一种纳米粒复合水凝胶及其制备方法和防脱发生发应用与流程

1.本发明属于护发产品技术领域，更具体地，涉及一种纳米粒复合水凝胶及其制备方法和防脱发生发的应用。


背景技术：

2.随着社会的发展，人们的生活、工作压力越来越大，脱发、掉发的现象愈发严重。脱发不仅会影响仪容仪表，还会造成一定的身心压力。现代生物医药科学通过研究发现脱发多是由油脂分泌旺盛，头皮炎症，营养供给不足等原因导致的，因此一般通过调节头皮微环境、抑菌消炎、促进营养吸收等治疗脱发。尽管市场上已有基于上述功效的护发育发产品，但一般是分瓶包装使用，无法一体化联合发挥功效，且产品在头皮滞留时间较短，增加了消费者使用的繁琐感。因此，防脱和生发产品要兼顾以上各个方面才能具有良好的效果。


技术实现要素：

3.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种纳米粒复合水凝胶及其防脱发和生发的应用和制备方法，本发明提供的纳米粒复合水凝胶可一体化发挥调节头皮微环境、抑菌消炎、促进营养吸收的功效，可有效突释抑菌消炎药物，抑菌消炎、调节头皮微环境，同时复配的透明质酸负载干细胞因子纳米粒通过缓释干细胞因子，有效促进毛发再生，缩短生发育发时间，且该复合水凝胶具有生物相容性，安全有效。
4.本发明的首要目的是提供一种纳米粒复合水凝胶。
5.本发明的另一目的在于提供所述纳米粒复合水凝胶在制备防脱发和生发用品方面的应用。
6.本发明的再一目的是提供所述纳米粒复合水凝胶的制备方法以及该方法制备得到的纳米粒复合水凝胶在作为或制备防脱育发产品中的应用。
7.本发明的最后一目的在于提供一种用于防脱发和生发的纳米粒复合水凝胶及其制备方法。
8.本发明为了实现上述目的，采用了以下技术方案：本发明提供了一种纳米粒复合水凝胶，包含以下质量百分比的各组分：水凝胶1%～3%、活性成分0.1%～0.3%、透明质酸负载干细胞因子纳米粒1%～5%、羧基活化剂0.5%～2%、交联剂2%～4%、余量水；其中，所述透明质酸负载干细胞因子纳米粒的制备方法为：以甲基丙烯酰化透明质酸（hama）、甲基丙烯酰化肝素（hepma）和光引发剂分散在水中，获得混合体系作为分散相；以蓖麻油作为连续相；然后利用微流控装置将分散相和连续相分别注入微通道，在注射泵推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴，收集获得 w/o 乳液；最后将w/o乳液在紫外光下进行照射，制得透明质酸纳米微球；将透明质酸纳米微球浸泡在脐带干细胞培养液上清液中，得到透明质酸负载干细胞因子纳米粒。
9.优选地，所述水凝胶包括透明质酸水凝胶、胶原蛋白、肝素、明胶、硫酸软骨素中的
一种或几种；所述羧基活化剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺；所述交联剂包括两端氨基化的聚乙二醇。
10.优选地，透明质酸负载干细胞因子纳米粒的制备方法中，所述甲基丙烯酰化透明质酸与甲基丙烯酰化肝素的质量比为1：（1～10）。
11.优选地，所述混合体系中甲基丙烯酰化透明质酸相对水的质量浓度为0.5%～2%；所述混合体系中甲基丙烯酰化肝素相对水的质量浓度为1%～10%；所述光引发剂相对水的质量分数为0.125%～0.25%。
12.优选地，所述连续相在微通道的流速控制在10～20ml/h；分散相在微通道的流速控制在1～5 ml/h。通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。
13.优选地，所述微流控装置选用双通道注射泵，芯片选用的是t型通道微流控芯片，连续相入口是点胶针头，0.8 mm，分散相入口是毛细管，外径是1 mm，内径是0.58 mm。
14.优选地，所述紫外光的照射功率为20～40mw cm-2
；紫外光的波长为365～405 nm；照射时间为30～120 s。
15.优选地，所述将透明质酸纳米微球浸泡在脐带干细胞培养液上清液中的时间为24～30h。进一步地，控制在35～37℃条件下将透明质酸纳米微球浸泡在脐带干细胞培养液上清液中。
16.最优选地，所述透明质酸负载干细胞因子纳米粒与水凝胶的质量比为5：3。
17.最优选地，所述纳米粒复合水凝胶包含以下质量百分比的各组分：水凝胶3%，活性成分0.3%，透明质酸负载干细胞因子纳米粒5%，羧基活化剂1%，交联剂3%，水87.7%。
18.优选地，所述羧基活化剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺；所述交联剂包括两端氨基化的聚乙二醇。
