具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球及其方法与流程

1.本发明涉及一种生物医用材料，尤其是涉及一种具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球及其制备方法，属于仿生纳米载体的制备技术领域。


背景技术：

2.胰腺癌是发生在胰腺上的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1％-2％，近年来有上升趋势。肿瘤生长的部位以胰头最为多见，大约在60％以上，其次为胰体尾部，全胰腺癌最少，仅占5％左右。男性多于女性，高发年龄为40-65岁。该病恶性程度最高，死亡人数排名恶性肿瘤第四。由于其临床表现隐匿，发病迅速，早期诊断十分困难，绝大多数一经确诊已属晚期。基于纳米体系的化学治疗近些年正在成为纳米药物肿瘤治疗研究领域的热门方向，具有治疗精准性高，对正常组织损伤小，生物安全性高的特点。目前化疗的治疗效果有限，且副作用大。利用高效靶向的纳米载体携带化疗药物分子大量富集到胰腺癌中，是提高治疗效果的策略之一。肿瘤细胞膜仿生纳米微球是一类具有肿瘤细胞膜涂层的仿生纳米微球，肿瘤细胞的膜蛋白为纳米载体提供了伪装和主动靶向肿瘤组织的功能。靶向肽是一种高度亲和特定细胞组分的短肽。通过基因工程化的方式，将靶向肽表达于细胞膜表面从而实现靶向效果叠加，有希望构建一种强化胰腺癌靶向效果的细胞膜仿生纳米微球。


