无标记厚样本的实时定量相位成像方法和系统与流程

1.本发明涉及相位成像领域，具体涉及无标记厚样本的实时定量相位成像方法和系统。


背景技术：

2.定量相位成像在生物医学领域具有巨大的潜力，因其具有对样本无标记、无损伤的优点，且具备纳米级相位灵敏度、衍射极限的分辨率，大视场。但是，传统的定量相位成像方法无法对厚样本成像，因为多重散射光干扰了样本信息，且光被样本吸收，导致对比度下降，成像深度有限。
3.为了解决厚样本成像中的问题，落射式非相干光照明的相位梯度方法成为了新兴手段。目前有两种经典的相位梯度方法：倾斜背向照明成像技术(obm)和落射式的梯度光干涉成像技术(epi-glim)。obm技术(见《nature methods》上《phase-gradient microscopy in thick tissue with oblique back-illumination》)测量样本相位引入的强度差异，是倾斜照明技术的反射式变体。将一对点光源固定在物镜两侧，依次照明获得的两张图像相减后，依据点扩散函数进行反卷积计算，可以获得单个差分方向的相位。epi-glim技术(见《nature communications》上《epi-illumination gradient light interference microscopy for imaging opaque structures》)将样本的相位差转换为振幅差，是反射式微分干涉技术的变体。通过额外搭建4f系统，在傅里叶面上放置相位延迟器进行四步相移，实现定量相位的测量。与epi-glim原理类似的差分方法hd-glim(见《optics letter》上《harmonically decoupled gradient light interference microscopy(hd-glim)》)，利用振幅型空间光调制器调制正弦光栅，实现光场的差分干涉，并用四步相移实现相位的定量测量。
4.然而，epi-glim只用单个方向的相位梯度恢复相位，鲁棒性没有二维相位恢复方法高。为了获得两个垂直方向的相位梯度，hd-glim和obm都需要改变差分方向(x和y方向)。其中，obm需要改变照明的角度和方向，依次点亮四个点光源恢复二维相位。而hd-glim要在四步相移的基础上改变正弦光栅投影的方向，需要8张图恢复二维相位，十分耗时。此外，hd-glim是透射式成像光路，无法对不透明的样本成像。obm的不对称照明导致其相位传递函数具有各向异性的固有缺陷，重构相位若要获得各向同性的成像分辨率，需要多个方向的照明，将会影响实时成像能力。