19.本发明通过对水凝胶、活性成分和透明质酸负载干细胞因子纳米粒进行精准配伍，获得的纳米粒复合水凝胶可一体化发挥调节头皮微环境、抑菌消炎、促进营养吸收的联合功效。本发明纳米粒复合水凝胶具有良好的生物相容性，且能改变药物的传递和释放方式，可有效突释抑菌消炎药物等活性成分，抑菌消炎，快速在施药部位形成良好抑菌环境，且透明质酸负载干细胞因子纳米粒可缓释干细胞因子，在活性成分制造的抑菌环境下可有效促进施药部位对于干细胞因子营养成分的吸收。且本发明提供的纳米粒复合水凝胶具有优异的保湿性、抗菌性和营养性，该水凝胶对细胞粘附和增殖有明显的促进作用，能充分发挥联合育发生发功效，快速促进毛发的再生。
20.因此，上述纳米粒复合水凝胶在制备防脱发和生发用品方面的应用也应在本发明的保护范围内。优选地，所述纳米粒复合水凝胶采用的活性成分为抑菌消炎组分，如单宁酸、苯扎溴铵、姜黄素或黄连提取物中的一种或几种。在本发明优选的实施例中，所述抑菌消炎组分为单宁酸。
21.本发明还提供上述纳米粒复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：将活性成分溶解于水凝胶溶液中得到水凝胶/活性成分混合溶液，后将透明质酸负载干细胞因子纳米粒均匀分散于水凝胶/活性成分混合溶液中，再向其中加入羧基活化剂反应，最后向其中加入交联剂反应，经后处理即得所述纳米粒复合水凝胶。
22.优选地，所述纳米粒复合水凝胶的制备方法中，所述加入羧基活化剂反应为静置
反应≥0.5小时。在本发明一些优选的实施例中，所述加入羧基活化剂静置反应的时间为0.5～2小时。在该反应时间下可充分活化水凝胶和透明质酸负载干细胞因子纳米粒中的羧基基团。
23.优选地，所述纳米粒复合水凝胶的制备方法中，所述加入交联剂反应为静置反应≥1小时。在本发明一些优选的实施例中，所述加入交联剂静置反应的时间为1～5小时。在该反应时间下，交联剂与水凝胶及透明质酸负载干细胞纳米粒交联反应完全。
24.优选地，所述后处理为采用60wt%～90wt%乙醇溶液浸洗3～5次。
25.此外，本发明还请求保护以上方法制备得到的纳米粒复合水凝胶在作为或制备防脱育发产品中的应用。所述防脱育发产品可以为护理液、滋养液、精华或进一步制备成为膏状产品等。
26.对此，本发明提供了一种用于防脱发和生发的纳米粒复合水凝胶，以质量百分比计，由以下原料制成：水凝胶1%～3%，抑菌消炎组分0.1%～0.3%，透明质酸负载干细胞因子纳米粒1%～5%，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺0.5%～2%，聚乙二醇2%～4%，余量水；所述抑菌消炎组分包括单宁酸、苯扎溴铵、姜黄素或黄连提取物中的一种或几种。
27.具体的，所述用于防脱发和生发的纳米粒复合水凝胶的制备方法为：s1.室温下制备水凝胶溶液；s2.将抑菌消炎组分溶解在水凝胶溶液中以形成水凝胶/抑菌消炎组分混合溶液；s3.将透明质酸负载干细胞因子纳米粒分散于水凝胶/抑菌消炎组分混合溶液中形成水凝胶/抑菌消炎组分/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液；s4.向所述水凝胶/抑菌消炎组分/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，混合均匀，静置，优选静置0.5小时以上；s5.向s4获得的溶液中加入聚乙二醇，混合均匀，移至模具中，静置、洗涤，得到用于防脱发和生发的纳米粒复合水凝胶。所述静置的时间优选1小时以上。
28.在本发明优选的实施例中，所述水凝胶为透明质酸水凝胶。透明质酸作为一种天然的生物活性分子，是水凝胶理想的基质材料，透明质酸具有可生物降解、生物相容性强等优点，另外其能增强细胞粘附和增殖。采用透明质酸水凝胶与本发明所述透明质酸负载干细胞因子纳米粒具有很好地协同适配性。
29.本发明上述纳米粒复合水凝胶结合特定的制备工艺，通过控制抑菌消炎等活性成分、羧基活化剂、交联剂的添加顺序，以及控制合适的反应时间，得到质地均匀、成型性好的水凝胶，且可均匀负载干细胞因子纳米粒，有利于抑菌消炎药物以合适的速率和时间释放，以及干细胞因子的缓释。
30.该防脱发和生发的纳米粒复合水凝胶中，水凝胶作为基质，抑菌消炎组分、纳米粒和两端氨基化的聚乙二醇相互连结分散在水凝胶基质上。基质水凝胶具备特殊的三维网络结构，能有效保持使用环境的湿润，同时其作为平台复配活性成分和负载干细胞因子纳米粒，形成多功能型的纳米粒复合水凝胶。其中水凝胶平台可有效以合适的速率和时间释放抑菌消炎药物等活性成分，达到快速抑菌、消炎的目的，复配的负载干细胞因子纳米粒具有较高的比表面积、细胞穿透能力以及缓控释性能，可以长期缓释负载物，长效发挥育发生发功效。
