的papd对比电泳图谱；其中m为dna分子量标准，1为黔侧02；2为凤尾菇；3为京秀1号；4为秀03；5为夏秀004。
具体实施方式
37.以下通过实例对本发明作进一步说明，但是对本发明不构成任何限制。
38.实施例1本发明菌株黔侧02的采集、分离驯化过程
39.2019年8月，本发明人在贵州铜仁梵净山地区，梵净山山顶发现了野生的白色食用菌子实体。将野生的子实体组织分离得到菌丝(菌种)，然后将组织分离后的菌种进行栽培出菇试验，再对朵型良好的子实体进行组织分离，接种于pda培养基上进行培养，筛选菌丝生长速度快，长势均匀的菌株，的菌株继续栽培驯化，经过数代培养，筛选出一个遗传性状稳定、纯白色的食用菌菌株，命名为：黔侧02。
40.实施例2本发明菌株黔侧02的分类鉴定
41.(1)黔侧02的形态学鉴定：
42.子实体丛生，纯白色；菌盖呈扇形，菌盖截面平整，中部稍凹，菌盖直径5.1～12.3cm，平均8.2cm；菌盖厚度适中，0.8～1.2cm，平均1.0cm；菌柄长0.8～2.3cm；菌褶无网纹，菌褶延生至菌柄顶端；子实体质地紧密。根据《中国大型菌物资源图鉴》(李玉主编，中原农民出版社，2015年出版)第990页有关肺形侧耳的照片及相应特征描述，黔侧02与肺形侧耳的形态特征一致，说明黔侧02在分类上属于侧耳属肺形侧耳(pleurotus pulmonarius(fr.)qu
é
l.)。
43.(2)黔侧02分子生物学鉴定
44.采用植物基因组dna提取试剂盒cw0531(北京康为世纪公司)提取黔侧02菌株的dna，以its1和its4为引物进行pcr扩增，并对扩增产物进行测序。所述的引物序列如下：
45.its1：5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'；
46.its4：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。
47.its-pcr反应体系为：总体积20μl：20-50ng/μl的dna模板1μl，10
×
buffer(with mg
2
)2μl，2.5mm dntp 0.5μl，5u/μl dna聚合酶0.2μl，0.2μm引物各0.5μl，加双蒸水至20μ
l。its-pcr反应条件为：预变性94℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃75s，30个循环；72℃延伸10min。将pcr扩增产物进行凝胶电泳。结果所得pcr扩增产物为长度为573bp的dna分子片段。
48.将该dna分子片段送交上海生工进行测序，结果该dna分子片段的核苷酸序列如seq id no:1所示(its序列)。
49.将本发明菌株黔侧02的its序列在genebank上进行blast比对，并构建系统发育树。结果本发明菌株黔侧02与肺形侧耳(pleurotus pulmonarius)的相似度最高，相似度达99.83％；结合系统给发育树图(见图2)可以看出，本发明菌株黔侧02在分类上属于侧耳属肺形侧耳种(pleurotus pulmonarius(fr.)qu
é
l.)。此外，从相似度对比结果可以看出，黔侧02与任何已知的肺形侧耳菌株都不同，是一种新的肺形侧耳(又名秀珍菇)菌株。
50.实施例3本发明菌株黔侧02与其他肺形侧耳品种的papd对比分析试验(一)、试验菌株：1、黔侧02；2、凤尾菇(北京吉蕈园选育出的淡灰色肺形侧耳)；3、京秀1号(北京吉蕈园选育出的淡褐色肺形侧耳)；4、秀03(黔东南创健台江的灰色肺形侧耳)，5、夏秀004(江苏天龙菌业选育出的褐色肺形侧耳)。
51.(二)试验方法
52.采用植物基因组dna提取试剂盒cw0531(北京康为世纪公司)分别提取黔侧02、凤尾菇、京秀1号、秀03和夏秀004菌株的基因组dna，选取20条rapd引物(见表1)进行pcr扩增。
53.表1rapd随机引物序列
54.引物名称引物序列5
’‑3’
引物名称引物序列5
’‑3’
s18ccacagcagts80acttcgccacs24aatcgggctgs90agggccgtcts27gaaacgggtgs94ggatgagaccs30gtgatcgcags159acggcgtatgs32tcggcgatags242ctgaggtctcs39caaacgtcggs484agtgcgctgas43gtcgccgtcas1017cagtggggags64ccgcatctacs1398tggtccagccs75gacggatcags2056ctggtgctcas79gttgccagccs2111gacgaccgca
