一种PCR法快速评价哺乳动物细胞质量的试剂盒及其检测方法与流程

一种pcr法快速评价哺乳动物细胞质量的试剂盒及其检测方法
技术领域
1.本发明涉及细胞鉴定领域，尤其涉及一种pcr法快速评价哺乳动物细胞质量的试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.体外培养的细胞越来越广泛的用于科学研究和生产中。同时交叉污染细胞的使用日趋严重，已严重影响了科学研究的质量和产品质量。在研究之用外，培养细胞还被用于疾病诊断和生物活性物质的生产，其细胞质量的优劣就尤其重要。因此引起了学者们的广泛关注，提出了质量要求。当前提出研究用细胞系需进行全面鉴定。
3.目前体外培养细胞在使用中存在的核心问题是：病原体、微生物污染、细胞交叉污染或鉴定错误以及由于细胞过度传代造成遗传信息改变。这些变化的原因主要是：细胞培养操作技术不规范、细胞来源不清、传代数不清、引入的细胞错误等等。
4.支原体污染是细胞培养过程中易出现、难避免、难发现的问题。当细胞(特别是传代细胞)被支原体污染后，细胞内的dna、rna及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。
5.支原体检测一般采用以下几种方法：
6.1.培养法：是最传统的支原体污染检测方法，也是最早的检测方法，基本实验步骤首先是将细胞培养物置于支原体肉汤液体培养基中，37℃培养3天后离心，将沉淀物转移至支原体固体琼脂培养基中，相同条件下培养，观察培养基中若有类似煎鸡蛋样菌落出现，则细胞被支原体污染了。
7.2.dna荧光染色法：利用荧光试剂hoechst 33258等标记细胞和支原体dna，荧光染料会结合到dna的a-t富集区域，因为支原体dna中a-t含量占多数，所以可将其染色，染料在紫外光激发下产生黄绿色荧光，利用荧光显微镜观察支原体是否存在。正常细胞核区见边缘整齐清晰的荧光，胞质区无荧光。被支原体污染的细胞不仅在细胞核而且在细胞核外及细胞膜上均可见许多大小均一之荧光小点，即为支原体dna，证明细胞被支原体污染了。
8.3.pcr(polymerase chain reaction)检测支原体方法：支原体作为一种原核生物，其rrna基因是由保守和多变序列间隔排列而成，能够作为生物分类的指标。pcr以4种dntp为底物，在引物存在的情况下，在dna模板的3’末端进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板核酸得到指数级的扩增。pcr检测方法尤其适用于培养困难而且耗时的支原体的检测鉴定。
9.4.荧光定量pcr方法：荧光定量pcr是在常规pcr基础上加入荧光探针或相应的荧光染料来实现实时定量的。随着pcr反应的进行，pcr反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。在实时荧光定量pcr技术中ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的
对数存在线性关系，起始拷贝数越多，ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表ct值。因此，只要获得未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
10.细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染。一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
11.培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，ph改变而呈现黄色。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。一般细菌污染进程很快，大约污染一两天后肉眼就能显著观察到。细菌检测一般采用以下几种方法：
12.1.肉眼观察：细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。
13.2.接种观察：采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。
14.3.显微镜下观察：在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染；若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。
15.4.测序验证：取适量培养液提基因组送测序，然后分析测序结果。
16.细胞交叉感染检测一般采用以下几种方法：
17.细胞培养操作技术不规范、细胞来源不清、传代数不清、引入的细胞错误使用了交叉污染或错误辨识的细胞而导致研究结论错误、结果不可重复、临床细胞治疗灾难性后果，这浪费大量时间、精力和金钱。
18.因此近年nih、atcc、nature和science等对此多次发出呼吁，要求研究者对细胞进行鉴定，如2011年美国国家标准学会专门颁布了一份细胞str鉴定国家标准；2014年12月、2015年2月science杂志分别发表文章专题阐述细胞交叉污染和错误辨识严重性；2015年4月nature通知：nature旗下杂志将从5月开始要求作者鉴定论文中所用细胞系；2015年6月有报道称一科学家由于用错细胞系，撤销nature论文。