31.优选地，所述洗涤为采用60wt%～90wt%乙醇溶液浸洗3～5次。
32.优选的，上述聚乙二醇为两端氨基化的聚乙二醇。
33.本发明的有益效果为：本发明通过对水凝胶、抑菌消炎活性成分和透明质酸负载干细胞因子纳米粒进行精当配伍，获得的纳米粒复合水凝胶可一体化发挥调节头皮微环境、抑菌消炎、促进营养吸收的联合功效。本发明纳米粒复合水凝胶具有良好的生物相容性，且能改变药物的传递和释放方式，可有效地以合适的速率和时间释放抑菌消炎药物，能够兼顾快速处理头皮的炎症环境和避免头皮刺激，抑菌消炎、调节头皮微环境，同时透明质酸负载干细胞因子纳米粒缓释干细胞因子，在抑菌环境下可有效促进施药部位对于干细胞因子营养成分的吸收，快速促进毛发的再生，且该水凝胶对细胞粘附和增殖有明显的促进作用，能充分发挥联合育发生发功效。
附图说明
34.图1为透明质酸纳米粒复合水凝胶的制备流程示意图。
35.图2制备失败的透明质酸纳米粒复合水凝胶状态图。
36.图3制备成功的透明质酸纳米粒复合水凝胶状态图。
37.图4为透明质酸纳米粒复合水凝胶的显微镜图。
38.图5为透明质酸纳米粒复合水凝胶中单宁酸的长期释药率。
39.图6为透明质酸纳米粒复合水凝胶中单宁酸的短期释药率。
40.图7为水凝胶样品上的表皮葡萄球菌细菌总数图。
41.图8为nih 3t3细胞在水凝胶样品上的存活率图。
42.图9为nih 3t3细胞在水凝胶样品上黏附及增殖的共聚焦成像图。
43.图10为脱毛黑鼠凝胶护理后的生发图。
具体实施方式
44.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
45.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
46.其中，脐带干细胞来源：购于浙江清华长三角研究院杭州分院细胞药物转化公共服务平台；nih 3t3细胞来源：购于中国科学院上海细胞库。
47.为方便理解本发明防脱发和生发的纳米粒复合水凝胶的制备原理，绘制以透明质酸作为水凝胶的纳米粒复合水凝胶流程示意图如图1，从图中可以看出，透明质酸水凝胶作为基质分散抑菌消炎组分，同时与负载干细胞因子的纳米粒（透明质酸负载干细胞因子纳米粒）通过两端氨基化的聚乙二醇交联连接。
48.实施例1 防脱发和生发的纳米粒复合水凝胶及其制备1、按照如下步骤制作透明质酸负载干细胞因子纳米粒（1）甲基丙烯酰化透明质酸（hama）的合成精密称量500 mg透明质酸溶解于45ml的 dmf/h2o (1/2，v/v)混合溶剂中，待透明质酸完全溶解后，使用3m的naoh调节溶液的ph至8～9，然后在剧烈搅拌条件下，缓慢滴加
4ml甲基丙烯酸酐，在冰水浴中使反应进行24 h，ph值在整个过程中一直维持在8～9之间。反应结束后，将反应液倒入500 ml的乙醇中进行醇沉，-20℃过夜。醇沉结束后使用离心机在5000 rpm速度下离心10 min，收集hama沉淀产物，然后将hama沉淀物复溶于水，使用3500 da的透析袋透析2天，冷冻干燥得到纯hama产物，-20℃保存。
49.（2）甲基丙烯酰化肝素（hepma）的合成精密称量500 mg肝素溶解于25ml的h2o中，待肝素完全溶解后，使用3m的naoh调节溶液的ph至8～9，然后在剧烈搅拌条件下，缓慢滴加4 ml甲基丙烯酸酐，在冰水浴中使反应进行24 h，ph值在整个过程中一直维持在8～9之间。反应结束后，将反应液倒入500 ml的乙醇中进行醇沉，-20℃过夜。醇沉结束后使用离心机在5000 rpm速度下离心10 min，收集hepma 沉淀产物，然后将hepma沉淀物复溶于水，使用3500da的透析袋透析2天，冷冻干燥得到纯hepma产物，-20℃保存。
50.（3）将（1）得到的hama加水配制成1wt%的hama溶液，同时复配加入相对水质量的1 wt%的hepma，相对水质量的0.25 wt%的lap（光引发剂）后，混匀，获得混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相；然后利用微流控装置将分散相和连续相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制1 ml/h流速注射，连续相控制14 ml/h流速注射。收集的w / o乳液在25 mw cm-2
的uv光（405 nm）中暴露60 s后聚合制得透明质酸纳米微球；将透明质酸纳米微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将透明质酸纳米微球冻干，保存至-20℃。