55.rapd-pcr扩增反应体系为：总体积20μl：20-50ng/μl的dna模板1μl，10
×
buffer(with mg
2
)2μl，2.5mm dntp 0.5μl，5u/μl easytaq酶0.2μl，0.2μm引物1μl，加双蒸水至20μl。rapd-pcr反应条件为：预变性95℃5min；94℃45s，36℃1min，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。
56.结果从以s18为引物扩增的rapd电泳图谱(见图3)和以s2056为引物扩增的rapd电泳图谱(见图4)中均可以看出，黔侧02相对于凤尾菇、京秀1号、秀03和夏秀004之间均存在明显区别的特异性条带，说明黔侧02与现有的肺形侧耳菌株不同，是一种新的肺形侧耳(pleurotus pulmonarius(fr.)qu
é
l.)菌株。
57.实施例4本发明肺形侧耳菌株黔侧02的栽培试验：
58.(1)母种培养：将黔侧02菌种(本菌种已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中
国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no:m2021259，保藏日期为2021年3月29日)接种于母种培养基上，在25℃、空气相对湿度70％、避光条件下培养8天，得黔侧02母种；所述的母种培养基的制备方法：将200g去皮马铃薯切成1.5cm左右方块，放入800ml水中煮沸20min，3层纱布过滤取浸提液，加入葡萄糖20g，琼脂18g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，混匀后定容至1000ml，121℃灭菌30min；倒入直径90mm平板；备用。
59.(2)原种培养：按照1:30的质量比将步骤(1)中黔侧02号母种接种于原种培养基上培养，在25℃、空气相对湿度70％、避光条件下培养30天，得黔侧02原种。所述原种培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米芯40％，棉籽壳40％，麦麸15％，豆粨2％，石灰2％，轻质碳酸钙1％，培养基含水量65％。所述的原种培养基按照如下方法制备，按比例将各组分混合均匀，然后按比例加入水，搅拌均匀，即得原种培养基。将混匀的原种培养基装入聚丙烯塑料袋(规格15cm
×
33cm
×
0.005cm)，121℃灭菌2小时。
60.(3)栽培种培养：按照1:30的质量比将步骤(2)中所得黔侧02原种接种到栽培种培养基上。在25℃、空气相对湿度70％，避光条件下培养30天，得黔侧02栽培种。所述的栽培种培养基的组成成分及其重量百分比、配制方法、装袋和灭菌方式与步骤(2)的原种培养基相同。
61.(4)栽培培养料接种：在无菌环境中，取出菌袋中心的塑料棒，按照1:30的质量比将步骤(3)中所得黔侧02栽培种接种到栽培培养料中心的棒孔内，再用套环和棉塞封口，在25℃、空气相对湿度70％、避光条件下培养35天。其中所述的栽培培养料与步骤(2)所述的原种培养基的组成成分和配制方法相同，但是在装袋时在袋口中心插入13cm空心塑料棒，3.5cm套环配套棉塞封口，121℃灭菌2小时；备用。
62.(5)搔菌：将步骤(4)的菌袋袋口打开，用灭菌后的小铲刀将表面的老菌皮挖去，露出新鲜菌丝。
63.(6)低温刺激：将菌袋置于4℃环境中低温刺激12小时，低温刺激促进菇蕾整齐。
64.(7)出菇管理和采收：出现原基后，在温度23℃、空气相对湿度85％、散射光500lx、通风良好条件下培养8天；当子实体菌盖平展，菌盖边缘平伸，为最适宜采收期，可采收子实体。采收时左手按住栽培袋，右手握住菌柄基部，轻轻旋钮即可完成采摘，采摘后用保鲜盒封装。
65.对采收后的黔侧02子实体进行观测、称重。
66.结果(见图1)本发明菌株黔侧02的子实体呈纯白色，洁白美观，商品价值高，市场上尚无白色肺形侧耳，本发明为消费者提供了一种新的肺形侧耳类型。其次，本发明菌株黔侧02的子实体质地紧密，口感清脆，食用品质好。另外，本发明菌株黔侧02栽培周期短，从栽培培养料接种到出菇采收的周期为50～60天，如凤尾菇、京秀1号、秀03、夏秀004、中农秀珍(国品认菌2008027)、秀珍菇5号(国品认菌2008026)等肺形侧耳的栽培周期分别为60～80天、60～70天、70～90天、70～80、70～90天、70～90天，黔侧02比现有肺形侧耳栽培品种的栽培周期缩短10～20天。此外，黔侧02的产量高，其农业式栽培每袋平均产量为310.7g，菇农经济效益高。