一种基于TaqMan探针qPCR技术的美洲大蠊药材特异性检测方法与流程

一种基于taqman探针qpcr技术的美洲大蠊药材特异性检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物学鉴定技术领域，具体涉及中药材美洲大蠊的分子生物学检测方法，是一种基于taqman探针的qpcr技术分子生物检测方法。
技术背景
2.美洲大蠊（periplaneta americana）昆虫纲，蜚蠊目，蜚蠊科，俗称蟑螂。是地球上起源最早、生命力最顽强的昆虫类群之一。作为传统中药材，可用于治血瘀症、寒热、破积聚、喉咽痹、内寒无子等症状，其入药始见于《神农本草经》。近年来美洲大蠊的药用价值越来越受到关注，其具有抗肿瘤，保肝，促进组织修复，增强机体免疫力，抗菌、抗病毒，抗氧化等药理作用，在治疗顽固性溃疡、消化道疾病，妇科疾病，手术后伤口创面，皮肤及黏膜损伤等临床疾病均具有良好的效果。目前已经有多种美洲大蠊制剂被批准上市如康复新液、心脉隆注射液、消症益肝片和肝龙胶囊等，在国内取得了较大的经济效益，因此，美洲大蠊极大的药用价值，促使其在医药领域具有广泛的应用。
3.对美洲大蠊品种的鉴定是入药的基础，是保证药效的重要环节之一。传统的鉴定方法大多采用性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定，主要基于药材的形态学特征及形体测量数据。
4.近年来生物学鉴定技术-聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，pcr）法作为一项重要的鉴定工具，因其迅速、简便、灵敏等优点亦不断地用于中药材的鉴定，生物学鉴别技术具有传统鉴别技术无法比拟的优越性，成为物种鉴定的核心技术之一。之前，我们已经建立了普通pcr技术鉴定美洲大蠊药材分子鉴定的方法（发明专利cn201710426033.6和cn201710991800.8）。
5.相对常规pcr而言，实时荧光定量pcr的主要优点是可以准确地确定初始模板拷贝数和宽的动态范围内和高的灵敏度。其结果既可以用于定性（判定一段序列的有无），也可以用于定量（确定拷贝数）。另外，实时荧光定量pcr的结果不需要通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省试验时间，提高实验效率。最后，实时荧光定量pcr反应和检测都在反应管中进行，样品的污染几率大大降低，无需扩增后的试验操作。鉴于此，本发明专利建立了基于taqman探针时荧光定量pcr技术对美洲大蠊药材鉴定方法，为美洲大蠊药材的检测提供一种快速、高效的方法，以保证美洲大蠊的入药质量。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于公开了一种运用实时荧光定量pcr技术鉴定美洲大蠊药材的方法及检测用的引物和探针，为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明首先提供的一种基于taqman探针实时荧光定量pcr技术鉴定美洲大蠊方法，包括以下步骤：（1)设计并合成taqman引物、探针序列；
（2）制备美洲大蠊药材样本的基因组dna模板；（3）对待测美洲大蠊药材的基因组dna模板进行实时荧光定量pcr检测；（4）以蜚蠊属的样本基因组dna做对照，进行实时荧光定量pcr检测；（5）将美洲大蠊药材提取的基因组dna作为模板，进行等梯度稀释，（稀释度为5倍），建立taqman探针实验的标准曲线。
7.步骤（1）所述的引物和探针的序列为：引物序列为：上游引物序列：5
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gagccccagatatagccttcc-3’，下游引物序列：5
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caatgcctcttgctagtggtg-3’taqman探针序列：5
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tactgttcatcctgttccg-3’，其中探针 5’端标记 fam 荧光分子，在3’端标记mgb，偶联nfq。
8.步骤（3）中所述的pcr扩增体系见表1。
9.表1 pcr扩增体系反应体系用量taqmanmix(2x)7ulprobe(10μm)0.375ulfp(10μm)0.3ulrp(10μm)0.3uldna模板1.5ulddh2o5.025ul总体积15ul步骤（3）中的pcr扩增程序见表2。
10.表2 pcr扩增程序本发明其次提供了一种用于检测美洲大蠊药材的引物，其序列为：上游引物序列：5
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gagccccagatatagccttcc-3’下游引物序列：5
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caatgcctcttgctagtggtg-3’本发明进一步提供了一种用于检测美洲大蠊药材的taqman探针，其序列为：taqman探针序列：5