51.其中，所述微流控装置选用双通道注射泵，芯片选用的是t型通道微流控芯片，连续相入口是点胶针头，0.8 mm，分散相入口是毛细管，外径是1 mm，内径是0.58 mm。
52.（4）上述制备所得透明质酸纳米微球的表征：1）测试所得透明质酸纳米微球的溶胀率结果为1500%（5分钟）、1514%（20分钟）（测试方法：取一定质量的冻干透明质酸纳米微球样品，记下质量为 w，并将样品放置到离心管中进行实验。在 0min 称量样品 离心管的质量为 w0。将样品浸泡在 pbs 中并放置到 37℃，100 rpm/min 的环境中， 在一定时间点，吸干水分并称重，记为 w
t
。每组至少三个平行实验，根据公式计算出溶胀率（sr），透明质酸钠米微球的溶胀率使用下列公式计算： 溶胀率（sr）=（w
t-w0）/w
×
100% ）。
53.2）所得透明质酸纳米微球的压缩模量为74.30 kpa (测试方法：直接将与制备透明质酸纳米微球相同的原料添加到模具中制备出 10mm
×
5mm 圆柱形水凝胶，使用万能试验机进行压缩。将样品分别放置到试验机平台上，以 1 mm/min的固定应变率执行压缩测试，并使用 250 n 的称重传感器测量施加的载荷，根据测量的应力-应变曲线，计算出其弹性模量)。
54.（5）取（3）所得冻干透明质酸纳米微球10 mg浸泡在1.5 ml脐带干细胞培养液上清中，在37℃条件下浸泡24 h以充分吸附脐带干细胞上清中的生长因子，得到透明质酸负载干细胞因子纳米粒。
55.（6）上述制备所得透明质酸负载干细胞因子纳米粒的表征：透明质酸负载干细胞因子纳米粒中生长因子能力测试中，吸附蛋白量为416微克（测试方法：吸附后的水凝胶微球分别用纯水（1ml）洗 1 次、pbs（1ml）洗 1 次、0.5m nacl
（1ml）洗 1 次、1m nacl（1ml）洗 1 次、5m nacl （1ml）洗 1 次。每次均洗脱 1 h， 每步均需收集洗脱液，然后收集的洗脱液直接使用 bca 试剂盒检测蛋白含量）。
56.、按照如下质量百分比称量纳米粒复合水凝胶原料：样品a：透明质酸1%，单宁酸0.2%，透明质酸负载干细胞因子纳米粒1%，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（edc）0.5%，两端氨基化的聚乙二醇4%，水93.3%。
57.样品b：明胶3%，姜黄素0.3%，透明质酸负载干细胞因子纳米粒2%，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（edc）1%，两端氨基化的聚乙二醇2%，水91.7%。
58.样品c：胶原蛋白2%，黄连提取物0.2%，透明质酸负载干细胞因子纳米粒5%，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（edc）0.5%，两端氨基化的聚乙二醇3%，水89.3%。
59.样品d：肝素1%，姜黄素0.2%，透明质酸负载干细胞因子纳米粒1%，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（edc）1%，两端氨基化的聚乙二醇4%，水92.8%。
60.样品e：硫酸软骨素3%，黄连提取物0.1%，透明质酸负载干细胞因子纳米粒3%，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（edc）2%，两端氨基化的聚乙二醇2%，水89.9%。
61.、纳米粒复合水凝胶的制备（1）纳米粒复合水凝胶a制备：将样品a中原料组分，按照下列先后顺序步骤制备 s1.室温下将透明质酸溶解在水中制备水凝胶溶液；s2.将单宁酸溶解在水凝胶溶液中得到透明质酸/单宁酸混合溶液；s3.将透明质酸负载干细胞因子纳米粒均匀分散于透明质酸/单宁酸混合溶液中，得到透明质酸/单宁酸/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液；s4.向透明质酸/单宁酸/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，混合均匀，静置0.5小时；s5.向步骤s4获得的溶液中加入两端氨基化的聚乙二醇，混合均匀，静置1小时，75wt%乙醇洗涤5次，得到纳米粒复合水凝胶a，得到的纳米复合水凝胶可以成型，且透明质酸负载干细胞因子纳米粒均匀分布在水凝胶基质上。
