一种复合富血小板血浆和脱钙骨基质的骨修复材料及其制备方法与流程

1.本发明属于医疗材料领域，涉及一种骨组织生物材料，具体地，涉及一种复合富血小板血浆和脱钙骨基质的骨修复材料及其制备方法。


背景技术：

2.由于外伤、感染、肿瘤造成的骨骼结构完整性的破坏所形成的骨缺损，可以引起严重的患者肢体畸形和功能障碍，降低生活质量。治疗根本即填充骨缺损区域，诱导成骨，达到骨修复状态。目前，因自体骨提供骨量有限，且需增加手术创伤等缺点，骨修复材料的需要日益增加。骨修复材料要求其具有良好生物相容性、生物降解性、骨传导性和骨诱导性。过去半个世纪，人工骨材料一直是研究热点，其中，骨组织工程是最为理想的手段：理想的支架材料，适当的激活因子和种子细胞为骨缺损修复提供了新的希望。
3.脱钙骨基质(demineralized bone matrix，dbm)半个世纪以前就被证实具有异体成骨和诱导成骨的能力。脱钙骨基质中含有的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，bmp)是一种具有诱导间充质干细胞诱导分化成骨和软骨的成分。dbm主要通过对供体骨进行剔除软组织及骨膜后，随后依次脱水、脱脂、脱钙、去胶原成分、冷干燥及塑性处理获得，根据需要，制成不同体积形状(块状、粉末状)的成品。目前已在骨科、牙科等领域取得广泛的运用。但是由于其生产流程和物理性状因素，这种具有诱导活性的支架聚合能力及可塑性较差。
4.富血小板血浆(plate rich plasma，prp)作为自体血经二次离心后获得的高浓度血小板浓缩液，来源丰富、取材方便。已在整形美容、关节运动损伤、骨与软骨损伤中运用。一方面，富血小板血浆中含有大量的纤维蛋白及凝结因子，能够被ca2

/凝血酶激活，形成一定形态的纤维状凝胶；另一方面，富血小板血浆中含有大量的生长因子，如血小板衍生生长因子(pdgf)、转化生长因子-β(tgf-β)、类胰岛素生长因子(igf)、表皮生长因子(egf)、血管内皮生长因子(vegf)等，能够促进间充质干细胞的增殖、分化，这些因子单独或协同作用，促进组织修复。
5.本发明将脱钙骨基质和富血小板血浆结合，能够尽最大可能达到骨组织工程中要求的支架及因子要求：1)将粉末状的脱钙骨基质和富血小板血浆按一定比例混合后成胶，形成的凝胶因粉末的存在，其生物强度较单纯的凝胶大，不易被冲散；凝胶可因模具形状不同，制成需求的大小形态，并且凝胶本身具有较强的可塑性；2)通常，脱钙骨基质在制备消毒、去除免疫原性过程中，骨形态发生蛋白活性及含量会受到影响，富血小板血浆丰富的细胞因子恰好能够乃至增强成骨效能。目前市面上透明质酸、壳聚糖等作为载体承载脱钙骨基质的骨修复材料，只是单纯的载体作用，无生活活性，并且来源非自体，生物安全性不如富血小板血浆。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种具有高生物活性及生物安全性的骨修复材料及其制备方法。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种骨组织修复材料，为含富血小板血浆和脱钙骨基质的凝胶。其中，富血小板血浆为自体富血小板血浆。所述的凝胶的制备原理为：富血小板血浆中含有大量的纤维蛋白及凝结因子，能够被ca2