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tactgttcatcctgttccg
ꢀ-3’
其中探针 5’端标记 fam 荧光分子，在 3’端标记 mgb，偶联 nfq。
11.本发明提供的一种基于taqman探针实时荧光定量pcr技术鉴定美洲大蠊药材的方法，及检测用的引物及探针。具有灵敏度高，实用性强，操作简单，能快速准确的鉴定美洲大
蠊药材的特点，填补了通过实时荧光定量pcr技术鉴定美洲大蠊药材的空白。
附图说明
12.图1为taqman探针法检测美洲大蠊药材基因组dna；图2为taqman探针法检测蜚蠊属药材基因组dna；图3为taqman探针法建立的美洲大蠊基因组dna标准曲线。
具体实施方式
13.实施例1 taqman 探针法检测美洲大蠊药材基因组dna（1）引物和探针的设计美洲大蠊（cytochrome oxidase subunit i）基因qpcr检测引物:上游引物：5
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gagccccagatatagccttcc-3’下游引物：5
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caatgcctcttgctagtggtg-3’探针：5
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tactgttcatcctgttccg-3’，在探针5’端标记fam荧光分子，在3’端标记mgb，偶联nfq)（2）样本dna模板的制备取待测美洲大蠊药材样本，利用细胞/组织基因组dna提取试剂盒提取样本dna，将提取的dna样本通过核酸检测仪器检测其浓度。
14.（3）待测样品dna的实时荧光定量pcr扩增采用15ul的pcr反应体系，该体系组成及比例为：taqman mix (2x) 7.5 ul，probe (10 μm) 0.375 ul，fp (10 μm) 0.3 ul，rp (10 μm) 0.3 ul，基因组 dna 1.5 ul，ddh2o 5.025ul。
15.pcr扩增程序为：50℃ 2min ，92℃ 10min，（97℃ 1 sec，62℃ 20sec）收集荧光信号40个循环（4）应用实时荧光定量pcr分析软件，分析扩增结果结果判定：上述taqman实验，使用美洲大蠊药材提取的基因组dna进行检测，使用不含任何dna的去离子水作为阴性对照。从实验结果可知，引物和探针扩增能够产生特异性的荧光信号，产生了明显的扩增曲线，并且呈现指数上升，说明所设计的引物和探针能够对美洲大蠊基因组dna进行特异性扩增检测（图1）。
16.实施例2：taqman探针法检测不同蠊属药材基因组dna取待测澳洲大蠊、德国小蠊样本，按照实施例1中的dna模板制备方法制备其基因组dna。
17.将美洲大蠊、澳洲大蠊、德国小蠊的基因组dna分别进行qpcr检测。
18.pcr反应体组成及比列为：taqman mix (2x) 7.5 ul，probe (10 μm) 0.375 ul，fp (10 μm) 0.3 ul，rp (10 μm) 0.3 ul，基因组 dna 0.75 ul，ddh2o 5.775 ulpcr扩增程序为：50℃ 2min ，92℃ 10min，（97℃ 1sec，62℃ 20sec）收集荧光信号40个循环应用荧光定量pcr分析软件，分析扩增结果分析结果为：上述taqman实验，使用美洲大蠊、德国小蠊和澳洲大蠊基因组dna进行
qpcr检测，去离子水作为阴性对照。从实验结果可知，美洲大蠊ct值为21.63和21.78，德国小蠊ct值为30.29和30.38，澳洲大蠊ct值为33.46和34.03，德国小蠊与美洲大蠊相差256倍（相差8个循环）以上，澳洲大蠊与美洲大蠊相差4096倍（相差12 个循环）以上（图2）。说明利用此方法能够将美洲大蠊与澳洲大蠊、德国小蠊加以区分。
19.实施例3：taqman探针法制作标准曲线将美洲大蠊药材提取的基因组dna模板做梯度稀释(（每个稀释度为5倍)，进行扩增，制作taqman探针实验的标准曲线。
20.pcr反应体系：各组成比列同实施例1。
21.pcr扩增程序：50℃ 2min ，92℃ 10min，（97℃ 1 sec，62℃ 20sec）收集荧光信号46个循环应用荧光定量pcr分析软件，分析扩增结果结果显示：根据梯度稀释的美洲大蠊药材基因组dna得到的扩增曲线，其相关性是（r2=0.9967），说明其扩增效率及特异性较好，其荧光曲线与所检测的靶基因浓度之间的相关性较号，准确度较高（图3）。
22.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做一些修改或改进，用类似的方法进行相关研究，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均落入本发明的保护范围内。