一种空载相转化水凝胶微针、中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针及其制备方法和应用与流程

accurate transdermal delivery of insulin[j].advanced fuctional materials,2015,25,4633
–
4641.)制备出了胰岛素相转化水凝胶微针，实验结果表明相转化水凝胶微针的水膨胀但不溶于水的性质确保了胰岛素的高效经皮传递和足够的机械强度在水合状态下从皮肤内完全取出而不沉积多余的物质。
[0007]
基于以上研究，为了减少微针在皮肤内的沉积，增加药物的载药量，增加患者的用药顺应性，选择相转化水凝胶微针作为眼镜蛇神经毒素经皮给药制剂的研究，将为蛋白多肽类及大分子药物经皮递送的研发提供理论依据。


技术实现要素：

[0008]
本发明的技术目的是提供一种空载相转化水凝胶微针、中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针及其制备方法和应用。
[0009]
为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：
[0010]
一种空载相转化水凝胶微针，包括空载针体、黏连层和背衬层，所述黏连层和背衬层依次贴附在空载针体顶部；
[0011]
所述空载针体由聚乙烯醇和葡聚糖混合溶液制得；
[0012]
所述黏连层和背衬层均由聚乙烯醇水溶液制得。
[0013]
进一步地，所述空载针体由质量比浓度为84/16的聚乙烯醇和葡聚糖混合溶液制得；
[0014]
所述黏连层的溶液是质量比浓度为18％的聚乙烯醇水溶液；
[0015]
所述背衬层为由质量比浓度为25％的聚乙烯醇水溶液制备得到的薄层。
[0016]
本发明还提供了一种中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针，包括载药针体、黏连层和背衬层，所述黏连层和背衬层依次贴附在载药针体顶部；
[0017]
所述载药针体由载药溶液制得，所述载药溶液由中华眼镜蛇神经毒素溶液与辅料组成；所述辅料为聚乙烯醇和葡聚糖混合溶液；
[0018]
所述黏连层的溶液是质量比浓度为18％的聚乙烯醇水溶液；
[0019]
所述背衬层为由质量比浓度为25％的聚乙烯醇水溶液制备得到的薄层。
[0020]
进一步地，所述辅料是质量比浓度为84/16的聚乙烯醇和葡聚糖混合溶液；
[0021]
本发明还提供了上述中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针的制备方法，由针体载药溶液、黏连层溶液和背衬层通过离心、反复冷冻
‑
解冻，最后干燥制得。
[0022]
进一步地，所述背衬层通过以下步骤制备：将质量比浓度为25％的聚乙烯醇水溶液平铺于方形玻璃板，然后用另一块相同玻璃板均匀压住，两块玻璃板之间用厚度约为1mm的平垫支撑，并经
‑
20℃下冷冻8h，4℃下解冻4h，冷冻
‑
解冻循环2次，即得背衬层。
[0023]
进一步地，所述中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针的具体制备步骤为：
[0024]
配制针体载药溶液；
[0025]
将针体载药溶液置于微针模具内，并采用离心法将其注入到微针模具的孔内，刮去多余的针体载药溶液，加入黏连层溶液，贴上背衬层，排除气泡和多余黏连层溶液，制得微针贴片；
[0026]
将微针贴片通过冷冻
‑
解冻循环后，从微针模具上揭下，最后烘干，得到中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针。
[0027]
进一步地，所述针体载药溶液的配制方法为：
[0028]
将中华眼镜蛇神经毒素粉末与超纯水混合，制得药物原液；
[0029]
根据所需微针载药浓度，取适量药物原液加入质量比浓度为84/16的聚乙烯醇和葡聚糖混合溶液中，混合搅拌均匀，得无相分离且均一稳定的针体载药溶液。
[0030]
进一步地，所述微针贴片的冷冻
‑
解冻条件为：在
‑
20℃下冷冻8h，4℃下解冻4h。
[0031]
本发明还提供了上述空载相转化水凝胶微针或中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针或中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针的制备方法在制备经皮给药镇痛制剂中的应用。
[0032]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0033]
