具有调节免疫、促进肠蠕动和调节肠道菌群作用的石斛复方制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及石斛复方制剂技术领域，具体涉及一种具有调节免疫、促进肠蠕动和调节肠道菌群作用的石斛复方制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)，处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞。免疫力低下的人容易感染，容易患上各种疾病而且反复发作很难治愈，甚至诱发重大疾病。因此，提高免疫力对于预防各类疾病，提高生活质量具有重要意义，而服用具有免疫调节作用的功能性食品或药物来提高免疫力，被认为是最好方法之一。
3.便秘是临床常见的复杂症状，主要是指排便次数减少、粪便量减少、粪便干结、排便费力等。经常便秘会对人体健康造成不良影响，此时肠道中垃圾废物未能及时排泄出来，有可能会影响肠道健康环境。长期便秘的原因多样，其中包括体内有益菌的缺乏引起，会导致肠粘膜受损，肠道环境遭到破坏，肠胃蠕动功能缓慢，肠道干燥，缺水。外在的表现就是宿便不能及时排出体外，大便干燥，小腹突出，胀气，脸色暗黄，口干口臭，若不及时治疗还会引发痔疮。因此，应该通过正确的饮食来调节身体，促进肠道蠕动，调节改善肠道菌群，防止便秘现象明显。
4.近年来，随着科技的发展和国人生活水平的提高，合理使用防病健身的功能性食品己逐渐成为人们的一种自觉要求，这一领域的研究和开发亦越来越受到重视。其中寻找健康有效，无无毒副作用的具有调节免疫、润肠通便功能的功能性食品是当前研究和开发的热点。
5.申请公布号为cn 103719494 b(申请号为201310752822.0)的中国发明专利申请公开了一种牛蒡子通便润肠保健茶及其制备方法，属于含有来源于植物组份的通便润肠保健品领域。该发明提供了一种牛蒡子通便润肠保健茶，所述牛蒡子通便润肠保健茶中各种原料的重量份数为：牛蒡子20～50份，刘寄奴10～20份，生地10～20份，地骨皮10～20份，白芷10～20份，茯苓10～20份，丹参10～20份，党参10～20份，佩兰10～20份，绞股蓝10～20份，桑白皮10～20份，栝楼10～20份，薏仁10～20份，紫苏子10～20份，山楂10～20份，泽泻10～20份，败酱草10～20份。牛蒡子富含油脂，性多滑利。现代药理研究表明，牛蒡主要成分为牛蒡甙和脂肪油，这些成分有通便润肠之功。临床体会，牛蒡子辛苦冷滑，滑肠通下作用较强，从而对便秘患者，能改善微循环，加上一些口感清淡，不影响牛蒡子味道的中药，使人易于接受，能较好的达到通便润肠的功效。
6.申请公布号为cn 109619487 a(申请号为201811272913.3)的中国发明专利申请公开了一种具有润肠通便功能的组合物及其制备方法，涉及健康食品技术领域。本发明公开一种具有润肠通便功能的组合物及其制备方法，所述具有润肠通便功能的组合物的原料按重量份数比计包括4份的含火麻仁油的固体微胶囊粉末、5～20份的低聚木糖、2～10份的
圆苞车前子壳粉、1～5份的魔芋粉和10～30份的乳糖醇。将含火麻仁油的固体微胶囊粉末、低聚木糖、圆苞车前子壳粉、魔芋粉和乳糖醇混合均匀；即得到具有润肠通便功能的组合物。本发明的组合物是由火麻仁固体微胶囊粉末与其它同样具有润肠通便效果的材料按照特定比例进行复配而成，达到了更好的协同增效的效果，避免了使用单一成分长期食用造成的抗性。
7.申请公布号为cn 110269163 a(申请号为201810205567.0)的中国发明专利申请公开了一种润肠通便组合物及其制备方法、应用和润肠通便饮料，主要由以下重量份的原料制备而成：玫瑰30-60份、果蔬0.5-10份、中草药材0.01-16份、低聚果糖30-60份、低聚木糖1-5份、麦芽糊精0.1-2份、低聚异麦芽糖0-1份、聚葡萄糖0-1份、豆肽0-1份、魔芋粉0-0.1份、维生素e 0-0.01份及乳酸钙0-0.1份。上述润肠通便组合物包含多种天然的润肠组分，可以促进肠蠕动，软化粪便、改善肠道微环境，食用适当疗程后，可以达到长效改善便秘的作用，无毒副作用产生。