62.（2）纳米粒复合水凝胶b制备：将样品b中原料组分，按照下列先后顺序步骤制备： s1.室温下将明胶溶解在水中制备水凝胶溶液；s2.将姜黄素溶解在水凝胶溶液中得到明胶/姜黄素混合溶液；s3.将透明质酸负载干细胞因子纳米粒均匀分散于明胶/姜黄素混合溶液中，得到明胶/姜黄素/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液；s4.向明胶/姜黄素/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，混合均匀，静置1小时；s5.向步骤s4获得的溶液中加入两端氨基化的聚乙二醇，混合均匀，静置3小时以上，60wt%乙醇洗涤3次，得到纳米粒复合水凝胶b，得到的纳米复合水凝胶可以成型，且透明质酸负载干细胞因子纳米粒均匀分布在水凝胶基质上。
63.（3）纳米粒复合水凝胶c制备：依照上述样品c原料组成，按照下列先后顺序步骤制备：将样品c中原料组分，按照下列先后顺序步骤制备： s1.室温下将胶原蛋白溶解在
水中制备水凝胶溶液；s2.将黄连提取液溶解在水凝胶溶液中得到胶原蛋白/黄连提取物混合溶液；s3.将透明质酸负载干细胞因子纳米粒均匀分散于胶原蛋白/黄连提取物混合溶液中，得到胶原蛋白/黄连提取物/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液；s4.向胶原蛋白/黄连提取物/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，混合均匀，静置1小时；s5.向步骤s4获得的溶液中加入两端氨基化的聚乙二醇，混合均匀，静置5小时以上，90wt%乙醇洗涤5次，得到纳米粒复合水凝胶c，得到的纳米复合水凝胶可以成型，且透明质酸负载干细胞因子纳米粒均匀分布在水凝胶基质上。
64.（4）依照上述样品d、e原料组成，依照上述纳米粒复合水凝胶b的制备方法，分别添加d、e中相应的组分，可以制备得到纳米粒复合水凝胶d和e，得到的纳米复合水凝胶可以成型，且透明质酸负载干细胞因子纳米粒均匀分布在水凝胶基质上。
65.对比例1将实施例1中样品a中原料组分，按照下列先后顺序步骤制备（改变步骤s1和s2的顺序）：s1.室温下将单宁酸溶解在水中制备单宁酸溶液；s2.将透明质酸溶解在单宁酸溶液中得到透明质酸/抑菌消炎组分混合溶液；s3.将透明质酸负载干细胞因子纳米粒分散于透明质酸/抑菌消炎组分混合溶液中，得到透明质酸/单宁酸/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液；s4.向透明质酸/单宁酸/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，混合均匀，静置0.5小时；s5.向步骤s4获得的溶液中加入两端氨基化的聚乙二醇，混合均匀，静置1小时，75wt%乙醇洗涤5次，依照上述步骤，样品a原料无法形成均匀扩散体系，无法得到均一的纳米粒复合水凝胶，可能是抑菌消炎组分的在先溶解，其溶液的黏连状态不易于透明质酸水凝胶的均匀复配，进而不利于后续均一的纳米粒复合水凝胶的形成。
66.对比例2将实施例1中样品a中原料组分，按照下列先后顺序步骤制备（改变步骤s4和s5中聚乙二醇和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的投放顺序）：s1.室温下将透明质酸溶解在水中制备水凝胶溶液；s2.将单宁酸溶解在水凝胶溶液中得到透明质酸/单宁酸混合溶液；s3.将透明质酸负载干细胞因子纳米粒均匀分散于透明质酸/单宁酸混合溶液中，得到透明质酸/单宁酸/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液；s4.向透明质酸/单宁酸/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液中加入两端氨基化的聚乙二醇，混合均匀，静置1小时；s5.向s4所得溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，混合均匀，静置0.5小时，75wt%乙醇洗涤5次，样品a无法形成均匀扩散体系，无法得到纳米粒复合水凝胶；其原因是两端氨基化的聚乙二醇的先加入使得溶液体系粘稠度发生变化，影响了后加入的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺对透明质酸中羧基的活化效率。
67.对比例3
将实施例1中样品a中原料组分，按照下列先后顺序步骤制备（缩短步骤s4静置时间为0.2小时）：s1.室温下将透明质酸溶解在水中制备水凝胶溶液；s2.将单宁酸溶解在水凝胶溶液中得到透明质酸/抑菌消炎组分混合溶液；s3.将透明质酸负载干细胞因子纳米粒均匀分散于透明质酸/抑菌消炎组分混合溶液中，得到透明质酸/单宁酸/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液；s4.向透明质酸/单宁酸/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，混合均匀，静置0.2小时；s5.向步骤s4获得的溶液中加入两端氨基化的聚乙二醇，混合均匀，静置1小时，75wt%乙醇洗涤5次，依照上述步骤，样品a原料不成型，无法形成均匀扩散体系，无法得到纳米粒复合水凝胶。
