具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球及其方法与流程

技术特征：
1.一种具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球，其特征在于：所述的纳米体系为核壳结构，核壳结构的外层壳为基因工程化过表达跨膜蛋白的胰腺癌细胞的细胞膜；核壳结构的内层核为包载吉西他滨的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球。2.根据权利要求1所述的一种具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球，其特征在于：所述的过表达跨膜蛋白为过表达巨噬细胞靶向肽m2pep，主要由信号肽、靶向肽、增强型绿色荧光蛋白、3xflag标记肽、糖基化磷酯酰肌醇锚定蛋白依次连接构成；所述的信号肽为il-2跨膜蛋白信号肽，靶向肽为巨噬细胞特异性靶向肽。3.根据权利要求1所述的一种具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球，其特征在于：所述的巨噬细胞特异性靶向肽的氨基酸序列为yeqdpwgvkwwy。4.根据权利要求1所述的一种具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球，其特征在于：所述包载吉西他滨的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球中，聚乳酸：聚羟基乙酸的质量比例为1：1，聚乳酸-羟基乙酸共聚物与吉西他滨的质量比为5：1～1：5。5.根据权利要求1～4任一所述基因工程化细胞膜仿生纳米微球的制备方法，其特征在于：所述制备方法具体包括：步骤一：基因工程化表达m2pep靶向肽细胞系kpc
m2pep
的构建：构建过表达巨噬细胞靶向肽m2pep及其对应的慢病毒，通过慢病毒转染过表达巨噬细胞靶向肽m2pep到胰腺癌细胞上，建立在细胞膜上稳定表达过表达巨噬细胞靶向肽m2pep的胰腺癌细胞系；步骤二：kpc
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细胞膜分离和纯化：收集细胞膜上稳定表达过表达巨噬细胞靶向肽m2pep的胰腺癌细胞，使用含有苯甲基磺酰氟的细胞裂解液进行裂解细胞，于液氮和常温下反复冻结融化细胞溶液，使用梯度离心法获得细胞膜碎片溶液；步骤三：包载吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球制备：步骤四：基因工程化细胞膜仿生纳米微球制备：混合细胞膜碎片溶液和含有吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球，超声处理后使用脂质体挤出器挤过聚碳酸酯多孔膜，使用脂质体挤出器处理重复多次，获得大小分布均一的基因工程化细胞膜仿生纳米微球。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，将胰腺癌细胞kpc铺到6孔板中，37℃培养箱内培养24小时，加入20微升/孔的过表达巨噬细胞靶向肽m2pep对应的慢病毒，37℃培养24小时得到基因工程化过表达巨噬细胞靶向肽m2pep的胰腺癌细胞系kpc
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。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，用细胞刮子轻柔刮下细胞，1000转/分钟离心5分钟收集细胞，随后加入1毫升含有质量分数1％的苯甲基磺酰氟的细胞裂解液，依次放在液氮和常温下反复冻结融化直到细胞破裂；随后在4℃和700g条件下离心10分钟，收集上清的溶液，最后14000g离心30分钟，收集沉淀为kpc
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细胞膜碎片。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤三具体为，使用超声仪器，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液逐滴加入吉西他滨的乙醇溶液中超声处理获得混合溶液，将得到的混合溶液使用超滤管离心去除游离
的吉西他滨分子，再使用针式滤器过滤除去直径较大的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，得到含有大小分布均一的吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤三具体为，配制2克/升的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的80wt％乙腈溶液和0.75克/升的吉西他滨的4wt％乙醇溶液，在20khz频率和40w功率的超声下，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液逐滴加入吉西他滨溶液中，质量混合比例1：1，超声处理10分钟得到混合溶液，将得到的混合溶液使用amicon ultra-4超滤管3000转/分钟离心30分钟，取上层溶液使用0.22微米针式滤器过滤3次，得到平均直径0.22微米的包载吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤四中，使用超声细胞破碎仪在20khz频率和20w功率下，按照质量比1：2超声混合细胞膜碎片溶液和含有吉西他滨分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。

技术总结
本发明公开了一种具有胰腺癌微环境靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球及其方法。以慢病毒转染的方式在胰腺癌细胞KPC表面表达肿瘤相关巨噬细胞靶向肽，构建巨噬细胞靶向肽M2pep过表达的胰腺癌细胞系；使用复乳法将胰腺癌一线化疗药物吉西他滨装载于聚乳酸-乙醇酸聚合物中，自组装形成聚乳酸-乙醇酸纳米微球；使用梯度离心法提取胰腺癌细胞系其细胞膜囊泡，包载聚乳酸-乙醇酸纳米微球，得到胰腺癌微环境强化靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球。本发明细胞膜仿生纳米微球能够大量富集胰腺癌组织中，减少体内其他组织的非特异性蓄积，实现对胰腺癌组织的特异性靶向作用，具有对胰腺癌组织大量精准递送化疗药吉西他滨的优势。优势。优势。


技术研发人员：梁廷波 胡奇达 王蒙 赵昕昱 黄珺明 邵世怡
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2021.11.18
技术公布日：2022/3/7