8.申请公布号为cn 109363187 a(申请号为201811076320.x)的中国发明专利申请公开了一种调节免疫、抗疲劳和润肠通便的组合物及其制备方法。该发明公开了一种调节免疫、抗疲劳和润肠通便的组合物及其制备方法，其包含以下重量份的成分：黑豆蛋白300-800份，大豆蛋白50-250份，豌豆蛋白50-250份，核桃蛋白10-200份，低聚果糖50-250份；制备方法主要采用湿法喷雾造粒工艺，必要时结合干混工艺。本发明所提供的组合物通过各种成分的合理组方和配合共用，通过滋补五脏，补肾益髓，安神益智，调节肠道菌群平衡，达到调节免疫、抗疲劳和润肠通便的作用；其原料食用安全，易于吸收，实验证明，本发明所提供的组合物在节免疫、抗疲劳和润肠通便上的效果优异，具有十分重要的实际推广价值。


技术实现要素：

9.本发明的目的是提供一种石斛复方制剂及其制备方法和应用，该石斛复方制剂各组分各司其职，组成密不可分的统一整体，通过本发明方法制备的产品能更充分的提取出药材的有效成分并更好的保留有效成分，达到更好的调节免疫、促进肠蠕动和调节肠道菌群的作用。
10.一种石斛复方制剂，按重量计由以下组分组成：
[0011][0012]
作为优选，所述的石斛复方制剂，按重量计由以下组分组成：
[0013][0014]
进一步优选，所述的石斛复方制剂中，所述的紫皮石斛、火麻仁、紫苏子、茯苓、大枣和低聚木糖的质量比为8：5：4：2：4：4。该质量比下，上述功效成分协同作用更强。即所述的石斛复方制剂，按重量计由以下组分组成：
[0015][0016][0017]
一种石斛复方制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0018]
(1)将紫皮石斛湿法粉碎，过筛，得到粉状紫皮石斛；
[0019]
(2)将火麻仁、紫苏子、茯苓、大枣分别干法粉碎，过筛，得到粉状火麻仁、粉状紫苏子、粉状茯苓、粉状大枣；
[0020]
(3)将步骤(1)中的粉状紫皮石斛、步骤(2)中的粉状火麻仁、粉状紫苏子、粉状茯苓、粉状大枣置于提取器中，加水激流破壁提取，得提取液；
[0021]
(4)将步骤(3)中的提取液采用板框压滤进行过滤，得过滤液；
[0022]
(5)将步骤(4)中的过滤液采用低温浓缩/干燥集成技术，低温粉碎得干粉；
[0023]
(6)在步骤(5)得到的物料中添加低聚木糖和所需辅料，再根据所需制成不同形态的成品制剂。
[0024]
步骤(1)中，将紫皮石斛湿法粉碎，过40～100目筛网(优选为过60目筛)，得到粉状紫皮石斛。该方法可有效缓解紫皮石斛粉遇水易结块的问题，该尺寸以下的粉状紫皮石斛适合有效成分的提取。
[0025]
步骤(2)中，将火麻仁、紫苏子、茯苓、大枣分别干法粉碎，过20～60目筛网(优选为过30目筛)，得到粉状火麻仁、粉状紫苏子、粉状茯苓、粉状大枣。该尺寸以下的物料适合有效成分的提取。
[0026]
步骤(3)中，将步骤(1)和步骤(2)中的物料质量加40～60倍(优选为50倍，即步骤(1)中的粉状紫皮石斛、步骤(2)中的粉状火麻仁、粉状紫苏子、粉状茯苓、粉状大枣的原料质量50倍)水，激流破壁提取温度为35～40℃，提取时间为30～60分钟。该提取条件下适合有效成分的提取且不被破坏。
[0027]
步骤(4)中采用板框压滤进行过滤，滤布材料成分维纶，100目以上，过滤时检查透
明度，直至透明度符合要求。该方法效率高，适合大生产。
[0028]
步骤(5)中的低温浓缩/干燥集成技术，浓缩温度为25～50℃，以及冷冻干燥技术，可使活性成分不被高温破坏。
[0029]
步骤(6)经提取、过滤、浓缩、干燥后得到的物料添加低聚木糖和根据所需添加不同的辅料，再根据所需制成不同形态的成品制剂，可满足不同的需求。
[0030]