(1)本发明提供了一种空载相转化水凝胶微针、中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针(nant
‑
pth
‑
mns)及其制备方法和应用，空载相转化水凝胶微针以聚乙烯醇/葡聚糖混合溶液(84/16，w/w)作为空载相转化水凝胶微针的针体原料，中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针以载药溶液(中华眼镜蛇神经毒素药物原液和质量比浓度为84/16的聚乙烯醇/葡聚糖混合溶液)为针体原料，通过离心法制得微针针体部分，并进一步以聚乙烯醇水溶液(18％，w/w)为黏连层溶液，聚乙烯醇水溶液(25％，w/w)为背衬层，通过反复冷冻
‑
解冻，最后干燥，制得空载或载药(中华眼镜蛇神经毒素)相转化水凝胶微针，其中在经过反复冷冻
‑
解冻循环过程后，物理交联形成微晶域，使微针可以保持韧性水化状态，不再溶于体液，从而能够留在皮肤上保证微针内药物的持续释放，随后可以完全从皮肤内移除而不沉积多余的物质；
[0034]
(2)采用本发明提供的制备方法制得的中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针针型垂直完整，排列整齐，具有良好的机械性能，其体外溶胀率可达到210％以上，为药物的输送提供了足够的空间通道；此外，该微针的载药量为23.4％，能够达到镇痛的有效治疗量；该微针体外释放的累积释放率接近85％；该微针体外透皮的累积透皮率可达80％；nant
‑
pth
‑
mns的稳定性良好且更适合储存在低温环境中；且微针应用后移除不会使皮肤发生过敏等不良反应，无副作用或副作用小；
[0035]
(3)采用本发明所保护的制备方法制备的中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针，其负载的中华眼镜蛇神经毒素在微针中的含量对其释放趋势和累积释放率的影响不大，后期可以根据实际动物给药中神经毒素的剂量需求来调整微针中神经毒素的含量，产品灵活性高；
[0036]
(4)本发明制备的中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针可以明显增加神经毒素的皮肤渗透率，实现缓释和高效地经皮给药；
[0037]
(5)本发明通过中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针的镇痛作用研究，发现高剂量中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针可显著降低小鼠的扭体次数和提高扭体抑制率，并可明显延长小鼠的痛阈值，镇痛效果良好。
附图说明
[0038]
图1为本发明实施例1中用不同赋形剂制备的pth
‑
mns的形态图，其中a1
‑
a2为pva/ha构成针，b1
‑
b2为pva/cmc构成针，c1
‑
c2为pva/dex构成针；
[0039]
图2为本发明实施例1中不同pva/dex含量制备的pth
‑
mns鼠皮穿刺结果，其中a为
pva/dex 90/10(w/w)，b为pva/dex 88/12(w/w)，c为pva/dex 84/16(w/w)，d为pva/dex 82/18(w/w)；
[0040]
图3为本发明的神经毒素相转化水凝胶微针的制备流程图；
[0041]
图4为本发明实施例2中nant
‑
pth
‑
mns形貌图，其中4a为微针的光学显微图，4b为微针的扫描电镜图；
[0042]
图5为本发明实施例2中nant
‑
pth
‑
mns的机械性能实验，其中a为大鼠离体皮肤穿刺图，b为活体大鼠穿刺实验，c为大鼠皮肤he染色图；
[0043]
图6为本发明实施例2中nant
‑
pth
‑
mns的溶胀结果，n＝3；
[0044]
图7为本发明实施例2中不同载药量对nant
‑
pth
‑
mns中药物的释放影响，n＝3；
[0045]
图8为本发明实施例2中nant
‑
pth
‑
mns对大鼠皮肤的刺激性检测结果；
[0046]
图9为本发明实施例2中nant
‑
pth
‑
mns累积渗透曲线，n＝6。
具体实施方式
[0047]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0048]
实施例1：中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针的最优针体辅料处方筛选
[0049]