19.1.同工酶谱检测法：由于不同种属来源的细胞在同工酶谱分布上具有差异，通过凝胶电泳分离后，对电泳带型和相对迁移距离进行检测，可用于细胞交叉污染的检测。同工酶谱检测法适用于种属间的细胞交叉污染检测。采用同工酶谱检测法进行细胞交叉污染检测时，检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)、乳酸脱氢酶(ldh)、苹果酸脱氢酶(md)和核营磷酸化酶(np)是十分重要的。若待检细胞样品的同工酶迁移率与标准对照品不一致或者存在多个酶谱条带，可以判定该细胞样品存在种属间的细胞交叉污染。
20.2.hla基因型检测法：hla因其高度多态性而成为最能代表个体特异性并伴随个体终身的稳定的遗传标志，在无关个体之间hla型别完全相同的几率极低，因此通过检测细胞的hla基因型可以确定细胞是否存在交叉污染。由于hla基因型只存在人体中，hla基因分型检测法适用于不同人源细胞之间(种属内)的交叉污染检测。hla基因型检测法宜采用序列
特异性引物进行pcr扩增，并结合第二代测序技术进行hla高分辨的分型检测。若待检细胞样品的hla基因分型结果与目标细胞存在明显差异，可以判定该人源细胞存在种属内细胞交叉污染。
21.3.细胞形态分析：细胞形态检测法一般通过对细胞生长形态、生长特性等特征进行检测，初步判断是否发生细胞交叉污染。细胞形态检测法适用于贴壁生长的细胞发生的交叉污染检测，不适用于悬浮生长的细胞。细胞形态检测法的检测指标一般包括细胞形态(如圆形、梭形等)、细胞直径、细胞体积。由于较低的检测准确性，若通过细胞形态检测法检测出细胞可能出现交叉污染，选择其他的检测方法进一步验证和确认是十分重要的。
22.4.pcr检测法：pcr检测法是基于种属间进化保守性差异建立的细胞交叉污染检测方法，具有较高的灵敏度和特异性。目前，细胞色素b(cytochrome b,cytb)和细胞色素c氧化酶1(cytochrome coxidasesubunit1,col)等保守基因在不同种属间具有较大差异，已被用于进行细胞交叉污染的检测。pcr检测法目前主要适用于种属间的细胞交叉污染检测。
23.5.str基因分型检测法：str基因分型检测法是依据不同个体来源的细胞在str位点的多态性，通过同时扩增和检测多个str位点获得str图谱，检测细胞是否存在交叉污染，具有高灵敏度、高鉴别能力和标准化自动分型等特征。str基因分型检测法适用于种属内的细胞交叉污染检测。采用str基因分型检测法进行人源细胞交叉污染检测时，检测的str位点宜包含：d13s317，th01，d5s818，d16s53：tpox，d7s820，csf 1po，vwa和性别决定位点amelogenin(ameij)。
24.6.免疫荧光染色检测法：部分细胞具有特异性抗原或受体标记(如特异性蛋白)，免疫荧光染色检测法通过将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，可以在荧光显微镜下观察和检测细胞的生物学特征。免疫荧光染色检测法适用于细胞专属特性的检测；部分种属细胞具有特异性的抗体，通过免疫荧光染色也适用于部分种属间细胞交叉污染检测。在进行免疫荧光染色检测时，选择具有典型性和特异性的抗原或受体标记，对于有效鉴定细胞专属特性十分重要。
25.但上述检测不全，需要通过操作者经验判断是哪种污染选择对应方法进行检测。另外各种实验方法存在相应不足。
26.端粒酶检测：
27.端粒酶是合成染色体末端的端粒的酶。端粒(telomere)是真核细胞染色体的天然末端，由上千个6碱基重复序列(ttaggg)组成，是细胞必需的遗传组分，它的作用是维持端粒有足够的长度，保证基因信息在复制过程中的准确性，以防止染色体末端遗传信息的丢失。在正常情况下，每个细胞分裂周期都会使端粒变的越来越短，当端粒短到一定程度时就会发出信号，细胞停止分裂。传代次数多，细胞生长状态不好端粒会缩短。在细胞染色体复制过程中，能够以自身rna为模板，在染色体3’末端合成重复序列，维持端粒的长度。端粒酶在正常体细胞中的活性被抑制，但是大量的资料表明在一些恶性肿瘤中的表达高达85％。由于端粒酶特异地表达于各种肿瘤细胞，并且是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的。
28.基本原理：利用端粒酶在体外可以以其自身rna的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列的特性，采用pcr方法扩增此重复序列，并进而用琼脂糖电泳显示6个碱基差异的梯带。1994年kim建立的trap法，其主要原理如下：首先合成一个18nt的ts做上游引物，端粒酶结合ts末端的gtt并合成agggttag，然后每经过一次转位合成
一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入cx做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。pcr端粒酶活性检测试剂盒基于同样的的原理，检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6bp的梯状条带，条带的多、寡、深或浅表示端粒酶活性的大小。保留了传统trap法灵敏度高、特异性强等优点。同时，还增设了内标准物，提供阳性对照品，优化了引物设计，使pcr效果进一步提高，使之能够高灵敏的检测到细胞和组织提取物中端粒酶的活性。