便秘一症虽在大肠，但与脏腑经络、气血津液、精神情志皆有密切关系，是人体阴阳、脏腑、气血、情志失调的一种局部表现。对于年老体弱及病后体虚所致的慢性习惯性或老年虚症便秘，多责之阴血不足，精血失荣，肠道干涩，通降不利，糟粕不行，致便干质硬，排出不畅。中医认为针对真阴不足，血虚津亏而致的肠燥便秘者，宜滋阴生津，益气润肠为要。
[0031]
石斛是我国传统名贵中药，具有滋阴清热、益胃生津、润肺止渴、润喉明目、延年益寿等功效，历代医药学著作对石斛的奇特功效有明确的记载，在《神农本草经》中被列为上品，谓其“味甘，平，无毒。主伤中，除痹，下气，补五藏虚劳羸瘦，强阴。久服厚肠胃，轻身延年”；《本草纲目》记载石斛“强阴益精。久服厚肠胃。补内绝不足，平胃气，长肌肉，定志除惊，轻身延年。”石斛为养阴清热，益胃生津之要药，滋阴补虚之极品。石斛属植物品种繁多，其中紫皮石斛(即齿瓣石斛)，为石斛药材中的常用品种，也是已发布食品标准的石斛品种，具有药食两用的性质。
[0032]
本发明依据中医养生理论组方，采用紫皮石斛，火麻仁，紫苏子，大枣，茯苓组方，组成一个新整体。紫皮石斛味甘，性微寒，归胃、肾经，长于强阴益精，厚肠胃，为君药。火麻仁味甘性平，归脾、胃、大肠经，具有润肠通便之功效，常用于血虚津亏，肠燥便秘；紫苏子味辛性温，入肺经，降气平喘，润肠通便，二者共为臣药。佐以茯苓，甘淡性平，健脾宁心，脾健则气足，气足则津生，助紫皮石斛津液的生成和输布；大枣补中益气，养血安神，司佐使之职。紫皮石斛，火麻仁，紫苏子，大枣，茯苓诸药共用，共奏滋阴生津，益气润肠之功，使津足则肠润，气足则肠动。可用于真阴不足，血虚津亏而致的肠燥便秘。参照现代药理学和保健食品功能所述，本发明具有促进肠蠕动，调节免疫等作用。
[0033]
本发明中，将紫皮石斛、火麻仁、紫苏子、大枣、茯苓组成石斛复方制剂，结合形成一个新整体，各组分能够产生协同作用，根据本发明设计时的实验结构，本发明石斛复方制剂具有增强raw264.7细胞的免疫功能，促进模型斑马鱼巨噬细胞增加，表明该制剂具有调节免疫的作用；斑马鱼通便实验显示本发明具有明显的肠蠕动促进作用；小鼠实验显示具有调节便秘小鼠肠道菌群的作用。可见，本发明中，紫皮石斛强阴益精、厚肠胃，配火麻仁、紫苏子滋养肠道、润肠通便，配茯苓健脾宁心，配大枣补中益气，养血安神，五种成分合而用之产生协同作用，标本兼固，具有很好的调节免疫、促进肠蠕动和调节肠道菌群的作用。本发明石斛复方制剂可用于制备具有调节免疫、促进肠蠕动和调节肠道菌群作用的功能性食品和药物。
[0034]
与现有技术相比，具有如下优点：
[0035]
本发明依据中医养生理论组方，采用紫皮石斛，火麻仁，紫苏子，大枣，茯苓组方，各组分各司其职，组成密不可分的统一整体。紫皮石斛味甘，性微寒，归胃、肾经，长于强阴益精，厚肠胃，为君药。火麻仁味甘性平，归脾、胃、大肠经，具有润肠通便之功效，常用于血虚津亏，肠燥便秘；紫苏子味辛性温，入肺经，降气平喘，润肠通便，二者共为臣药。佐以茯苓，甘淡性平，健脾宁心，脾健则气足，气足则津生，助紫皮石斛津液的生成和输布；大枣补
中益气，养血安神，司佐使之职。紫皮石斛，火麻仁，紫苏子，大枣，茯苓诸药共用，共奏滋阴生津，益气润肠之功，使津足则肠润，气足则肠动。可用于真阴不足，血虚津亏而致的肠燥便秘。参照现代药理学和保健食品功能所述，本发明兼具润肠通便和免疫调节的功能。与现有技术相比，本发明依据中医养生理论组方，组方更加严谨科学，更兼顾了润肠通便和免疫调节作用，具有创造性的显著进步。
[0036]
本发明所用的组分都是药食两用中药或食品级配料，可直接生产普通功能性食品，无需注册保健食品或药品。与现有技术相比，使用更加方便，更容易转化。
[0037]