技术实现要素：

3.为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供了一种具有胰腺癌靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球及其制备方法。我们希望能够将胰腺癌细胞膜仿生纳米体系的同源归巢靶向作用和肿瘤相关巨噬细胞靶向肽的主动亲和靶向作用相结合，实现双重靶向增强效果。同时利用对胰腺癌的靶向能力将具有化疗功能的纳米体系高效递送到胰腺癌组织当中，实现对胰腺癌的治疗。
4.本发明方法是通过细胞培养的方式获取基因工程化的细胞膜，再通过脂质体挤出器共挤出的方式将细胞膜包裹于聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球表面，形成具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球。操作简单易行，工艺参数易于控制。细胞膜仿生纳米微球能够大量富集于胰腺癌组织中，减少体内其他组织的非特异性蓄积，实现对胰腺癌组织的特异性靶向作用。。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.一、一种具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球：
7.所述的纳米体系为核壳结构，直径在100nm左右分布，核壳结构的外层壳为基因工程化过表达跨膜蛋白的胰腺癌细胞系kpc的kpc
m2pep
细胞膜；核壳结构的内层核为包载吉西他滨的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球。
8.所述的过表达跨膜蛋白为过表达巨噬细胞靶向肽m2pep，主要由信号肽、靶向肽、增强型绿色荧光蛋白、3xflag标记肽、糖基化磷酯酰肌醇锚定蛋白依次连接构成；所述的信
号肽为il-2跨膜蛋白信号肽，靶向肽为巨噬细胞特异性靶向肽。
9.所述的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,egfp)用于膜蛋白荧光标记，增强型绿色荧光蛋白的氨基酸序列为“mvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk”。
10.3xflag标记肽用于western blot检测目标蛋白。
11.糖基化磷酯酰肌醇锚定蛋白用于稳定膜蛋白结构。
12.所述的巨噬细胞特异性靶向肽的氨基酸序列为yeqdpwgvkwwy，如seq id no.1。
13.所述包载吉西他滨的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球中，聚乳酸：聚羟基乙酸的质量比例为1：1，聚乳酸-羟基乙酸共聚物与吉西他滨的质量比为5：1～1：5。
14.二、基因工程化细胞膜仿生纳米微球的制备方法，所述制备方法具体包括：
15.步骤一：基因工程化表达m2pep靶向肽细胞系kpc
m2pep
的构建：
16.构建过表达巨噬细胞靶向肽m2pep及其对应的慢病毒，通过慢病毒转染过表达巨噬细胞靶向肽m2pep到胰腺癌细胞上，建立在细胞膜上稳定表达过表达巨噬细胞靶向肽m2pep的胰腺癌细胞系；
17.所述步骤一中，将胰腺癌细胞kpc铺到6孔板中，37℃培养箱内培养24小时，加入20微升/孔的过表达巨噬细胞靶向肽m2pep对应的慢病毒，37℃培养24小时得到基因工程化过表达巨噬细胞靶向肽m2pep的胰腺癌细胞系kpc
m2pep
。
18.步骤二：kpc
m2pep
细胞膜分离和纯化：
19.收集细胞膜上稳定表达过表达巨噬细胞靶向肽m2pep的胰腺癌细胞，使用含有质量分数1％的苯甲基磺酰氟的细胞裂解液进行裂解细胞，于液氮和常温下反复冻结融化细胞溶液，使用梯度离心法获得细胞膜碎片溶液；
20.所述步骤二中，用细胞刮子轻柔刮下细胞，1000转/分钟离心5分钟收集细胞，随后加入1毫升含有质量分数1％的苯甲基磺酰氟的细胞裂解液，依次放在液氮和常温下反复冻结融化直到细胞破裂；随后在4℃和700g条件下离心10分钟，收集上清的溶液，最后14000g离心30分钟，收集沉淀为kpc
m2pep
细胞膜碎片。
21.步骤三：包载吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球制备：
22.步骤四：基因工程化细胞膜仿生纳米微球制备：
23.按照质量比1：2混合细胞膜碎片溶液和含有吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球，超声处理后使用脂质体挤出器挤过200nm的聚碳酸酯多孔膜，使用脂质体挤出器处理重复多次，获得大小分布均一的基因工程化细胞膜仿生纳米微球。
24.所述步骤三具体为，使用超声仪器，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液逐滴加入吉西他滨的乙醇溶液中超声处理获得混合溶液，将得到的混合溶液使用超滤管离心去除游离的吉西他滨分子，再使用针式滤器过滤除去直径较大的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，得到含有大小分布均一的吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。
25.所述的超声仪器具体为超声细胞破碎仪。
26.所述步骤三具体为，配制2克/升的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的80wt％乙腈溶液和0.75克/升的吉西他滨的4wt％乙醇溶液，在20khz频率和40w功率的超声下，将聚乳酸-羟基
乙酸共聚物溶液逐滴加入吉西他滨溶液中，质量混合比例1：1，超声处理10分钟得到混合溶液，将得到的混合溶液使用amicon ultra-4超滤管3000转/分钟离心30分钟，取上层溶液使用0.22微米针式滤器过滤3次，得到平均直径0.22微米的包载吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。