微针透皮给药系统在实际应用中，微针的贴片部分要与皮肤紧密贴合，这就要求贴片需要具有一定的柔韧性，而水凝胶微针的针体部分只有刺穿皮肤的角质层才能将药物释放在皮内，从而发挥作用，这也要求微针要具有足够的机械强度，因此需要对构建贴片部分的辅料和针体部分的辅料进行处方筛选。
[0050]
适合制备相转化水凝胶微针最主要的辅料是聚乙烯醇，由于实际应用的局限性，两种或两种以上的高分子材料混合而成的复合材料往往兼具两种高分子材料的性能，比其中任一种高分子的性能优良，且能显示出一种特殊的复合性能。聚乙烯醇具有良好的韧性，一般与具有脆性的高分子材料如多糖合用，但要控制多糖在处方中的比例，否则会破坏水凝胶的网状结构。因此，本发明以聚乙烯醇(pva)、透明质酸(ha)、羧甲基纤维素(cmc)和葡聚糖(dex)为辅料，采用离心法两步法制成相转化水凝胶微针，通过对制备的空白相转化水凝胶微针的针型进行显微观察和机械强度的初步评价，以筛选出最优处方。
[0051]
1.1、原料
[0052]
本实施例所用原料如下所示：
[0053][0054][0055]
以上原料不限于来自上述厂家，也可通过其他厂家或自配置得到。
[0056]
1.2、空白相转化水凝胶微针(pth
‑
mns)的制备
[0057]
微针的制备方法有很多，如激光切割技术、反应离子蚀刻法和微模塑法等。不同类型的微针其制备方法也不一样，而水凝胶微针适合微模塑法。目前微模塑法制备微针有两种方式，即负压法和离心法，本发明采用离心法制作相转化水凝胶微针。
[0058]
1.2.1、pva溶液的配制
[0059]
称取16g的pva置于广口瓶中，并加入84g的超纯水，在搅拌下加热至95℃，保温3
‑
4h使其完全溶解，随后在室温下自然冷却，直至pva溶液没有气泡，溶液澄清透明，即溶胀完全，得浓度为16％(w/w)pva水溶液。
[0060]
1.2.2、pva/ha溶液的配制
[0061]
先吸取一定量上述配制好的pva溶液，再向内加入一定量的ha粉末，搅拌使其均匀混合，配成pva/ha比例分别为98/2，96/4，94/6，92/8，90/10，88/12，86/14，84/16，82/18，80/20(w/w)的混合溶液。
[0062]
1.2.3、pva/cmc溶液的配制
[0063]
先吸取一定量上述配制好的pva溶液，再向内加入一定量的cmc粉末，搅拌使其均匀混合，配成pva/cmc比例分别为98/2，96/4，94/6，92/8，90/10，88/12，86/14，84/16，82/18，80/20(w/w)的混合溶液。
[0064]
1.2.4、pva/dex溶液的配制
[0065]
先吸取一定量上述配制好的pva溶液，再向内加入一定量的dex粉末，搅拌使其均匀混合，配成pva/dex比例分别为98/2，96/4，94/6，92/8，90/10，88/12，86/14，84/16，82/18，80/20(w/w)的混合溶液。
[0066]
1.2.5、黏连层溶液的配制
[0067]
称取18g的pva置于广口瓶中，并加入82g的超纯水，在搅拌下加热至95℃，保温3
‑
4h使其完全溶解，随后在室温下自然冷却，直至pva溶液没有气泡，溶液澄清透明，得浓度为18％(w/w)pva水溶液，即为黏连层溶液。
[0068]
1.2.6、背衬层的制备
[0069]
称取25g的pva置于广口瓶中，并加入75g的超纯水，在搅拌下加热至95℃，保温3
‑
4h使其完全溶解，得浓度为25％(w/w)pva水溶液；取适量溶液平铺于方形玻璃板，然后用另一块相同玻璃板均匀压住(两块玻璃板之间用厚度约为1mm的平垫支撑)，并经
‑
20℃下冷冻8h，4℃下解冻4h，冷冻
‑
解冻循环2次，即制得具有一定韧性和硬度的背衬层。
[0070]
1.2.7、不含药微针的制备
[0071]
取300μl上述1.2.2、1.2.3、1.2.4中配制的不同比例的pva/ha、pva/cmc和pva/dex溶液分别置于微针模具(规格为：针，圆锥体，长800μm，底宽300μm，针间距900μm，15
×
15阵列)内，采用离心法(3000rpm，10min)将混合溶液注入到微针模具的孔内，刮去多余的混合溶液，再加入少量黏连层溶液，贴上背衬层，排除气泡；将制备得到的微针在
‑
20℃下冷冻8h，4℃下解冻4h，如此冷冻
‑
解冻循环2次，将微针从模具上揭下，烘箱25℃干燥48h即可得到空白相转化水凝胶微针(pth
‑
mns)，即空载相转化水凝胶微针，该相转化水凝胶微针不含中华眼镜蛇神经毒素。
[0072]
1.3、空白相转化水凝胶微针的表征
[0073]
1.3.1、不同辅料制备的微针的形貌
[0074]
将步骤1.2制得的pth
‑
mns置于光学显微镜(如sz780连续变倍体视显微镜)下，观