29.支原体检测：
30.1.培养法简单直观，大多数支原体可出现特有的典型菌落，但是支原体生长缓慢，培养一代大约需要3-4小时，一般需要培养28天才能判断是否有支原体的污染，工作量大，而且有进一步扩大支原体传播的风险。支原体对培养条件比较苛刻，培养基成分质量或批次的不同都会对支原体的正常生长产生影响，而且有一些支原体无法通过培养法生长，因此使用培养法检测结果并不准确，容易产生假阴性。
31.2.dna荧光染色灵敏度比较低，因背景荧光的存在，细胞轻度支原体污染不易检出。细胞裂解死亡产生碎片也会被荧光染料染色被误认为是支原体染色所致造成假阳性。dna荧光染色法比细胞培养法检测缩短了检测时间但灵敏度和准确性不高且检测时需要荧光显微镜。荧光染色法不能确定具体是哪种支原体导致的细胞污染。荧光染色法一般要求培养无污染的指示细胞作为对照，增加了检测的工作量。
32.3.因为pcr产物拷贝量大，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。最可能造成pcr产物污染的形式是气溶胶污染，在操作时比较剧烈地摇动反应管，尤其是打开反应管的盖进行电泳点样操作时都可形成气溶胶而污染。一个气溶胶颗粒包含大量拷贝，因而由气溶胶造成的污染产生的假阳性是一个值得特别重视的问题，而且pcr一次只能检测一个指标。
33.4.实时荧光定量pcr需要配套价格高昂的荧光定量pcr仪器，而且设备维护费用高，机器设置操作复杂，需专业人员，难以得到全面推广。
34.5.str图谱分析法仅适用于人源及鼠源少数物种细胞的种内细胞鉴别和交叉污染的检测。
35.细菌检测：
36.1.肉眼观察：该方法不够客观准确，容易误判。
37.2.接种观察：对培养条件和操作要求较高，需要严格保持无菌操作。因此易在操作过程中感染其他菌种，导致对结果产生误判。
38.3.显微镜观察：显微镜下观察会对结果的判断产生偏差。由于不能准确判断感染细胞的是否为细菌，并非其他原因，因此该方法不够严谨有效。
39.4.测序验证：对于实验室设备和技术要求较高，需要有专业设备且操作复杂。
40.细胞交叉感染检测：
41.1.同工酶谱检测法：主观判断可能会影响结果的判断，无客观数据存在。灵敏度低。
42.2.hla基因型检测法：分型鉴定要求高。
43.3.细胞形态分析：无法检测悬浮细胞，准确性低。
44.4.pcr检测法：实验器材成本高，实验进行较为复杂。
45.5.str基因分型检测法：目前只适用于人源细胞交叉感染检测。
46.6.免疫荧光染色检测法：非特异性染色影响检测灵敏度。
47.细胞生长质量：
48.细胞衰老的机制迄今未能得到彻底阐明。由于大部分永生化细胞和肿瘤细胞均高表达端粒酶活性，因而目前认为，端粒长度的变化可能是细胞分裂与衰老的一个分子生物钟。
49.因此，上述检测方法存在检测时间过长，不能同时对感染支原体、细菌、细胞类型、细胞代数准确定性，不能对多类型进行检测，普通检测比较单一，单项检测范围比较窄，不能对细胞类型进行检测，对于观察到的结果不能仅凭主观判断，需要有客观数据支持实验结果的诸多缺点。


技术实现要素：

50.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种pcr法快速评价哺乳动物细胞质量的试剂盒及其检测方法。
51.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种pcr法快速评价哺乳动物细胞质量的试剂盒，所述试剂盒中包括核苷酸序列如seq id no：1～12所示的引物。
52.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒中还包括taq pro multiplex dna聚合酶。
53.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒中还含有2
×
multiplex缓冲液。
54.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述2
×
multiplex缓冲液包括：酶反应buffer、2mm dntps和25mm mgso4。
55.本发明同时提供一种pcr法快速评价哺乳动物细胞质量的检测方法，所述检测方法采用核苷酸序列如seq id no：1～12所示的引物进行pcr检测。
56.作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述pcr反应可采用标准程序，所述标准程序条件为：预变性95℃30sec～5min；变性95℃30sec；退火60℃90sec；延伸72℃60sec；彻底延伸72℃10min；循环数：30-34。
57.作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述pcr反应可采用快速程序，所述快速程序条件为：预变性95℃30sec；变性95℃15sec；退火60℃30sec；延伸72℃30sec；彻底延伸72℃5min；循环数：25-30。
58.本发明的有益效果：
59.1.检测时间短，能快速得出结果；
