高度血管化的多相复合骨单元支架的3D生物打印方法与流程

高度血管化的多相复合骨单元支架的3d生物打印方法
技术领域
1.本发明属于3d生物打印技术领域，尤其涉及一种高度血管化的多相复合骨单元支架的3d生物打印方法。


背景技术：

2.骨缺损问题是骨科棘手的问题，人体对于超过目前对移植的骨替代品有巨大需求，是每年第二大移植组织。针对骨缺损问题，骨组织工程在临床实际应用中解决了一部分问题。随着3d生物打印技术的发展推动了骨组织工程的进展，但构建大尺寸的骨移植仍有较大的挑战，其中对细胞存活至关重要的血管网络是主要局限之一，在自然组织中，细胞的分布通常被限制在距离最近的毛细血管200um的距离内，这是氧气和营养物质的有效扩散距离。在3d生物打印的骨支架体内移植后，宿主血管入侵的速度较慢，很容易导致移植物中心区域的细胞缺乏营养而坏死。血管化在骨形成和再生过程中起着至关重要的作用，开发功能性预血管网络系统以改善组织工程化骨替代物的存活和整合是有效方式之一。
3.通过通过上述分析，利用3d生物打印现有技术打印骨支架存在的问题及缺陷为：
4.(1)目前构建大尺寸的骨移植支架仍有较大的挑战，其中3d生物打印技术为保证打印细胞的活性，对打印时间存在相应要求。
5.(2)骨移植支架中血管网络是主要局限之一，如何血管化骨支架，保证骨支架体内移植后支架内早期细胞的存活。
6.(3)骨支架体内移植后，宿主血管入侵的速度较慢，很容易导致移植物中心区域的细胞坏死。
7.解决以上问题及缺陷的难度为：
8.1.3d生物打印技术目前的处于发展的瓶颈期，如何兼顾支架力学性与生物性进行打印是一个挑战。
9.2.血管化问题属于3d细胞培养、3d生物打印、类器官等领域共同的难题。
10.3.如何解决大尺寸的骨再生问题是骨科领域棘手而重要的领域。
11.解决以上问题及缺陷的意义为：
12.1.打印的骨单元支架可以叠加连通，解决了构建大尺寸骨支架问题。
13.2.多相复合打印兼顾了支架力学强度、生物性、生物降解、骨生成等。
14.3.由血管相与微血管相构成的预血管系统有利于血管生成、有利于血管发芽，生成可贯通的血管网络。
15.4.由血管相与微血管相构成的预血管系统有利于骨单元支架内细胞营养物质的交换，有利于体内移植后血管长入。