察微针的成型性，如微针有无断裂、弯针等。
[0075]
显微镜观察pva/ha、pva/cmc和pva/dex三种辅料各个不同比例作为微针针体材料制备得到的微针的典型图，如图1所示，图a1、a2为其中pva/ha分别为90/10(w/w)、84/16(w/w)所制备的pth
‑
mns；图b1、b2为其中pva/cmc分别为90/10(w/w)、84/16(w/w)所制备的pth
‑
mns；图c1、c2为其中pva/dex分别为90/10(w/w)、84/16(w/w)所制备的pth
‑
mns；
[0076]
从三种辅料各个不同比例制备出微针的显微观察可以看出，针体材料为pva/ha和pva/cmc不同比例制备的pth
‑
mns的针体不垂直或针尖弯曲。图1中典型的微针显微图直观体现了pva/ha(图a1
‑
a2)和pva/cmc(图b1
‑
b2)所制备的微针由于针型不好，无法进行后续实验；针体材料为pva/dex制备的微针(图c1
‑
c2)，针体垂直完整，矩形排列整齐。
[0077]
1.3.2、不同辅料制备的微针的机械性能
[0078]
根据上述1.3.1不同辅料制备的微针的形貌检测结果，发现由pva和dex两种辅料混合后制备的pth
‑
mns的针型完整、矩阵清晰，故选用pva/dex作为pth
‑
mns的制针材料。将pva/dex不同含量比例的pth
‑
mns进行大鼠离体皮肤穿刺实验，以检测pva/dex不同含量比例的pth
‑
mns机械性能。
[0079]
大鼠离体皮肤穿刺实验：取sd大鼠，以乌来糖麻醉后，断颈处死，用宠物剃毛刀和脱毛膏对大鼠背部进行脱毛处理，取下其背部的皮肤，剔除其皮肤上的肌肉与脂肪；将取下的皮肤用生理盐水清洗，包裹在保鲜膜以及锡箔纸中，于
‑
20℃冰箱保存，备用；取出鼠皮，在生理盐水中解冻30min，随后用滤纸吸干皮肤上的水分，再将鼠皮角质层的一面朝上放置；微针放于鼠皮上，手指按压微针使其穿刺健康无损伤大鼠离体皮肤，停留在皮肤内3min，取出微针，立即用台盼蓝溶液染色，10min后用纸巾清理皮肤上残留的台盼蓝染料，通过观察皮肤上形成的蓝色孔洞，确定微针的机械强度，结果如图2所示。
[0080]
由图2可见，pva/dex不同含量的相转化水凝胶微针在大鼠皮肤上形成不同数量的蓝色孔洞，表明不同含量的pva/dex制成的微针的机械强度也有所不同；其中针体辅料溶液pva/dex的比例含量为84/16(图2c)时，多数蓝色孔洞肉眼清晰，随着pva含量在二者中的比例增加时，机械强度反而下降。
[0081]
综上，本发明通过考察pva与ha、cmc和dex多种辅料以不同比例混匀后制备的pth
‑
mns的外观形态，发现以pva/dex作为针体材料时制备得到的微针针形完整，无缺损；进一步地，在保证微针良好针型的前提下，进行大鼠离体皮肤穿刺实验考察pva/dex不同含量的机械强度，发现pva/dex含量比例为84/16时的机械强度较为良好。因此，确定pva/dex溶液含量比例为84/16作为优选的构建微针针体辅料，进行后续实验。
[0082]
实施例2：中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针的制备与性能验证
[0083]
2.1、nant
‑
pth
‑
mns的制备
[0084]
2.1.1、pva溶液的配制
[0085]
参阅步骤1.2.1所述方法配制浓度为16％(w/w)pva水溶液。
[0086]
2.1.2、pva/dex溶液的配制
[0087]
先吸取一定量上述配制好的pva溶液，再向内加入一定量的dex粉末，搅拌使其均匀混合，配成pva/dex比例为84/16(w/w)的混合溶液。
[0088]
2.1.3、pva/dex针体载药溶液的配制
[0089]
在配制针体载药溶液时，药物的不同加入方式会使药物在混合溶液中的分布状态
也有所不同，实验发现，直接向聚乙烯醇/葡聚糖混合溶液中加入中华眼镜蛇神经毒素粉末，会导致药物在溶液中的分布不均匀，会出现淡黄色结块的现象，可能是因为混合溶液的粘度影响了药物在溶液中的溶解。因此本发明选择先配制中华眼镜蛇神经毒素药物溶液，再向聚乙烯醇/葡聚糖混合溶液中加入含药溶液，具体如下：
[0090]
称取适量nant粉末(中华眼镜蛇神经毒素原料药，纯度＞99％，本实施例选自浙江舟山眼镜蛇)于少量的超纯水中，充分溶解配制成nant药物原液，将适量的含药原液加入到适量已配制好的pva/dex溶液(84/16，w/w)中，搅拌至少2h使药物与辅料溶液充分混匀，制备成无相分离且均一稳定的pva/dex针体载药溶液。
[0091]
2.1.4、黏连层溶液的配制
[0092]