本发明生产工艺采用现代化先进生产技术，提取工艺运用激流破壁技术，在水压的作用下细胞壁被完全打破，恒低温萃取植物中的有效成分；过滤工艺采用板框压滤，适合粉粹药材的过滤，效率高，便于工业化生产；浓缩工艺是在真空环境下低温浓缩，以使活性成分不被高温破坏；干燥工艺则采用冷冻干燥技术。全程不经过高温处理，可有效保留有效活性成分，且本生产工艺还能节省时间和生产成本。原料经提取、过滤、浓缩、干燥后的物料，可根据需要添加辅料和制成各种剂型。该制备方法能更充分的提取出药材的有效成分并保留有效成分，达到更好的调节免疫、促进肠蠕动和调节肠道菌群的作用。本发明石斛复方制剂的制备方法，即先进又便于工业化生产，具备广阔的应用前景。与现有技术相比，本发明制备方法提取得率高，全程均未经过高温处理，能更好的保留活性物质，且适合工业化生产，具有显著的进步。
附图说明
[0038]
图1为对肠道菌群多样性的影响。
具体实施方式
[0039]
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但这些实施例不得用于解释对本发明保护范围的限制。
[0040]
实施例1
[0041]
本实施例石斛复方制剂，按重量计由以下组分组成：
[0042]
紫皮石斛80g，火麻仁50g，紫苏子40g，茯苓20g，大枣40g，低聚木糖40g。
[0043]
按照下述具体方式进行制备：
[0044]
(1)将紫皮石斛湿法粉碎，过60目筛，得到粉状紫皮石斛；
[0045]
(2)将火麻仁、紫苏子、茯苓、大枣分别干法粉碎，过30目筛，得到粉状火麻仁、粉状紫苏子、粉状茯苓、粉状大枣；
[0046]
(3)将步骤(1)中的粉状紫皮石斛、步骤(2)中的粉状火麻仁、粉状紫苏子、粉状茯苓、粉状大枣置于提取器中，加原料总质量的50倍水，激流破壁提取温度为35～40℃，提取60分钟得提取液；
[0047]
(4)将步骤(3)中的提取液采用板框压滤进行过滤(滤布材料成分维纶，100目以上)，得过滤液；
[0048]
(5)将步骤(4)中的过滤液采用40℃低温浓缩，冷冻干燥，低温粉碎得干粉；
[0049]
(6)将步骤(5)得到的干粉根据所需添加低聚木糖，经流化床一步制粒制成颗粒剂。
[0050]
本实施例石斛复方颗粒剂，成人每日服用2次，每次3g。
[0051]
实施例2
[0052]
本实施例石斛复方制剂，按重量计由以下组分组成：
[0053]
紫皮石斛80g，火麻仁50g，紫苏子40g，茯苓20g，大枣40g，低聚木糖10g，硬脂酸镁适量。
[0054]
按照下述具体方式进行制备：
[0055]
(1)将紫皮石斛湿法粉碎，过60目筛，得到粉状紫皮石斛；
[0056]
(2)将火麻仁、紫苏子、茯苓、大枣分别干法粉碎，过30目筛，得到粉状火麻仁、粉状紫苏子、粉状茯苓、粉状大枣；
[0057]
(3)将步骤(1)中的粉状紫皮石斛、步骤(2)中的粉状火麻仁、粉状紫苏子、粉状茯苓、粉状大枣置于提取器中，加原料总质量的50倍水，激流破壁提取温度为35～40℃，提取30分钟得提取液；
[0058]
(4)将步骤(3)中的提取液采用板框压滤进行过滤(滤布材料成分维纶，100目以上)，得过滤液；
[0059]
(5)将步骤(4)中的过滤液采用30℃低温浓缩，冷冻干燥，低温粉碎得干粉；
[0060]
(6)将步骤(5)得到的干粉根据所需添加适量低聚木糖，经流化床一步制粒，整粒；
[0061]
(7)将步骤(6)所制得颗粒与适量硬脂酸镁混合均匀，压片，得到石斛复方片剂。
[0062]
本实施例石斛复方片剂，成人每日服用2次，每次3片。
[0063]
实施例3
[0064]
本实施例石斛复方制剂，按重量计由以下组分组成：
[0065]
紫皮石斛60g，火麻仁40g，紫苏子30g，茯苓10g，大枣30g，低聚木糖10g，微粉硅胶适量。
[0066]
按照下述具体方式进行制备：
[0067]
(1)将紫皮石斛湿法粉碎，过60目筛，得到粉状紫皮石斛；
[0068]
(2)将火麻仁、紫苏子、茯苓、大枣分别干法粉碎，过30目筛，得到粉状火麻仁、粉状紫苏子、粉状茯苓、粉状大枣；
[0069]
(3)将步骤(1)中的粉状紫皮石斛、步骤(2)中的粉状火麻仁、粉状紫苏子、粉状茯苓、粉状大枣置于提取器中，加原料总质量的50倍水，激流破壁提取温度为35～40℃，提取30分钟得提取液；