技术实现要素：

16.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高度血管化的多相复合骨单元支架的3d生物打印方法。
17.本发明是这样实现的，一种高度血管化的多相复合骨单元支架的3d生物打印方法，所述高度血管化的多相复合骨单元支架的3d生物打印方法包括以下步骤：
18.步骤一，进行3d建模与路径规划；
19.步骤二，针对各相选择生物墨水；
20.步骤三，利用多喷头3d生物打印机调整打印参数并进行无菌打印。
21.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的高度血管化的多相复合骨单元支架的3d生物打印方法打印得到的高度血管化的多相复合骨单元支架，所述高度血管化的多相复合骨单元支架，包括力学相、骨生物相与血管相和微血管相构成的预血管系统。
22.进一步，所述力学相为力学相选用的生物墨水为有机-无机复合材料，利用多喷头中高温喷头进行无菌打印，打印时控温温度、打印参数等根据高分子-无机材料种类而定；其中，所述高分子-无机复合材料为一类材料，其中高分子材料需满足fda可植入标准，无机材料需具骨诱导作用，pcl nhap(聚已内酯 纳米级羟基磷灰石)，pcl tcp(聚已内酯 磷酸三钙)等，且高分子分子量可调节，高分子材料与无机材料比例可调节，一般无机材料含量不超过30％。
23.进一步，所述骨生物相为以光敏水凝胶负载具有成骨能力的细胞作为生物墨水，利用控温光固化喷头进行无菌打印，打印时控温温度、光交联强度、打印参数等根据光敏水凝胶种类而定；其中所述光敏水凝胶为一类材料，满足生物相容性，无生物毒性，不限于单纯光敏水凝胶，可选用或结合离子交联、温敏性质、改性、添加基团等具备负载细胞能力、满足3d生物打印的墨水材料，具备成骨能力的细胞主要包括骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞等，不限于gelma bmsc(甲基丙烯酰化明胶 骨髓间充质干细胞)，gelma 海藻酸钠 bmsc(甲基丙烯酰化明胶添加海藻酸钠 骨髓间充质干细胞)等。
24.进一步，所述血管相和微血管相构成的预血管系统，具备管络系统且相互连接互通，预血管系统内有血管构建相关的内皮细胞，具备调控血管生成的生物因子缓释系统。
25.进一步，所述微血管相管络系统由同轴喷头无菌打印完成，打印时控温温度、光交联强度、打印参数等根据光敏水凝胶种类而定；其中外层以光敏水凝胶负载具有血管内皮细胞和调控血管相关的细胞因子作为生物墨水，内层以牺牲材料作为生物墨水支撑打印。光敏水凝胶同上所述，不限于pegda(聚乙二醇二丙烯酸酯)、gelma(甲基丙烯酰化明胶)等，血管内皮细胞不限于动脉血管内皮细胞、内皮祖细胞等，调控血管相关的细胞因子不限于vegf等，牺牲材料不限于pluronic f127等。
26.进一步，所述血管相为水凝胶负载具有血管内皮细胞和调控血管相关的细胞因子，利用控温光固化喷头/低温喷头进行无菌打印，打印时控温温度、光交联强度、打印参数等根据光敏水凝胶种类而定；其中，所述水凝胶、血管内皮细胞、调控血管相关的细胞因子要求如上所述。
27.本发明的另一目的在于提供一种所述的高度血管化的多相复合骨单元支架在骨移植中的应用。
28.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明是无生物毒性、可完全降解的骨单元，更重要的是骨单元大小可调节，且可叠加互通，解决了目前3d细胞打印难以构建大规模骨移植支架的问题。骨单元支架中力学相提供一定的力学强度，维持支架稳定性，配合外固定支架能进行骨缺损填充，高分子材料能在体内逐步降解，其中
的无机材料持续的发挥骨诱导作用；骨相中含有成骨愈合中至关重要的骨间充质干细胞，具备成骨分化能力；血管相与微血管相构成的预血管系统使骨单元结构内部具有相连互通的分级血管网络，且富含成血管诱导物质，有利于体内移植后血管长入支架与微血管诱导，有利于骨单元支架体内移植后早期细胞存活，且血管化的程度对成骨愈合至关重要。本发明提供的高度血管化的多相复合骨单元支架的3d生物打印方法得到的多相复合支架具有一定的力学强度，较强的骨诱导、骨生成能力；高度血管化的多相复合骨单元结构内部具有相连互通的分级血管网络，有利于体内移植早期细胞存活，有利于体内移植后血管长入、生成，有利于成骨愈合。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1是本发明实施例提供的高度血管化的多相复合骨单元支架的3d生物打印方法流程图。
31.图2是本发明实施例提供的3d建模与路径规划示意图。
32.图3是本发明实施例提供的高度血管化的多相复合骨单元支架的平面示意简图。