黏连层溶液为浓度为18％(w/w)pva水溶液，采用步骤1.2.5所述方法配制得到。
[0093]
2.1.5、背衬层的制备
[0094]
以浓度为25％(w/w)pva水溶液作背衬层，参阅步骤1.2.6所述方法制得。
[0095]
2.1.6、微针的制备
[0096]
参阅图3，取300μl步骤2.1.2中配制好的pva/dex针体载药溶液置于微针模具(规格：针，圆锥体，长800μm，底宽300μm，针间距900μm，15
×
15阵列)内，采用离心法(3000rpm，10min)将混合溶液注入到微针模具的孔内，刮去多余的混合溶液，加入少量黏连层溶液，贴上背衬层，排除气泡；将制备得到的微针在
‑
20℃下冷冻8h，4℃下解冻4h，冷冻
‑
解冻循环2次，将微针从模具上揭下，烘箱25℃干燥48h即可得到中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针(nant
‑
pth
‑
mns)。
[0097]
2.2、nant
‑
pth
‑
mns的体外分析
[0098]
2.2.1、微针形貌
[0099]
将按照2.1制得的nant
‑
pth
‑
mns置于光学显微镜和扫描电镜下，观察微针的成型性，如微针有无断裂、弯针等。
[0100]
结果发现按照2.1制得的nant
‑
pth
‑
mns上含有225个微针，以15
×
15的阵列分布。微针单个针型为圆锥体，针体高800μm，针体底端直径300μm。在光学显微镜和扫描电镜下观察微针的形态，如图4a和4b所示，可见nant
‑
pth
‑
mns的形貌为圆锥体阵列，针尖锋锐，针体表面光滑，微观形态良好，也可得出药物的加入对微针的针型没有影响。
[0101]
2.2.2、机械性能
[0102]
2.2.2.1、鼠皮穿刺实验
[0103]
取sd大鼠，以乌来糖麻醉后，断颈处死，用宠物剃毛刀和脱毛膏对大鼠背部进行脱毛处理，取下其背部的皮肤，剔除其皮肤上的肌肉与脂肪。将取下的皮肤用生理盐水清洗，包裹在保鲜膜以及锡箔纸中，于
‑
20℃冰箱保存，备用。取出鼠皮，在生理盐水中解冻30min，随后用滤纸吸干皮肤上的水分，再将鼠皮角质层一面朝上放置。nant
‑
pth
‑
mns放于鼠皮上，手指按压nant
‑
pth
‑
mns使其穿刺健康无损伤大鼠离体皮肤，停留在皮肤内3min，取出nant
‑
pth
‑
mns，立即用台盼蓝溶液染色，10min后用纸巾清理皮肤上残留的台盼蓝染料，通过观察皮肤上形成的蓝色孔洞，确定nant
‑
pth
‑
mns的机械强度。
[0104]
结果如图5a所示。按照2.1制得的nant
‑
pth
‑
mns在大鼠皮肤上形成肉眼清晰可见的蓝色孔洞，表明nant
‑
pth
‑
mns可以成功刺穿皮肤，并传递药物。
[0105]
2.2.2.2、鼠皮组织学分析
[0106]
为证实nant
‑
pth
‑
mns在活体大鼠上的穿刺性能，本发明使用乌来糖将sd大鼠麻醉，用宠物剃毛刀和脱毛膏将其背部的毛发剔除，用制备好的nant
‑
pth
‑
mns在大鼠背部皮肤上按压5min后取下微针，肉眼观察微针给药区域，并拍照，结果如图5b所示；随后处死大鼠，立即剥离微针穿刺后的皮肤，将皮肤浸泡在4％多聚甲醛中固定，留待组织学切片。利用冷冻切片机将上述皮肤切成5μm厚度，并经过苏木精和伊红染色(he染色)，然后载入载玻片通过倒置显微镜拍照观察离体皮肤的穿刺情况，进一步说明微针活体皮肤的穿刺效果，结果如图5c所示。
[0107]
由图5b可见，微针在皮肤上形成了清晰可见的微针阵列。
[0108]
由图5c可见，nant
‑
pth
‑
mns在皮肤内形成了类圆锥体针孔形态，表明制备的微针在给予大鼠背部后可以形成肉眼可见的针孔阵列，皮肤组织切片同时也证明微针可以在皮肤表面形成清晰的微针孔径，为药物的经皮递送提供通道。经过肉眼观察皮肤表面和皮肤的组织切片等一系列鉴定，均可证明本发明所制备的nant
‑
pth
‑
mns具有良好的机械性能，能够为后续实验微针中的药物进入皮内发挥作用提供一定的实验和理论基础。
[0109]
2.2.3、体外溶胀实验
[0110]
相转化水凝胶微针释放药物的机制是微针在刺入皮肤内会吸收组织间液，针体会发生肿胀，从而为药物的输送提供微孔道，因此本发明考察了相转化水凝胶微针的溶胀情况。
[0111]
取按照2.1制备的nant
‑
pth
‑
mns，记录初始质量w
l
；用聚四氟乙烯膜和锡箔纸包裹微针，使针体露出；放置在24孔板的孔内，并加入超纯水1ml，将包裹好的微针倒置于孔内，使露出的针体浸没在水中；于1、2、4、8、12、18、24、32、40、50、60、90、120、150、180min时将微针从24孔板内取出，擦去表面多余的水分后称定，将0时的质量记为w0，t时记为w