技术实现要素：

5.针对现有技术的以上缺陷或改进需求中的一种或者多种，本发明提供了一种实时定量相位成像方法。该方法解决了obm存在的各向异性分辨率的缺陷，无需改变差分方向和照明方向即可获得二维相位图，相比epi-glim的相位恢复方法鲁棒性更高，相比hd-glim，成像速度至少提升了2倍。此外，该方法无需传统微分干涉方法的剪切元件和相位调制器，结构简单。
6.为实现上述目的，本发明提供一种实时定量相位成像系统，其特征在于，所述系统包括：检测入射光路系统，包括：部分相干光源，提供照明光源；分光元件，对所述光源进行分光分束处理；物镜，具有与所述光源匹配的数值孔径，将经过所述分光元件处理的光束均匀投射于待检测样品上；
7.检测反射光路系统，包括：物镜，将经过所述待检测样品反射的光收集并引导至相位调制模块；检测器，对所述相位调制模块处理后的光束进行分析处理；所述相位调制模块加载周期衍射调制图案，所述调制图案的相位和周期可调节，所述周期衍射调制图案的每个周期图案的衍射强度近似相等。
8.进一步地，所述相位调制模块包括4f系统和振幅调制器。
9.进一步地，所述调制图案为棋盘光栅。
10.进一步地，所述光源与所述分光元件之间还包括有扩束器和透镜组。
11.进一步地，所述调制图案的相位调节方法为调节初始相位。
12.进一步地，所述检测器接收来自所述相位调制模块的至少四个步骤的相位移相后的图像后执行分析。
13.本发明还公开了一种实时定量相位成像方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
14.采集待检测样品反射的光场；对所述光场执行衍射光调制；所述每个周期的衍射光的振幅近似相等；获取检测端的强度图案信号及横向剪切方向的目标差分相位；
15.执行所述衍射光调制的至少四个不同参数的移相处理获得至少四个所述强度图案信号；依据所述强度图案信号计算获得横向剪切方向的差分相位和；
16.对所述差分相位和执行傅里叶变换，并且经过维纳反卷积计算，获取所述横向剪切方向的测量相位。
17.进一步地，由所述测量相位计算所述横向剪切方向的x方向和y方向的相位梯度。
18.进一步地，所述衍射光调制的图案为棋盘格光栅，。
19.进一步地，所述衍射光调制还包括调制光栅周期以调制所述横向剪切距离。
20.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
21.(1)本发明在普通明场显微镜上额外增加了相位调制模块。该模块由4f系统和振幅调制器组成。其中，振幅调制器代替了传统微分干涉对比方法中的复杂的光剪切元件和相位型空间光调制器，简化了系统的设置。
22.(2)本发明采用了落射式照明和部分相干光源。在落射式照明中，物镜同时用作照明的聚光镜，保证了较高的照明数值孔径，且落射式照明的光源与物镜的数值孔径完美匹配，能均匀地提升横向分辨率，显著减少各向异性的分辨率缺陷的问题。而部分相干光配合大照明孔径，轴向频率的覆盖面积增大，保证了优良的光学切片能力。
23.(3)本发明为了同时获得沿正交剪切方向的相位信息，提高成像速度，利用4f系统和振幅调制器组成的器件，并切加载棋盘光栅，对光栅的初始相位和光栅的周期进行调整，并且结合移相所获取的图像信息，采用维纳反卷积算法，从而获得横向剪切方向的相位测量结果，在简化了依次点亮光源的成像方法的基础上，简化了系统的设置，并且显著提高了成像速度和测量效率。
附图说明
24.图1是本发明实施例中的相位成像的装置组成结构示意图；
25.图2是本发明实施例中振幅调制器中所施加的光栅棋盘图像示意图；
26.图3是本发明实施例中标刻线的测量结果：(1)x方向相位梯度；(2)y方向相位梯度；(3)二维相位；(4)图(3)白框区域三维高度；(5)图(4)白色虚线处截面；
27.图4是本发明实施例中的蜜蜂口器的深度扫描相位图：(1)～(4)60μm～150μm深度的相位图；(5)相位图堆栈，x-y平面方向；(6)相位图堆栈，三维显示。
28.在所有附图中，同样的附图标记表示相同的技术特征，具体为：
29.1-led光源，2-扩束器，3，4-透镜组，5-样本，6-物镜，7-分光棱镜，8-套筒透镜，9，11-4f透镜组，10-振幅调制器，12-cmos相机。
具体实施方式
30.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
31.本方法拥有优良的横向分辨率和光学切片能力，因为采用了落射式照明和部分相干光源。在落射式照明中，物镜同时用作照明的聚光镜，保证了较高的照明数值孔径，且与物镜的数值孔径完美匹配，能均匀地提升横向分辨率。而部分相干光配合大照明孔径，轴向频率的覆盖面积增大，保证了优良的光学切片能力。
32.本方法在普通明场显微镜上额外增加了相位调制模块。该模块由4f系统和振幅调制器组成。其中，振幅调制器代替了传统微分干涉对比方法中的光剪切元件和相位型空间光调制器，简化了系统的设置，节约了成本。
33.本方法的装置如图1所示。led光源1经过扩束器2和透镜组3，4，由分光棱镜7反射进入物镜6，提供均匀照明。样本反射回来的光由物镜6收集，经过套筒透镜8，由4f系统9，11中的振幅调制器10在频域中对样本光场进行调制，最后用相机记录光场信息。