具体实施方式
33.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
34.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高度血管化的多相复合骨单元支架的3d生物打印方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
35.如图1所示，本发明实施例提供的高度血管化的多相复合骨单元支架的3d生物打印方法包括以下步骤：
36.s101：进行3d建模与路径规划；
37.s102：针对各相选择生物墨水；
38.s103：利用多喷头3d生物打印机调整打印参数并进行无菌打印。
39.本发明实施例提供的高度血管化的多相复合骨单元支架的3d生物打印方法具体包括以下步骤：
40.步骤一，进行3d建模与路径规划；
41.a)利用3d建模软件solidwarks、mimics等进行骨单元建模；
42.b)骨单元建模由2个子模型组成，即建立骨单元支架主体与血管相子模型并组合；如图2(a)的(a1)骨单元支架建模，由2个子模型组合；(a2)3d建模血管相子模型；(a3)3d建模骨单元支架主体子模型；
43.c)将stl格式的2个子模型导入多喷头打印机打印软件内并进行分割，由3个骨单元支架主体子模型(即力学相、骨生物相、微血管相，此时3个模型处于重叠状态)与1个血管
相子模型(即血管相)组合；
44.d)在进行路径规划时，骨单元主体支架模型中，打印间距设置为3n，骨生物相模型处于中间无平移偏置打印，力学相模型y轴向上平移n进行打印，微血管相y轴向下平移n进行打印；
45.e)路径方式采用线性打印，2层，90
°
旋转；
46.步骤二，针对各相选择生物墨水；
47.a)打印生物平台进行紫外灭菌30min以上，无菌培养皿至于打印平台固定，并进行平台与喷头校准；
48.b)按确定各相生物墨水并转移至无菌墨水筒内；
49.c)将无菌喷嘴与装有无菌生物墨水的墨水筒进行连接，并装配入上述相应的喷头；
50.步骤三，利用多喷头3d生物打印机调整打印参数并进行无菌打印；
51.a)打印参数包括喷嘴直径、控温温度、光交联强度、打印动力、打印速度、断丝抬高、提前打印等，根据各相所选生物墨水进行调节；
52.b)开始打印，全程保持无菌操作；
53.c)加入培养基适当条件培养。
54.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
55.本发明实施例提供的高度血管化的多相复合骨单元支架的3d生物打印方法具体包括以下步骤：
56.步骤一，进行3d建模与路径规划；
57.a)利用3d建模软件solidwarks、mimics等进行骨单元建模；
58.b)骨单元建模由2个子模型组成，即建立骨单元支架主体与血管相子模型并组合；
59.c)将stl格式的2个子模型导入多喷头打印机打印软件内并进行分割，由3个骨单元支架主体子模型(即力学相、骨生物相、微血管相，此时3个模型处于重叠状态)与1个血管相子模型(即血管相)组合；
60.d)在进行路径规划时，骨单元主体支架模型中，打印间距设置为1.8mm，骨生物相模型处于中间无平移偏置打印，力学相模型y轴向上平移0.6mm进行打印，微血管相y轴向下平移0.6mm进行打印；
61.e)路径方式采用线性打印，2层，90
°
旋转；
62.步骤二，针对各相选择生物墨水；
63.f)打印生物平台进行紫外灭菌30min以上，无菌培养皿至于打印平台固定，并进行平台与喷头校准；
64.g)按上述权利2-7确定各相生物墨水并转移至无菌墨水筒内；
65.力学相：plga-nhap(plga分子量8w，nhap含量15％)高温喷头
66.骨生物相：gelma-mscs控温光固化喷头
67.微血管相：外层pegda-vec-vegf
68.内层f127同轴喷头
69.血管相：pegda-vec控温光固化喷头
70.h)将无菌喷嘴与装有无菌生物墨水的墨水筒进行连接，并装配入上述喷头；
71.步骤三，利用多喷头3d生物打印机调整打印参数并进行无菌打印；
72.i)打印参数包括喷嘴直径(0.16-0.18mm)、控温温度高温喷头80
°
、平台、同轴、控温光固化常温、打印动力(0.3-0.5mpa)、光交联强度(405nm，功率30mw/cm2)、打印速度(6-10mm/s)、断丝抬高(1mm)等，根据各相所选生物墨水实时进行调节；
73.j)开始打印，全程保持无菌操作；
74.k)加入培养基，37
°
，5％二氧化碳条件下培养。
75.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。