t
，以(w
t
‑
w0)/w
l
表示微针在t时的溶胀率，上述实验每组样品重复3次。以t为横坐标、溶胀率为纵坐标作图，考察微针溶胀的情况。
[0112]
如图6所示，结果表明，nant
‑
pth
‑
mns在60min时溶胀率达180％，之后溶胀速度逐渐减小，趋于平缓，在180min时溶胀率约210％。溶胀后的微针，由于其针体吸水后发生溶胀，体积增大，微针由溶胀前的玻璃态转为水凝胶态，可为药物提供足够大的输送通道，使其进入皮肤内而被吸收。
[0113]
2.2.4、针体载药量考察
[0114]
取按照2.1制得的nant
‑
pth
‑
mns，置于2ml的pbs(ph7.4)溶液中，使微针完全被浸没，充分溶胀24h，用hplc测微针中全部针体的神经毒素含量。
[0115]
参阅“2.1”项所述方法制备不同药物浓度的nant
‑
pth
‑
mns，通过高效液相色谱法(hplc)检测微针中nant的含量；
[0116]
色谱条件如下：
[0117]
色谱柱：dikma plastil ods柱(4.6mm
×
150mm，5um)
[0118]
流动相a：0.1％tfa水溶液
[0119]
流动相b：0.1％tfa
‑
乙腈溶液
[0120]
波长：277nm
[0121]
流速：1.0ml/min
[0122]
温度：35℃
[0123]
进样量：20ul
[0124]
采用二元高压梯度洗脱，洗脱程序如表1。
[0125]
表1二元高压梯度洗脱时间程序
[0126][0127]
三种不同浓度处方中nant的载药量如表2所示，三种不同药物浓度的载药率相差不大，约为23.4％。
[0128]
表2不同药物浓度的nant
‑
pth
‑
mns中nant的载药量(n＝6)
[0129][0130]
2.2.5、体外释放研究
[0131]
取制备好的nant
‑
pth
‑
mns，用聚四氟乙烯膜和锡箔纸包裹微针，使针体露出；放置在24孔板的孔内，并加入pbs(ph7.4)1.5ml，将包裹好的微针倒置于孔内，使露出的针尖浸没水中；将24孔板置恒温振荡培养箱内，设置温度为37℃、转速为100r/min，进行体外释放试验；分别于0.5、1、2、3、4、5、6、8、10和12h取样进行hplc分析，并绘制微针的体外释放曲线。需要注意，每次取样完成，需将24孔板每个孔内的液体用新的pbs 1.5ml更换，上述实验每组样品重复3次。
[0132]
本发明考察了两种不同药物浓度(处方中的药物浓度分别为1.5mg/ml，100ug/片；处方中的药物浓度3mg/ml，200ug/片)的处方制备出的nant
‑
pth
‑
mns中神经毒素的体外释放情况。如图7所示，结果表明，不同载药量时微针中神经毒素的体外释放趋势基本一致，且在12h时的累积释放率均接近85％，表明神经毒素在微针中的含量对其释放趋势和累积释放率的影响不大，后期可以根据实际动物给药中神经毒素的剂量需求来调整微针中神经毒素的含量。
[0133]
2.2.6、皮肤刺激性
[0134]
大鼠背部皮肤给药30min，移除微针后于0min，10min，1h，2h，8h，12h时间段观察试验部位，并根据大鼠背部皮肤出现红斑或水肿的轻重程度来评价微针对于皮肤的刺激性。
[0135]
给药后大鼠的皮肤情况如图8所示。用力按压大鼠背部皮肤的痕迹在10min内消退
很多，2h后几乎看不见给药时按压的痕迹；随着时间的延长，在给药后8h背部皮肤已经迅速恢复完好，结果表明，微针给药时不会对大鼠的皮肤产生刺激性，因而不会使皮肤出现红肿过敏的现象。
[0136]
2.2.7、体外透皮研究
[0137]
微针给药组：取先前制备好并保存在
‑
20℃的温度下的离体鼠皮，用剪刀剪成适量大小，开始实验前，皮肤在室温下解冻，并稳定在37℃下3小时；将鼠皮固定在渗透扩散装置的扩散室与接收室之间，用拇指将制得的nant
‑
pth
‑
mns置于处理好的离体鼠皮上并施加一定力度的力，3min后用医用胶带固定，处理过程中须保证皮肤的完整性；角质层面向扩散室，真皮层面向接收室；在接收室中加入接收液12ml(pbs，ph7.4)，排出气泡，使液面与皮肤完全接触，磁力搅拌速度设定为600r/min以模拟人体皮肤下的血液和组织液内循环，32
±
0.5℃恒温水浴循环；给药后开始计时，分别于10min，20min，30min，1h，2h，3h，4h，6h，8h，12h取接收液0.5ml，同时补加等体积的新鲜接收液；取得试样经0.45μm滤膜过滤，按“2.2.4”项下色谱条件测定样液中神经毒素的含量，并用spss 23.0数据处理，绘制药物的累积渗透曲线。
[0138]