68.对比例4将实施例1中样品a中原料组分，按照下列先后顺序步骤制备（缩短步骤s4的静置时间为50分钟）：s1.室温下将透明质酸溶解在水中制备水凝胶溶液；s2.将单宁酸溶解在水凝胶溶液中得到透明质酸/抑菌消炎组分混合溶液；s3.将透明质酸负载干细胞因子纳米粒均匀分散于透明质酸/抑菌消炎组分混合溶液中，得到透明质酸/单宁酸/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液；s4.向透明质酸/单宁酸/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，混合均匀，静置0.5小时；s5.向步骤s4获得的溶液中加入两端氨基化的聚乙二醇，混合均匀，静置50分钟，75wt%乙醇洗涤5次，依照上述步骤，样品a原料不成型，无法形成均匀扩散体系，两端氨基化的聚乙二醇与透明质酸水凝胶及透明质酸负载干细胞纳米粒中活化的羧基反应不完全，无法得到纳米粒复合水凝胶。
69.实施例2 不同原料配比对纳米粒复合水凝胶的影响1、纳米粒复合水凝胶原料按照表1-3的用量配比分别称取水凝胶样品1-27的各原料。
70.表1 纳米粒复合水凝胶样品1-9
表2 纳米粒复合水凝胶样品10-18表3 纳米粒复合水凝胶样品19-272、纳米粒复合水凝胶样品的制备（1）纳米粒复合水凝胶样品1-18的制备方法为：s1.室温下，将透明质酸溶解在水中，形成均匀透明质酸溶液；s2.将单宁酸溶解在透明质酸溶液中以形成透明质酸/单宁酸混合溶液；s3.将透明质酸负载干细胞因子纳米粒分散于透明质酸/单宁酸混合溶液中形成透明质酸/单宁酸/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液；s4.向所述透明质酸/单宁酸/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，混合均匀，静置，静置时间为0.5小时；s5.向s4获得的溶液中加入两端氨基化的聚乙二醇，混合均匀，移至模具中，静置，静置时间为1小时，然后用75wt%乙醇溶液浸洗3次，得到纳米粒复合水凝胶样品；（2）纳米粒复合水凝胶样品19-27的制备方法与纳米粒复合水凝胶样品1-18的区别在于：步骤s4的静置时间为2小时；步骤s5静置时间为5小时，然后用75wt%乙醇溶液浸洗5次。
71.3、纳米粒复合水凝胶成型性以及透明质酸负载干细胞因子纳米粒分散性能
（1）透明质酸负载干细胞因子纳米粒分散性能测试方法：倒置容器，观察制成品是否粘挂于容器底部来判断凝胶是否成型；通过显微镜观察透明质酸负载干细胞因子纳米粒在水凝胶的分布是否均匀来判断其均匀情况；显微镜下透明质酸负载干细胞因子纳米粒连续排列，显微视野无大面积区域有凝胶无透明质酸负载干细胞因子纳米粒的区域，可以认为透明质酸负载干细胞因子纳米粒分布均匀，既满足制成品成型，又满足透明质酸负载干细胞因子纳米粒则可以判定为制成了本纳米粒复合水凝胶。
72.（2）测定结果表4纳米粒复合水凝胶样品1-27的成型及分散是否均匀结果
样品凝胶是否成型透明质酸负载干细胞因子纳米粒分散效果样品凝胶是否成型透明质酸负载干细胞因子纳米粒分散效果1是均匀15是均匀2是均匀16是均匀3否不均匀17是均匀4是均匀18是均匀5是均匀19是均匀6否不均匀20是均匀7是均匀21是均匀8是均匀22是均匀9否不均匀23是均匀10是均匀24是均匀11是均匀25是均匀12是均匀26是均匀13是均匀27是均匀14是均匀
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从表4可以看到，当透明质酸纳米粒的加入量与透明质酸水凝胶用量超过3:1时（即样品3、样品6和样品9），透明质酸/抑菌消炎组分/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合溶液凝胶化状态不明显，体系不能形成一体化水凝胶，其原因是由于纳米粒的用量过多时，水凝胶中没有充足的透明质酸大分子与之交联，导致体系不够稳定，以样品3为例，如图2所示，将其置于容器中，容器倾斜时，复合水凝胶也随之发生液体倾斜。