34.进一步的说明，上述led光源为部分相关光源，在经过分光棱镜7之后，能够保证更加均匀的横向剪切方向的照明投射，减小各向异性的分辨率缺陷的问题；
35.上述物镜6具有大照明数值孔径，增大轴向的覆盖面积；
36.上述振幅调制器10在频域中对样本光场进行调制的主要方法包括投射衍射图案；
37.其中，所述振幅型调制器可以是铁电液晶(flcd)或者液晶空间光调制器(slm)，
38.按照上述的光学系统执行一种实时定量相位成像方法，所述方法包括如下步骤：
39.采集待检测样品反射的光场；
40.对所述光场执行衍射光调制；所述每个周期的衍射光的振幅近似相等；
41.获取检测端的强度图案信号及横向剪切方向的目标差分相位；
42.执行所述衍射光调制的至少四个不同参数的移相处理获得至少四个所述强度图案信号；
43.依据所述强度图案信号计算获得横向剪切方向的差分相位和；
44.对所述差分相位和执行傅里叶变换，并且经过维纳反卷积计算，获取所述横向剪
切方向的测量相位。
45.为了同时获得沿正交剪切方向的相位信息，提高成像速度，我们在振幅调制器上加载棋盘光栅，获得沿x和y方向对称衍射的样品波前，如图2中所示。我们通过增加光栅的初始相位来实现移相，通过改变光栅周期来调制剪切距离，进一步说明，上述棋盘光栅图案的加载，优选为棋盘格光栅，实际上，为获得本发明测量方向的要求，其它在周期上具有近似相等强度的衍射周期图案都可满足算法的要求。
46.结合四步移相和维纳反卷积算法重建了相位图，其中，本实施例中说明了采用四步移相来进行算法的执行，并且四步移相的周期间隔为在后续的cmos采集的图像强度相位信息中能够方便获取差分相位和。
47.棋盘光栅在傅里叶面上的振幅透射率为：
[0048][0049]
在公式(1)中，表示横向的空间频率，其中λ0是中心波长，r是空间坐标系，f是4f系统中透镜9和透镜11的焦距。是振幅调制器中额外增加的相移量，x0与y0是沿x和y方向的差分位移。光栅沿两个方向的周期可以表示为：和
[0050]
样本反射回来的光波经过透镜9到达傅里叶面，表示为u(k)。经过振幅调制器的振幅调制后，光场表示为：
[0051][0052]
经过透镜11后，光场在其后焦面相当于傅里叶逆变换。
[0053][0054]
如图2中所示，假设来自棋盘格的这四束衍射光的振幅近似相等：
该假设在差分相敏的方法中经常使用，因为差分量比衍射极限小，并且生物样本发生急剧变化的情况很罕见。
[0055]
cmos采集的强度图可以表示为：
[0056][0057]
其中感兴趣的差分相位为：
[0058]
δφ
x
(x，y) δφy(x，y)＝φ(x x0，y y0)-φ0(x，y)＝φ0(x，y)-φ(x-x0，y-y0)
ꢀꢀꢀ
(5)
[0059]
δφ
x
(x，y)-δφy(x，y)＝φ(x x0，y-y0)-φ0(x，y)＝φ0(x，y)-φ(x-x0，y y0)
ꢀꢀꢀ
(6)
[0060]
经过振幅调制器四步相移的调制后，我们能得到x和y方向差分相位的和：
[0061][0062][0063][0064]
δφ
x
(r) δφy(r)＝arg[i4(r)-i2(r)，i1(r)-i3(r)]
ꢀꢀꢀ
(10)
[0065]
对差分相位之和傅里叶变换，利用维纳反卷积的方法，能直接得到测量的相位φ0(x，y)。计算过程如下：
[0066]
g(u，v)＝ft[δφ
x
(r) δφy(r)]＝h(u，v)φ0(u，v)
ꢀꢀꢀ
(11)
[0067][0068][0069]
其中φ0(x，y)是理想的相位图,|φ0(u，v)是φ0(x，y)的傅里叶变换对,ε是信号和噪声的谱密度倒数之比。
[0070]
为了分别重建x和y方向的相位梯度，定义：
[0071][0072][0073][0074]
由此我们能求出x方向的相位梯度，同理可求解y方向相位梯度。
[0075]
系统成像速度取决于振幅调制器刷新率和相机频率。相机曝光时间为10ms，采集帧率为60fps，振幅调制器刷新率为15khz，结合本方法中的算法，能实现至少10张图每秒的成像速度。
[0076]
为了标定差分量，并验证测量的准确性，对10μm周期的金属标刻线进行测量，已知其平均高度约为0.33μm。取图3(3)中的白色方框部分，图3(4)在三维中显示了高度。图3(5)显示了图3(4)白色虚线处的横截面。从这些图中能看出，实际测量值接近理论值，由于金属蚀刻工艺达不到完美水平，部分地方会有波动，属于正常现象。整体的均值符合理论值。
[0077]
图3标刻线的测量结果。(1)x方向相位梯度；(2)y方向相位梯度；(3)二维相位；(4)图(3)白框区域三维高度；(5)图(4)白色虚线处截面。
[0078]
为了验证厚样本的成像能力，对蜜蜂口器以1.5μm步距，从0μm～210μm进行深度扫描。从图4(1)～(4)可见，不同深度展示的相位信息不同，背景杂散光被很好地抑制，具有良好的层析能力。图(5)～(6)为140张相位图堆栈，在三维中的显示，每层间隔1.5μm，可见样本轮廓在三维中清晰地呈现。证明本方法能够对厚样本深度扫描成像。图4蜜蜂口器深度扫描相位图：(1)～(4)60μm～150μm深度的相位图；(5)相位图堆栈，x-y平面方向；(6)相位图堆栈，三维显示。
[0079]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。