/凝血酶激活，形成凝胶。
9.所述的骨组织修复材料的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)将脱钙骨基质粉末加入获取的富血小板血浆中，充分混合搅拌，制成混悬液。
11.(2)将含ca
2
和凝血酶的溶液与步骤(1)中的混悬液按一定体积比混匀，静置，形成凝胶，即得到所述的骨组织修复材料。
12.优选的，步骤(1)中，所述的富血小板血浆的制备包括下述步骤：抽取新鲜血液，加入抗凝剂，进行二次离心，收集富血小板血浆。更为优选的，富血小板血浆的制备包括下述步骤：抽取10ml新鲜血液后，按1：10体积加入1ml 10％枸橼酸二钠抗凝剂，在20℃～24℃环境下进行二次离心，收集富血小板血浆。其中，二次离心具体为：第一次离心速度为2400r/min，离心时间10分钟，出现明显分层后，抽取上层黄色血浆层及中间血小板层，置入另一离心管；以3600r/min、离心时间15分钟的条件进行第二次离心，将上层贫血小板血浆层抽出去掉后，得到富血小板血浆。
13.优选的，步骤(1)中，所述的混悬液中脱钙骨基质的浓度为20～100mg/ml，更优选的为50mg/ml。
14.优选的，步骤(2)中，所述的含ca
2
和凝血酶的溶液为含1000u/ml凝血酶的2～20％cacl2溶液。
15.优选的，步骤(2)中，含ca
2
和凝血酶的溶液与步骤(1)中的混悬液的体积比为1:5～1:20，更优选的为1:10。
16.优选的，步骤(2)中，所述的静置的时间为2～5分钟。
17.优选的，步骤(2)中，可将含ca
2
和凝血酶的溶液与步骤(1)中的混悬液置于模具中，按照模具形状成型。
18.优选的，所述的制备方法各步骤要求环境温度不低于20℃，最佳为20℃～24℃。
19.本发明的有益效果：本发明利用自体富血小板血浆复合脱钙骨基质形成的人工骨材料，两者相辅相成，共同促进骨修复。脱钙骨基质具有天然骨性结构，利于自体干细胞增殖、分化，新生毛细血管向内长入，促使新骨在缺损部位沉积，发挥骨传导作用。富血小板血浆作为粉末状脱钙骨基质的载体，其自身含有大量生长因子，并将其缓释，与脱钙骨基质中的骨形态发生蛋白可协同发挥骨诱导作用。脱钙骨基质已在临床中广泛运用，具有良好降解性能，生物性能，富血小板血浆来自自体，亦能被自体很好相容与吸收。形成的凝胶可塑性强，可通过透视定位微创置入，也可通过开放手术植入，操作方便。
附图说明
20.图1是富血小板血浆复合脱钙骨基质形成的凝胶。
21.图2是试验例中各组骨修复x线结果。
22.图3是试验例中各组骨修复结果大体观。
23.图4是试验例中各组骨修复完成时micro-ct结果。
24.图5是试验例中各组骨修复的成骨分析。
25.图6是试验例中填充复合prp和dbm凝胶的e组成骨修复的he染色图。图中，na：桡骨正常组织区域；ulna：正常尺骨；mc：桡骨骨髓腔。
具体实施方式
26.为更好理解本发明，说明本发明的技术方案及优点，下面结合实施例阐明本发明内容，但本发明内容并不仅仅局限于下面实施例。
27.各实施例中所使用的脱钙骨基质均由武汉联结生物材料有限公司提供，制备方法如下：取新西兰兔四肢长骨骨干，去掉干骺端及骨膜，取皮质骨，在冰上研磨粉碎，不锈钢筛分筛，得到直径＜2000μm兔骨粉，对骨粉进行脱脂、脱钙、清洗、灭菌处理，即得。
28.实施例：复合富血小板血浆和脱钙骨基质的骨修复材料的制备
29.在离心管中加入1ml 10％枸橼酸二钠抗凝剂，充分润湿管壁，然后用采血针抽取10ml兔新鲜血液，加入预先混有枸橼酸二钠抗凝剂的离心管中，充分混匀。