[0070]
(4)将步骤(3)中的提取液采用板框压滤进行过滤(滤布材料成分维纶，100目以上)，得过滤液；
[0071]
(5)将步骤(4)中的过滤液采用45℃低温浓缩，冷冻干燥，低温粉碎得干粉；
[0072]
(6)将步骤(5)得到的干粉根据所需添加低聚木糖，经流化床一步制粒，整粒；
[0073]
(7)将步骤(6)所制得颗粒与适量微粉硅胶混合均匀，灌装胶囊，得紫皮石斛胶囊剂。
[0074]
本实施例石斛复方胶囊剂，成人每日服用2次，每次3粒。
[0075]
对比例1
[0076]
对比例石斛普通制剂，按重量计由以下组分组成：
[0077]
紫皮石斛40g，火麻仁50g，紫苏子40g，茯苓20g，大枣40g，低聚木糖40g。
[0078]
制备方法同实施例1。
[0079]
对比例2
[0080]
对比例石斛普通制剂，按重量计由以下组分组成：
[0081]
紫皮石斛80g，火麻仁50g，紫苏子40g，茯苓20g，大枣40g，低聚木糖40g。
[0082]
按照下述具体方式进行制备：
[0083]
(1)将紫皮石斛饮片、火麻仁饮片，紫苏子饮片，茯苓饮片，大枣饮片置于提取器中，加原料总质量的50倍水，95～100℃提取60分钟，得提取液；
[0084]
(2)将步骤(1)中的提取液采用板框压滤进行过滤(滤布材料成分维纶，100目以上)，得过滤液；
[0085]
(3)将步骤(2)中的过滤液采用60～70℃浓缩，喷雾干燥，得干粉；
[0086]
(4)将步骤(3)得到的干粉根据所需添加低聚木糖，经流化床一步制粒制成颗粒剂。
[0087]
本实施例石斛复方颗粒剂，成人每日服用2次，每次3g。
[0088]
药效试验
[0089]
经实验证实本发明具有调节免疫、促进肠蠕动和调节肠道菌群的作用。
[0090]
一、调节免疫作用实验
[0091]
1材料
[0092]
1.1试样：实施例1制备的石斛复方制剂；对比例1、2制备的石斛普通制剂。
[0093]
1.2实验细胞：raw264.7细胞来自中国科学院上海生物科学研究所，在添加10％热灭活胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem中，在37℃，5％co2条件下培养。
[0094]
1.3实验动物：黑色素等位基因突变型albino品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后2天(2dpf)，饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μs/cm；ph为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/l caco3)，实验动物使用许可证号为：syxk(浙)2012-0171。饲养管理符合国际aaalac认证的要求。
[0095]
1.4主要试剂：rpmi1640培养基；dmem高糖型；双抗(青霉素和链霉素)胎牛血清；0.25％胰蛋白酶；四唑氮蓝(mtt)；二甲基亚砜(dmso)；rna提取及纯化试剂盒；cdna合成(逆转录)试剂盒；pcr试剂盒；tnf-α，il-6elisa试剂盒；长春瑞滨；甲基纤维素；尼罗红。
[0096]
1.5主要仪器：co2培养箱；超净工作台；显微镜；梯度pcr仪；紫外可见分光光度计；低温台式离心机；振荡器；酶联免疫检测仪；解剖显微镜；与显微镜相连的相机；6孔板；精密电子天平；显微注射仪；拉针仪。
[0097]
2方法
[0098]
2.1对raw264.7细胞免疫功能的影响
[0099]
2.1.1对raw264.7细胞增殖影响
[0100]
将raw264.7细胞(5
×
105细胞)接种于96孔平板培养24小时，加入不同浓度(50、150、450μg/ml)的试样，最终体积为2ml，于37℃、5％co2培养箱孵育18小时后加入20μlmtt(5g/l)，于37℃、5％co2培养箱再孵育4小时，离心，弃清液体用滤纸吸残液后，每孔加100μldmso，轻震10分钟，酶标仪490nm波长检测吸光度，计算细胞相对增值率＝试验组吸光度均值/空白组吸光度均值。