27.所述的步骤四中，使用超声细胞破碎仪在20khz频率和20w功率下，按照质量比1：2超声混合细胞膜碎片溶液和含有吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。
28.本发明以慢病毒转染的方式在胰腺癌kpc表面表达胰腺癌靶向肽，构建胰腺癌靶向肽m2pep过表达的kpc
m2pep
胰腺癌细胞系。使用复乳法将具有吉西他滨装载于聚乳酸-乙醇酸(plga)聚合物中，自组装形成聚乳酸-乙醇酸纳米微球。使用梯度离心法提取kpc
m2pep
胰腺癌细胞系其细胞膜囊泡，包载聚乳酸-乙醇酸纳米微球，得到胰腺癌强化靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球。该纳米微球具有对胰腺癌组织大量精准递送化疗药吉西他滨的优势。
29.本发明具有的有益效果体现在：
30.本发明细胞膜仿生纳米微球能够大量富集胰腺癌组织中，减少体内其他组织的非特异性蓄积，实现对胰腺癌组织的特异性靶向作用。
附图说明
31.图1是本发明的结构示意图。
32.图2是本发明的透射电镜和粒径图。
33.图3是本发明的体外靶向图。
34.图4是本发明的体外靶向图。
具体实施方式
35.下面结合实施例及其附图进一步叙述本发明。
36.实施例1：
37.步骤一：基因工程化表达m2pep靶向肽细胞系kpc
m2pep
的构建
38.将胰腺癌细胞系kpc按照1x105/孔的密度铺到6孔板中，37℃培养箱内常规培养24小时。用慢病毒包装后的m2pep靶向肽过表达病毒转染kpc细胞，每孔加入20微升慢病毒，37℃培养24小时得到表达m2pep靶向肽的kpc
m2pep
细胞系。
39.步骤二：kpc
m2pep
细胞膜分离和纯化
40.使用直径10cm的培养皿培养kpc
m2pep
细胞，待细胞铺满80％的培养皿，去除培养基，用磷酸盐缓冲盐溶液洗一遍，用细胞刮子轻柔刮下细胞，转移细胞到15毫升离心管中。1000转/分钟离心5分钟收集细胞，吸去上层培养基后用磷酸盐缓冲盐溶液轻轻重悬细胞，取少量细胞用于计数，剩余细胞600g离心5分钟，去掉上清。在离心管中加入1毫升含有1％苯甲基磺酰氟的细胞裂解液，用移液枪吹打充分悬浮细胞，冰浴放置15分钟使细胞溶胀。随后将离心管依次放在液氮和常温下反复冻融，直到细胞破碎。随后在4℃和700g条件下离心10分钟，收集上清的溶液，最后14000g离心30分钟，收集沉淀为细胞膜碎片。
41.步骤三：包载吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球制备。
42.称取2毫克聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于1毫升80％乙腈溶液中，再称取0.75毫
克的吉西他滨，溶解于1毫升的4％乙醇溶液中。使用超声细胞破碎仪，在20khz频率和40w功率下，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液逐滴加入吉西他滨溶液中，得到2毫升混合溶液，超声处理10分钟。得到的混合溶液使用amicon ultra-4超滤管3000转/分钟离心30分钟。取上层溶液使用0.22微米针式滤器过滤3次，得到平均直径0.22微米的包载吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。
43.步骤四：基因工程化细胞膜仿生纳米微球制备。
44.取吉西他滨质量为0.2毫克的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液与0.1毫克的细胞膜溶液混合并定容至1毫升。使用超声细胞破碎仪，在20khz频率和20w功率下超声5分钟充分混合。混合后的溶液使用avanti脂质体挤出器挤过200纳米的聚碳酸酯多孔膜，来回重复11次，确保细胞膜能充分包被在聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球表面，形成直径约200纳米的基因工程化细胞膜仿生纳米微球。
45.使用透射电子显微镜表征基因工程化细胞膜仿生纳米微球的形貌。吸取10μl的纳米微球溶液，轻柔滴加在透射电子显微镜碳支持膜铜网上，使用红外灯烘干铜网上的水分，滴加5μl的2％醋酸双氧铀溶液进行铜网负染色。再次红外灯烘干后将铜网放入透射电子显微镜进样孔，进行拍照，得到纳米体系的形貌如图2所示。结果表明，基因工程化细胞膜仿生纳米微球为核壳结构，直径在100纳米左右分布，细胞膜涂层厚度约7纳米。细胞膜囊泡位于纳米微球表面，纳米微球核心为包载吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
46.使用胰腺癌细胞系kpc进行细胞吞噬能力的流式细胞术检测。按照1
×
104个/孔将细胞种于96孔板中，加入含有浓度为20微摩尔的基因工程化细胞膜仿生纳米微球200微升，培养3小时后用流式细胞仪检测平均荧光强度，如图3和图4所示。结果表明，基因工程化细胞膜仿生纳米微球的平均荧光强度分别为58586，分别是普通细胞膜仿生纳米微球组和聚合物纳米微球平均荧光强度值的2.26倍和3.95倍，证明基因工程化细胞膜仿生纳米微球具有高效体外靶向的效果。
47.由此可见，本发明实例得到的基因工程化细胞膜仿生纳米微球具有对胰腺癌组织的特异性靶向作用治疗效果。
48.以上所述仅为本发明的实例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
49.本发明涉及的序列如下：
50.seq id no.1：
51.名称：巨噬细胞特异性靶向肽的氨基酸序列来源：人工序列(artificial sequence)yeqdpwgvkwwy。