60.2.能得出准确对感染的细菌、支原体或细胞交叉感染类型或者细胞生长状况(端粒长度)及性别，方便进行后续实验处理或防护；
61.3.已设计试剂盒，实验检测简单方便；
62.4.检测范围广，可对多项可能污染细胞的类型进行检测；
63.5.减少污染或假阳性的可能；
64.6.选择了普遍可能污染细胞的类型中保守性较高的片段作为引物；
65.7.可对细胞物种和类型进行检测(可选择性添加性别鉴定引物)。
附图说明
66.图1为支原体检测结果图；m：dna2000 marker；1：pk-15细胞阳性对照；2：hela细胞阳性对照；3：bmscs；4-5：thp-1细胞；6：培养thp-1细胞所用的完全培养液；7：hyclone 1640培养基；8：hyclone澳洲胎牛血清；9：空白对照。
67.图2为细菌检测结果的1.5％琼脂糖电泳图；泳道m：dl2000 dna marker；泳道1：样品扩增产物；泳道2：阳性对照扩增产物；泳道3：阴性对照扩增产物；泳道m：dl2000 dna marker。
68.图3为样品种类的鉴定图；m：marker。从上到下的大小分别为700、600、500、400、300、200和100bp。1484：未检测到条带，它不是我们测试的九个物种之一(homo sapiens 391bp,cricetulus griseus315bp,macaca mulatta287bp,cercopithecus aethiops222bp,rattus norvegicus196bp,canis familiaris172bp,mus musculus150bp,bos taurus102bp,ic 70bp)。1485：该样本暂时为人。
69.图4为细胞端粒长度检测结果图。
70.图5为引物位置图。
71.图6为性别鉴定电泳图。
具体实施方式
72.为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
73.实施例1
74.本实施例提供一种通过pcr法快速评价哺乳动物细胞质量的方法，本发明选取的引物扩增的产物为：
[0075][0076]
所采用的引物序列为：
[0077][0078][0079]
一、检测方法
[0080]
吸取thp-1细胞的培养液上清，加到pcr反应体系中。所用的酶为东洋纺的taq pro multiplex dna聚合酶。pcr反应体系中各成分的具体含量为：2
×
multiplex缓冲液；pcr反应条件如下表所示：
[0081]
标准程序：
[0082][0083]
快速程序：
[0084]
[0085]
注：
[0086]
a.多数情况下，使用默认退火温度即可。如扩增效果不佳，可通过退火温度梯度实验来摸索最适退火温度；快速程序会损失部分扩增产量，初次扩增建议采用标准程序。
[0087]
b.预变性时间可根据不同模板类型进行调整。提取的核酸，预变性时间为30sec；全血、血卡等直扩时，可适当将预变性时间延长至5min。
[0088]
c.扩增低拷贝模板、长片段或者扩增片段较多时，可适当延长退火时间至3min以提高扩增效率。
[0089]
d.延伸时间以最长片段为准。然而，延伸时间太长会导致非特异性扩增增多，可通过缩短延伸时间来提高扩增特异性。
[0090]
e.微量样本扩增时，可通过增加循环数提高扩增产物量。然而，循环数太多会导致非特异性扩增增多，可通过减少扩增循环数来提高扩增特异性。
[0091]
二、检测结果
[0092]
(1)支原体检测结果如图1所示，本发明所采用的引物序列能同时鉴别12种支原体，扩增大小在261～576之间(下面列出供参考，具体是什么以测序结果为准)：
[0093]
人型支原体：261
[0094]
关节炎支原体：262
[0095]
唾液支原体：295
[0096]
精氨酸支原体：300
[0097]
口腔支原体：316
[0098]
溶脲脲原体：300
[0099]
发酵支原体：391
[0100]
溶神经支原体：393
[0101]
猪肺炎支原体：250
[0102]
猪鼻支原体：300
[0103]
肺支原体：576
[0104]
莱氏无胆甾原体：400
[0105]
(2)细菌检测结果如图2所示，表明样品是否有细菌污染。用16s引物进行扩增，有条带样品为细菌污染，没有则没有细菌污染。
[0106]
(3)细胞交叉污染结果如图3所示，表明样品物种鉴别。人：391，小鼠：150。
[0107]
(4)端粒酶长度检测：在凝胶电泳上显示相隔6bp的梯状条带，条带的多、寡、深或浅表示端粒酶活性的大小。
[0108]
kim于1994年借助pcr技术建立了灵敏的端粒酶检测方法—端粒重复片段扩增(telomeraserepeatamplificationprotocol，trap)。本产品是在其方法的基础上，进行适当改良，开发出来的研究用试剂盒。本品与通常的端粒酶活性测定法相比较，具有以下特征：
[0109]
·
端粒酶提取液在同一管里进行pcr扩增，提高了检测的准确性。
[0110]
·
优化了引物设计，使pcr效果进一步提高。
[0111]
(5)性别鉴定结果如图4所示，表明性别产物片段长短不等，y基因的片段为218，x基因的片段为106。
[0112]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保
护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。