73.其他比例均可制备得到透明质酸/抑菌消炎组分/透明质酸负载干细胞因子纳米粒复合水凝胶（纳米粒复合水凝胶），得到的纳米复合水凝胶成型性好，以样品27为例，如图3所示，将其置于容器中，在容器倒置时仍能整体黏附于容器底部，其显微镜下状态如图4所示，从图中可以看到透明质酸纳米粒分布均匀稳定。
74.实施例3纳米粒复合水凝胶的释药行为1、实验方法将实施例2制备的纳米粒复合水凝胶样品27、样品3分别置放于pbs缓冲液中，将混合体系转移到透析袋（3500kd）中，用棉绳扎紧口部；透析袋放置在含10倍体积pbs的ep管里，在37℃、100rpm恒温摇床里振荡，分别于30min、1h、3h、5h、7h、12h、24h吸取3ml释放液，同时补加同温度的缓冲液3ml；收集标记各个时间点的释放液，用紫外分光光度计测量吸收值；根据标准曲线计算单宁酸的累计释放率。
75.将纳米粒复合水凝胶样品27、样品3分别置放于pbs缓冲液中，将混合体系转移到透析袋（3500kd）中，用棉绳扎紧口部。透析袋放置在含10倍体积pbs的ep管里，在37℃、100rpm恒温摇床里振荡，分别于1天、2天、3天、4天、5天、6天、7h吸取3ml释放液，同时补加同温度的缓冲液3ml。收集标记各个时间点的释放液，用bca试剂盒测量蛋白吸收值，根据标准曲线计算活性因子的累计释放率。
76.、实验结果纳米粒复合水凝胶样品27对单宁酸的释药率见图5、图6，从图中可看出，水凝胶对单宁酸的释放速率和时间恰到好处，在24小时内可释放95%单宁酸；纳米粒对活性因子有缓释的效果，7天内的释放量逐渐递增至80%。纳米粒复合水凝胶的凝胶突释和纳米粒缓释的联合释药行为有利于该复合凝胶前期迅速释放抑菌消炎组分，快速处理头皮的炎症环境；后期长效缓释活性因子，逐步调理毛囊，从而促进头皮环境的康复和新生毛发的生长。而样品3在透析袋中1小时便开始解体成小块状，沉降于透析袋底部，单宁酸在3小时左右已经近完全释放。这种急促的突释会产生短时间内头皮局部药物浓度过高，从而刺激头皮，引发不良反应。
77.实施例4纳米粒复合水凝胶的抑菌实验1、实验方法选取实施例2部分样品以及样品0和阴性对照，研究各样品对表皮葡萄球菌（atcc12228）的抑菌效果。
78.（1）实验分组样品0为透明质酸3%，单宁酸0%，透明质酸负载干细胞因子纳米粒3%，edc1%，两端氨基化的聚乙二醇3%，超纯水90%组成的混合溶液。
79.阴性对照为将20μl细菌悬浮液（105cfuml-1
，50%lb培养基）加入2mlpbs中以获得均匀溶液。
80.抑菌组1：样品1，2，3，评估当复合水凝胶体系中透明质酸以及单宁酸用量一致时，纳米粒的添加量对抑菌效果的影响；抑菌组2：选取样品5，14，23，评估纳米粒和单宁酸添加量不变时，水凝胶中透明质酸的用量对抑菌效果的影响；抑菌组3：选取样品12，15，18，评估水凝胶透明质酸用量和纳米粒添加量不变时，单宁酸添加量对抑菌效果的影响；抑菌组4：选取样品13，17，27，评估水凝胶透明质酸用量不变时，单宁酸和纳米粒添加量对抑菌效果的影响。
81.（2）实验方法无菌条件下，将200μl各样品制备于24孔板每孔中。将20μl细菌悬浮液（105cfuml-1
，50%lb培养基）加入到水凝胶盘的表面上。接下来，将该24孔板在37℃下在相对湿润的气氛中放入培养箱中孵育。在2小时后，向每个孔中加入2ml灭菌的pbs以重新悬浮所有存活的细菌。将菌悬液稀释100倍后取100μl均匀涂布于凝固的营养琼脂培养基平板表面，在37℃温育12小时后拍照；每组重复测试三次。
82.、实验结果各样品的抑菌结果如图7所示，从图中可以看到，当固定单宁酸用量，改变透明质酸水凝胶或透明质酸纳米粒用量时，复合水凝胶对表皮葡萄球菌均有一定的抑菌作用，但是抑菌效果受透明质酸水凝胶或透明质酸纳米粒用量改变的影响不大；而固定透明质酸水凝胶或透明质酸纳米粒用量，逐步提升单宁酸用量时，复合水凝胶对表皮葡萄球菌的抑菌效果也持续升高。结果表明纳米复合水凝胶中的抗菌消炎组分对于抑菌效果起到重要作用；本发明的各纳米粒复合水凝胶对表皮葡萄球菌具有良好的抑菌效果，水凝胶及透明质
酸负载干细胞因子纳米粒的添加不会过度影响抗菌消炎组分的效果，且随着抑菌消炎组分的浓度增加带来复合水凝胶抑菌效果的提升，样品27在2小时内抑菌率可达99%。
83.实施例5 纳米粒复合水凝胶的细胞毒性实验1、实验方法（1）实验分组选取实施例2中纳米粒复合水凝胶样品15、样品27，研究其是否有细胞毒性以及对于细胞的增殖是否有影响。
84.具体的，样品15、样品27这两种纳米粒复合水凝胶样品的细胞毒性用nih 3t3细胞存活率测定；对照组不添加样品，作为对比。