对照组：选择相同剂量的nant水溶液，其他步骤与微针给药组相同；
[0139]
在体外透皮实验过程中，nant
‑
pth
‑
mns在12h内累积渗透曲线如图9所示。从图中可以看到，前20min内，nant
‑
pth
‑
mns中神经毒素的累积渗透率几乎为零，也许是因为前20min内的神经毒素的渗透量太少，hplc并未检测出，但在30min后可以明显看到有部分神经毒素透过皮肤，在3h时间内，神经毒素的累积渗透率已达到50％，而在6h后已达到将近80％左右。对照组的nant水溶液在12h内只有10％左右的渗透率。微针是通过刺穿皮肤角质层达到促进药物透皮吸收的目的，体外渗透试验结果表明，使用微针可以明显增加神经毒素的皮肤渗透率，也进一步说明通过微针的物理促进渗透的机制，可实现缓释和高效的经皮给药。
[0140]
2.2.8、微针稳定性检测
[0141]
将制备的nant
‑
pth
‑
mns分别在常温、4℃和
‑
20℃条件下分别存放1、2、3个月，然后在不同时间段将微针取出，各自置于1.5ml的pbs(ph7.4)缓冲溶液中，用聚四氟乙烯膜和锡箔纸包裹微针，针体露出，使微针完全被浸没，充分溶胀24h；用hplc测定nant
‑
pth
‑
mns中全部针体的nant含量。
[0142]
本发明制备的nant
‑
pth
‑
mns是在冷冻(
‑
20℃)
‑
解冻(4℃)循环的环境中进行，因此考察微针在不同储存条件下的药物稳定性，结果如表3所示，在同种储存条件下，保存时间越长，nant
‑
pth
‑
mns中神经毒素的含量越低；而在不同条件下储存相同时间，nant
‑
pth
‑
mns在
‑
20℃条件下储存时，微针中的神经毒素含量最高，神经毒素的含量变化程度最小。由此可知，nant
‑
pth
‑
mns的稳定性良好且更适合储存在低温环境中。
[0143]
表3nant
‑
pth
‑
mns在不同条件下的药物含量比(％)
[0144]
[0145][0146]
综上，本发明以pva/dex(84/16，w/w)为辅料制备的nant
‑
pth
‑
mns，针型完整，具有一定的机械性能，同时载药量稳定，能够有效携载nant穿透皮肤，在给药后8h左右，皮肤即逐渐恢复，同时给药后的皮肤并未发生红肿、炎症和其他反应，可以作为经皮给药治疗疼痛方面的给药载体。
[0147]
实施例3：中华眼镜蛇神经毒素相转化水凝胶微针的镇痛性能研究
[0148]
有研究表明中华眼镜蛇神经毒素有良好的镇痛作用，在治疗关节痛和癌痛方面有很好的应用前景。以实施例2制备得到的nant
‑
pth
‑
mns为试验组，观察试验各组小鼠给药后对热刺激的痛阈值和对化学刺激性醋酸引起的疼痛作用情况，以探讨应用nant
‑
pth
‑
mns是否会对小鼠产生良好的镇痛作用，为nant
‑
pth
‑
mns在临床的应用提供参考依据。
[0149]
3.1、动物材料
[0150]
昆明种小鼠雌雄各半，体重18
‑
22g，由安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：scxk(皖)2017
‑
001。实验前12h内，禁食不禁水。
[0151]
3.2、实验方法
[0152]
3.2.1、醋酸扭体实验
[0153]
试验分组：取小鼠48只，雌雄各半，随机分为6组，空白对照组(生理盐水)、哌替啶组(20mg/kg)、pth
‑
mns组、nant
‑
pth
‑
mns高剂量组(120μg/kg)、nant
‑
pth
‑
mns低剂量组(60μg/kg)和nant水溶液组(60μg/kg)；
[0154]
试验操作：实验在25℃的室温环境中进行：哌替啶组和nant水溶液组以0.1ml/10g腹腔注射给药，pth
‑
mns组、nant
‑
pth
‑
mns高、低剂量组均背部给药，空白对照组小鼠腹腔注射与nant水溶液组同体积的生理盐水，各组小鼠均按剂量连续给药3d。各组小鼠于末次给药1h后腹腔注射1％的hac溶液(0.1ml/10g)，记录15min内各组小鼠的扭体次数。
[0155]
按以下公式计算扭体抑制率(％)＝(对照组平均扭体次数
‑
给药组平均扭体次数)/对照组平均扭体次数
×
100％]。
[0156]
使用spss 23.0统计软件，数据结果用表示，多组间比较采用单因素方差分析(one
‑
way anona)，两两组间比较采用snk
‑
q检验，各组数据与对照组数据比较采用dunnett
‑
t检验。p<0.05作为显著性相关水平。
[0157]
小鼠腹腔注射1％的hac溶液后，在15min内均出现扭体反应，而末次给药1h后再次给小鼠注射hac溶液后，各组小鼠出现扭体反应的次数均有所减少，结果如表4所示。