[0101]
2.1.2对raw264.7细胞因子分泌的影响
[0102]
将raw264.7细胞(5
×
105个细胞)接种于24孔平底平板培养24小时，然后分别加入各浓度试样，最终体积为2ml，再于37℃、5％co2培养箱中培养24小时后取细胞上清液用elisa试剂盒测定il-6和tnf-α等细胞因子的含量。
[0103]
2.2对巨噬细胞减少症斑马鱼的影响
[0104]
随机选取受精后2天(2dpf)黑色素等位基因突变型albino品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，静脉注射给予长春瑞滨0.25ng/尾剂量建立斑马鱼巨噬细胞减少症模型。模型斑马鱼分别水溶给予不同剂量的试样，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔(实验组)容量为3ml。斑马鱼处理2天后，加中性红溶液对斑马鱼进行活体染色，染色结束后统计斑马鱼头部巨噬细胞数量；另nr染色观察斑马鱼卵黄巨噬细胞的募集情况，以统计学意义评价试样对巨噬细胞形成的促进作用。
[0105]
3结果
[0106]
3.1对raw264.7细胞的免疫功能影响
[0107]
由表1可知，在本实验的浓度范围内，试样的中高剂量组可明显刺激raw264.7巨噬细胞的增殖，显著促进细胞因子il-6的释放，三个剂量组均显著能促进细胞因子tnf-α的释放，提示试样具有调节raw264.7巨噬细胞免疫功能的作用，效果明显优于对比例1组和2组。
[0108]
表1.对raw264.7细胞免疫功能的影响实验结果
[0109][0110]
注：与空白对照组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0111]
3.2对巨噬细胞减少症斑马鱼的影响
[0112]
模型对照组斑马鱼头部巨噬细胞数量(39.8个)与正常对照组(61.6个)比较p《0.001，提示斑马鱼巨噬细胞减少症模型构建成功；试样中剂量组(333.3μg/ml)和高剂量组(1000μg/ml)斑马鱼头部巨噬细胞数量分别为49.9个和54.7个，与模型对照组比较，中剂量组p《0.01，高剂量组p《0.001，其对斑马鱼巨噬细胞形成促进作用分别为25.4％、37.4％，显示试样对巨噬细胞形成具有明显的促进作用，并且其效果要明显优于对比例1、2组，结果详见表2。
[0113]
表2.对巨噬细胞形成促进作用评价实验结果
[0114][0115]
注：与模型对照组比较，**p《0.01，***p《0.001。
[0116]
二、促进肠蠕动实验
[0117]
1材料
[0118]
1.1试样：实施例1制备的石斛复方制剂；对比例1、2制备的石斛普通制剂。
[0119]
1.2实验动物：野生型ab品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后5天(5dpf)，饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μs/cm；ph为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/l caco3)，实验动物使用许可证号为：syxk(浙)2012-0171。饲养管理符合国际aaalac认证的要求。
[0120]
1.3主要试剂：甲基纤维素；尼罗红；二甲基亚砜；多潘立酮片。
[0121]
1.4主要仪器：荧光显微镜；精密电子天平；六孔板。
[0122]
2方法
[0123]