30.将抗凝血进行二次离心，第一次离心速度为2400r/min，离心时间10分钟，出现明显分层后，抽取上层黄色血浆层及中间血小板层，置入另一离心管。以3600r/min、离心时间15分钟的条件进行第二次离心，将上层贫血小板血浆层抽出去掉后，得到富血小板血浆。
31.根据得到的富血小板血浆的体积，将适量脱钙骨基质粉末加入获取的富血小板血浆中，充分混合搅拌，制成脱钙骨基质浓度为50mg/ml的混悬液，在20℃～24℃环境下保存。
32.将混悬液置于模具中，用双蒸水制备浓度为10％的cacl2溶液，并且添加1000u/ml的凝血酶，然后按1：10(v/v)比例与混悬液混合，快速搅拌数秒后，静置2～5分钟，形成凝胶(图1)，即得到复合富血小板血浆和脱钙骨基质的骨修复材料，用于下述试验例。
33.同时按照上述方法不加脱钙骨基质粉末，制成富血小板血浆凝胶(prp凝胶)，用于下述试验例。
34.试验例：验证复合富血小板血浆和脱钙骨基质的骨修复材料在新西兰兔骨缺损模型中骨修复效果
35.本研究使用新西兰兔作为动物模型，在兔子前肢桡骨中段制成长2cm的骨缺损。实验空白对照组a组仅施展手术，缺损区不填充材料；b组填充prp凝胶；c组填充dbm(脱钙骨基质粉末)；实验组d组行相同手术造模，骨缺损区域填充复合prp和dbm形成的凝胶；e组填充自体骨(取材为兔子颅骨)。术后定期第6、12周行桡骨x线检查，及第6、12周处死取材后行桡骨micro-ct，进行大体观及组织学评估。
36.术后6周及12周拍摄桡骨正位x线片进行放射学检查，如图2中a至e所示，各组结果如下。对照组a组6周时骨缺损断端仍清晰可见，两端骨萎缩，局部密度增高，未见修复痕迹；12周，a组骨端硬化，髓腔封闭不相通，无明显骨痂生成。单独填充prp凝胶的b组6周时中间缺损区域仍可见，局部可见高密度成骨区域；12周时断端仍清晰，断端部密度稍高。填充dbm的c组6周时缺损大部分区域可见稍高密度影，连接两断端，桡骨近尺骨侧密度增高，但骨质稀疏；12周时缺损区为连续高密度影，骨痂亮增加。填充复合prp和dbm凝胶的d组6周时骨缺损区有连续性骨痂形成；12周时形成均匀一致高密度影，髓腔通畅。e组自体骨移植组6周时
可见新生骨痂填充；12周呈均一高密度影，骨皮质连续，髓腔贯通，塑性好。
37.术后第6、12周将兔子处死以后，获得不同时期各组尺桡骨实物(图3)，行micro-ct检测，判断各组成骨性能。micro-ct检测结果(图4)与x线结果相仿，表明：空白对照组a组骨缺损区无修复进展，断端被质软的纤维组织长入，未见骨痂形成。b组缺损区域长度减少，可见骨质形成，两断端骨痂不连续，中间被纤维组织侵占。c组中ct可见不均匀骨痂形成，局部空洞，髓腔不完全相通，大体观骨质膨胀，局部较薄，硬度较正常皮质小。实验组d组骨皮质连续，髓腔相通，局部塑形已完成，大体观可见骨膜组织。e组可见均一的骨质形成，骨塑型已基本完成，尺桡骨界限清楚。并对第6周/12周各组ct结果行相应成骨分析(图5)，可见a、b组未见明显骨组织生长；单独dbm组初期骨组织生长较慢，12周时初步完成修复；d组和自体骨移植e组在6周及12周时能维持较高的骨组织，并在12周时完成缺损区骨重塑。
38.对填充复合prp和dbm凝胶的实验组d组成骨修复进行he染色，结果见图6。组织学切片观察见d组骨缺损部位与注射型骨修复材料融合良好，缺损区域已有大量新生骨形成，高倍视野下切片可见成骨细胞和骨细胞，并有髓腔形成，之间相通。