85.（2）细胞毒性测试方法首先将nih 3t3细胞以5000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中并培养24 h；之后将冻干后的凝胶浸泡于含有10% fbs的dmem培养基中，将100 μl的各样品浸泡液加入到培养板孔中，并在培养板中留出无添加样品的细胞对照孔，然后分别在培养箱中培养1/3/7天。待培养结束后，小心移除培养板中的溶液，加入100 μl的mtt的磷酸盐缓冲液溶液（0.5 mg/ml），在37 ℃湿润环境中培育4 h，弃去孔中的mtt，各加入100 μl dmso并在室温下振荡1 min混合均匀，之后用酶标仪记录570 nm处的吸光值。每组重复测试6次。细胞相对存活率(%)d用以下公式计算：d = （b1/b2）
×
100%其中b1为添加样品测得的吸光值；b2为未添加样品测得的吸光值2、实验结果细胞毒性测试结果如图8所示，结果表明，本发明纳米粒复合水凝胶样品15、样品27对nih 3t3细胞无明显的细胞毒性，且具有一定促进3t3细胞增殖的效果，一周后细胞的存活率接近初始生存率的4倍。
86.实施例6 纳米粒复合水凝胶的细胞增殖实验本实施例测定纳米粒复合水凝胶对细胞增殖的影响。
87.、实验方法（1）实验分组选取实施例2中纳米粒复合水凝胶样品3、15，27，研究其对于细胞增殖的影响。
88.具体的，纳米粒复合水凝胶样品3、15、27这三种凝胶样品的细胞增殖用nih 3t3细胞在水凝胶样品上黏附及增殖的共聚焦成像来表达；样品0（透明质酸3%，单宁酸0.3%，透明质酸负载干细胞因子纳米粒0%，edc1%，两端氨基化的聚乙二醇3%，超纯水92.7%组成的混合溶液）；对照组不添加任何物质，作为对比。
89.（2）细胞增殖测试方法首先将nih 3t3细胞以5000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中并培养24 h；之后将冻干后的凝胶浸泡于含有10% fbs的dmem培养基中，将100 μl的各样品浸泡液加入到培养板孔中，并在培养板中留出无添加样品的细胞对照孔，然后分别在培养箱中培养1/4/7天。待培养结束后，分别对样品进行共聚焦成像。
90.、实验结果细胞增殖结果如图9所示，结果表明，细胞在水凝胶样品上黏附及增殖的共聚焦成
像，在七天期间，所有水凝胶组的细胞增殖均有增加。样品15、样品27 对nih3t3细胞有序增殖更迅速，在第4天开始，nih3t3细胞在样品15和样品27上定向生长，而在培养皿上或样品0、样品3、对照样品上呈无序生长状态。我们认为这是由于两端氨基化聚乙二醇的交联作用，使原本无序的透明质酸和透明质酸纳米球有规则的组装，从而诱导细胞有序的爬升和增殖。
91.实施例7 纳米粒复合水凝胶的动物模型实验本实施验证纳米粒复合水凝胶对于毛发生长的相关作用。
92.、实验方法（1）实验分组空白对照（脱毛后，不做任何给药处理）、样品0（透明质酸3%，单宁酸0.3%，透明质酸负载干细胞因子纳米粒0%，edc1%，两端氨基化的聚乙二醇3%，超纯水92.7%组成的混合溶液）、样品3（无法制成纳米复合水凝胶样品）、样品15（参照实施例4）、样品27（参照实施例5）。
93.（2）实验材料小鼠种类：c57bl/6，重量：18
±
0.5g，健康6周，性别：雄性，购于常州卡文斯实验动物有限公司。
94.（3）实验步骤将石蜡切成小块装入50ml离心管，然后将离心管置于水浴锅中，调节水浴锅温度为80摄氏度，取c57bl/6健康小鼠5只（6周雄性小鼠，购于常州卡文斯实验动物有限公司），麻醉小鼠，进行背部蜜蜡脱毛，将融化的石蜡冷却至60摄氏度（温度不能过高，过高容易造成皮肤烫伤引发炎症，从而影响实验结果），用刷子从小鼠颈部向下刷，多刷几次，尽量使石蜡渗到毛发根部、皮肤表面；然后待石蜡完全凝固，开始将小鼠背部毛发上凝固的石蜡适当用力、快速撕扯下来即可，撕扯时根据石蜡在根部的面积来控制脱毛面积，脱毛面积控制为4cm2；然后采用皮下、多点方式进行凝胶的注射，多点注射位置每0.5cm2的面积注射量50 μl样品0、样品3、样品15、样品27，分别在第0天、第7天注射一次。分别在第0天、第3天、第5天、第7天、第10天、第14天相同时间拍照记录小鼠背部毛发的生长状况。
95.、实验结果动物模型实验结果如图10，结果表明本发明按照特定比例制成的复合水凝胶能快速促进小鼠背部毛发再生，其中本纳米粒复合水凝胶（样品15、样品27）的再生效果优于非纳米粒复合水凝胶的效果（样品3），优于不添加透明质酸负载干细胞因子纳米粒的样品0，按照本发明配伍的纳米粒复合水凝胶对小鼠背部毛发均有促进作用，效果均明显优于空白组。
96.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。