[0158]
与空白对照组相比，哌替啶组、nant
‑
pth
‑
mns高剂量组、nant
‑
pth
‑
mns低剂量组和nant水溶液组均能明显减少小鼠因注射hac溶液而产生的扭体反应次数，且差异具有统计学意义(p<0.05)。与nant水溶液组相比，nant
‑
pth
‑
mns高剂量组减少小鼠扭体次数较多，而nant
‑
pth
‑
mns低剂量组小鼠的扭体次数比nant水溶液组少，说明nant
‑
pth
‑
mns低剂量组没有nant水溶液组的镇痛效果好，差异具有统计学意义(p<0.05)。与哌替啶组比较，nant
‑
pth
‑
mns高剂量组的镇痛效果跟哌替啶无显著性差异；nant
‑
pth
‑
mns低剂量组不如哌替啶镇痛效果好，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0159]
表4神经毒素相转化水凝胶微针对醋酸所致小鼠扭体反应的影响(n＝8)
[0160][0161]
*p<0.05，与正常组比较，
▲
p<0.05，与nant水溶液组比较
[0162]
3.2.2、热板法实验
[0163]
取雌性小鼠若干，正式实验前用热板仪测小鼠的痛阈值，温度设置为55.0
±
0.5℃，记录小鼠开始进入热板仪至出现舔后足所需的时间(s)，测2次取其平均值作为痛阈指标。挑选在15
‑
25s范围内，反应稳定、不跳跃的小鼠供实验用，并以此作为给药前的痛阈值。
[0164]
取合格的雌性小鼠48只，随机分成6组，空白对照组(生理盐水)、哌替啶组(20mg/kg)、pth
‑
mns组、nant
‑
pth
‑
mns高剂量组(120μg/kg)、nant
‑
pth
‑
mns低剂量组(60μg/kg)和nant水溶液组(60μg/kg)。哌替啶组和nant水溶液组以0.1ml/10g腹腔注射给药，pth
‑
mns组、nant
‑
pth
‑
mns高、低剂量组均背部给药，对照组小鼠腹腔注射与nant水溶液组同体积的生理盐水，各组小鼠均按剂量连续给药3d。各组小鼠于末次给药后1.5h后记录小鼠放入热板仪至出现舔后足的反应时间(s)作为痛阈值，计算痛阈延长时间和痛阈提高百分率，比较nant
‑
pth
‑
mns高、低剂量组的镇痛效应。痛阈提高百分率(tb％)＝(给药后痛阈值
‑
给药前痛阈值)/给药前痛阈值
×
100％。
[0165]
结果如表5所示，与空白对照组相比，哌替啶组、nant
‑
pth
‑
mns高剂量组、nant
‑
pth
‑
mns低剂量组和nant水溶液组均能明显延长小鼠对疼痛反应潜伏期的痛阈值，痛阈值差异具有统计学意义(p<0.05)，其中nant
‑
pth
‑
mns高剂量组的痛阈值延长时间较长，且与nant水溶液组相比，其镇痛效果较好(p<0.05)；而nant
‑
pth
‑
mns低剂量组的镇痛效果比nant水溶液组稍差，痛阈值差异具有统计学意义(p<0.05)；与哌替啶组比较，nant
‑
pth
‑
mns高剂量组的镇痛效果与哌替啶组无显著性差异；nant
‑
pth
‑
mns低剂量组不如哌替啶镇痛效果好，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0166]
表5 nant
‑
pth
‑
mns对热刺激所致小鼠疼痛反应的影响(n＝8)
[0167][0168]
*p<0.05，与正常组比较，
▲
p<0.05，与nant水溶液组比较
[0169]
与nant溶液组相比，nant
‑
pth
‑
mns高剂量组具有明显的镇痛作用，而nant
‑
pth
‑
mns低剂量组不如nant水溶液的镇痛效果好。nant
‑
pth
‑
mns在应用时，或许是因为透皮率和释放率而使药物发生损失，使进入体内的药量减少。而nant
‑
pth
‑
mns高剂量组中损失的药物相对来说比nant
‑
pth
‑
mns低剂量组少，这也导致nant
‑
pth
‑
mns高剂量组的镇痛效果比nant水溶液组好，而nant
‑
pth
‑
mns低剂量组的镇痛效果比nant水溶液组稍差。
[0170]
综上，本发明制备的pth
‑
mns和nant
‑
pth
‑
mns的针型完整，矩阵排列整齐，具有良好的机械性能。nant
‑
pth
‑
mns的载药量可以达到有效治疗剂量，体外释放、体外透皮和体内镇痛作用，nant
‑
pth
‑
mns可以通过透皮给药进而发挥良好的镇痛作用，为新型镇痛药治疗剂型的开发和治疗提供新的思路和策略。
[0171]
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。