随机选取受精后后5天(5dpf)野生型ab品系斑马鱼，水溶给予尼罗红建立斑马鱼肠动力评价模型。水溶给予模型斑马鱼试样111.1、333.3和1000μg/ml浓度，阳性药多潘立酮30μg/ml浓度，同时设置模型对照组，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，每孔药液容量为3ml。各组分别处理24小时后，每组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照并保存图片，用nis-elements d 3.10高级图像处理软件进行图像分析并采集数据，分析统计斑马鱼肠道荧光信号强度(s)，以肠道荧光信号强度的统计学分析结果评价试样对肠蠕动的促进作用，统计学处理结果用mean
±
se表示。用方差分析和dunnett’s t-检验进行统计学分析，p《0.05表明具有显著性差异。
[0124]
3结果
[0125]
阳性对照药多潘立酮30μg/ml浓度组斑马鱼肠道荧光信号强度(6.60
×
105像素)与模型对照组(12.76
×
105像素)比较p《0.001，肠蠕动促进作用为48％，说明多潘立酮具有明显的肠蠕动促进作用。试样低中高111.1、333.3和1000μg/ml浓度组斑马鱼肠道荧光信号强度分别为6.56
×
105、6.14
×
105和6.86
×
105像素，与模型对照组比较p均《0.001，肠蠕动促进作用分别为49％、52％和46％。提示在本实验浓度条件下，试样具有明显的肠蠕动促进作用，并且其效果要明显优于对比例1、2组。见表3。
[0126]
表3.对斑马鱼肠道荧光信号强度的影响实验结果
[0127][0128]
注：与模型对照组比较，***p《0.001。
[0129]
三、调节肠道菌群实验
[0130]
1材料
[0131]
1.1试样：实施例1制备的石斛复方制剂。
[0132]
1.2实验动物：清洁级icr小鼠，雄性，体重18～22g。由浙江省实验动物中心提供，动物合格证号：scxk(浙)2019-0002。实验动物使用许可证号为：syxk(浙)2019-0011。
[0133]
1.3主要试剂：盐酸洛哌丁胺胶囊；stool dna kit(粪便dna提取试剂盒)；fastpfu dna polymerase(超高保真pcr酶)；axyprepdna凝胶回收试剂盒。
[0134]
1.4主要仪器：geneamp9700型pcr仪；quantifluor
tm-st蓝色荧光定量系统；illumina miseq测序仪。
[0135]
2方法
[0136]
参照《保健食品检验与评价技术规范(2003版)》方法利用盐酸洛哌丁胺建立小鼠便秘模型。实验分正常对照组、模型对照组、低剂量试验组(0.5g/kg)、中剂量试验组(1.0g/kg)、高剂量试验组(3.0g/kg)，每组10只，灌胃给药，每天1次，连续10天，收集新鲜粪便于-80℃条件下保存备用。采用16s rrna测序方法进行肠道菌群检测与分析，通过alpha多样性分析获取肠道菌群物种的多样性丰度等信息，探讨本发明对便秘模型小鼠肠道茵群的影响。
[0137]
3结果
[0138]
经采用16s rrna基因测序方法检测了便秘小鼠肠道菌群，alpha多样性分析显示：与正常对照比较，模型对照组属水平菌群数量明显减少p《0.05，而各试验组属水平菌群数量则未见统计学差异，即模型组小鼠肠道菌群明显减少，试验组能够改善菌群数量减少状况。对肠道菌群多样性的影响见图1。
[0139]
四、结论
[0140]
实验结果显示，本发明石斛复方制剂能增强raw264.7细胞的免疫功能，促进模型斑马鱼巨噬细胞增加，表明具有调节免疫的作用；斑马鱼实验显示本发明具有明显的肠蠕动促进作用，并且效果要明显优于对比例1、2组；小鼠实验显示具有调节便秘小鼠肠道菌群
的作用。可见，本发明中，紫皮石斛强阴益精、厚肠胃，配火麻仁、紫苏子滋养肠道、润肠通便，配茯苓健脾宁心，配大枣补中益气，养血安神，五种成分合而用之产生协同作用，标本兼固，具有更好的调节免疫、促进肠蠕动和调节肠道菌群的作用。提示本发明石斛复方制剂可用于制备具有调节免疫、促进肠蠕动和调节肠道菌群作用的功能性食品和药物中。