一种替考拉宁I5杂质的分离纯化方法及其应用与流程

一种替考拉宁i5杂质的分离纯化方法及其应用
技术领域
1.本发明属于抗生素分离纯化技术领域，特别涉及一种替考拉宁i5杂质的分离纯化方法及其应用。


背景技术：

2.替考拉宁在工业化生产过程中由于存在大量的未知杂质i5(rrt 0.84)，导致替考拉宁在药效上显著降低。在现有研究中，对未知杂质i5的研究相对较少，现有市场上并未存在未知杂质i5的高纯度标准品，导致在对抗生素纯化过程中难以判断未知峰是否为替考拉宁类杂质。


技术实现要素：

3.为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种高纯度替考拉宁未知杂质i5的分离纯化方法及所述未知杂质i5的应用。
4.为了解决上述技术问题，本发明提供一种替考拉宁i5杂质的分离纯化方法，所述i5杂质由式(a)所表示，所述i5杂质具有0.84处的rrt(相对保留时间)；所述分离纯化方法包括如下步骤：
5.s1、将替考拉宁料液在ph＝12的磷酸缓冲液中进行破坏性实验，获得料液a；
6.s2、对所述料液a进行c18高压柱层析，高压柱层析的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为纯水，所述流动相b为乙醇，所述流动相a所对应的泵a与所述流动相b所对应的泵b的开度比为40:60，收集14.5～15.2min层析液，获得料液b；
7.s3、对所述料液b进行c18高压柱层析，高压柱层析的流动相包括流动相c和流动相d，所述流动相c为1wt％tfa-磷酸盐溶液，所述流动相d为乙醇，所述流动相c所对应的泵a与所述流动相d所对应的泵b的开度比为70:30，收集14.5～15.2min的层析液，获得料液c；
8.s4、将所述料液c进行除醇并冻干，获得纯度≥96％的i5杂质；
[0009][0010]
进一步提供由前述替考拉宁i5杂质的分离纯化方法所得到的i5杂质在制备或作为i5杂质标准品、对照品、校准品和质控品中至少一种的应用。
[0011]
本发明的有益效果在于：本发明所提供的替考拉宁i5杂质的分离纯化方法可有效分离出纯度高达96％及以上的未知杂质i5；并且由于分离纯化得到的未知杂质i5纯度高，可作为标准品对替考拉宁成品进行定量检测，同时也可以作为对照品、校准品或质控品用于替考拉宁实验或生产质控，进一步也可以用于对其自身的药理、毒理研究。
附图说明
[0012]
图1所示为本发明在具体实施方式中替考拉宁料液的色谱图；
[0013]
图2所示为图1所对应的峰图表。
具体实施方式
[0014]
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
[0015]
一种替考拉宁i5杂质的分离纯化方法，所述i5杂质由式(a)所表示，所述i5杂质具有0.84处的rrt；所述分离纯化方法包括如下步骤：
[0016]
s1、将替考拉宁料液在ph＝12的磷酸缓冲液中进行破坏性实验，获得料液a；
[0017]
s2、对所述料液a进行c18高压柱层析，高压柱层析的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为纯水，所述流动相b为乙醇，所述流动相a所对应的泵a与所述流动相b所对应的泵b的开度比为40:60，收集14.5～15.2min层析液，获得料液b；
[0018]
s3、对所述料液b进行c18高压柱层析，高压柱层析的流动相包括流动相c和流动相d，所述流动相c为1wt％tfa-磷酸盐溶液，所述流动相d为乙醇，所述流动相c所对应的泵a与所述流动相d所对应的泵b的开度比为70:30，收集14.5～15.2min的层析液，获得料液c；
[0019]
s4、将所述料液c进行除醇并冻干，获得纯度≥96％的i5杂质；
[0020][0021]
其中，所述未知杂质i5在hplc中具有在0.84处的rrt，对其纯化分离并对其结构进行解析，其结构如式(a)所示，英文名为：(1s,2r,19r,22s,25r,28r,40r)-2-{[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-19-{[(2r)-2-amino-2-(3,4-dihydroxyphenyl)acetyl]amino}-5,15-dichloro-48-{[(2s,3r,4r,5s,6r)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(8-methylnonanamido)oxan-2-yl]oxy}-22-(3,5-dihydroxyphenyl)-32,37-dihydroxy-20,23,26,42,44-pentaoxo-35-{[(2r,3s,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-7,13-dioxa-21,24,27,41,43-pentaazaoctacyclo[26.14.2.23,6.214,17.18,12.129,33.010,25.034,39]pentaconta-3,5,8(48),9,11,14,16,29(45),30,32,34,36,38,46,49-pentadecaene-40-carboxylic acid。
[0022]
在分离纯化初期将替考拉宁料液在ph＝12的磷酸缓冲液中进行破坏性实验，以通过改变替考拉宁料液中氢氧根离子含量以及温度，促进替考拉宁料液中的平衡朝向i5杂质倾斜，从而提高料液a中i5杂质的含量。
[0023]
在对料液a或料液b进行c18高压柱层析时，所用的高压柱是具有泵a(口)和泵b(口)的，因此在s2中，将纯水接入泵a上，乙醇接入泵b上，以及在s3中，将1wt％tfa-磷酸盐溶液接入泵a上，乙醇接入泵b上，此时可通过控制泵a与泵b的开度比，控制流动相中各组分的占比。需要说明的是，所述泵a和泵b可以为独立于高压柱的三通结构，具体而言，三通结构的一端口与泵a连通，一端口与泵b连通，另一端口与高压柱的上样端相连通。
[0024]
其中，所述磷酸缓冲液可以为磷酸钠缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠)或磷酸钾(磷酸氢二钾-磷酸二氢钾)中的任一种。
[0025]
所述磷酸盐溶液包括但不限于磷酸钠、磷酸钾或磷酸铵中的任一种。
[0026]
优选的，所述破坏性实验为：80℃加热12h。
[0027]
具体而言，步骤s1为将替考拉宁料液中倒入ph＝12的磷酸缓冲液，持续加热混合溶液12h并保持混合溶液温度在78～82℃之间，优选为80℃。
[0028]
优选的，在s2和s3中，所述c18高压柱层析采用xb-c18色谱柱(10μm，购
于月旭科技)。
[0029]
进一步的，在s3中，所述c18高压柱层析所采用的色谱柱是新制的。即在s3中采用全新的色谱柱进行c18高压柱层析，以避免在s2中残留在固定相中杂质污染料液c，导致料液c中替考拉宁i5纯度降低。
[0030]
进一步的，在s1和s2之间还包括使用ph调节剂调节料液a的ph至6.0～6.5的步骤。
[0031]
其中，所述ph调节剂一般采用1mol/l盐酸和1mol/l氢氧化钠。
[0032]
进一步的，所述s2和s3之间还包括对料液b进行除醇的步骤。
[0033]
优选的，所述除醇为采用截留分子量为300da的纳滤膜进行纳滤浓缩。
[0034]
其中，采用截留分子量为300da的纳滤膜分别对料液b和料液c进行纳滤，通过边加水边纳滤，并对纳滤膜出液端的电导率进行实时检测，当纳滤膜的出口端乙醇度为0时，即表明滤液中乙醇被除尽；然后收集滤液并进行浓缩，优选为浓缩至1l，即完成除醇步骤。
[0035]
优选的，所述s4为：重复s1至s3 3～5次，收集料液c，并对料液c进行除醇并冻干，获得纯度≥96％的i5杂质。
[0036]
由所述替考拉宁i5杂质的分离纯化方法所得到的i5杂质在制备或作为i5杂质标准品、对照品、校准品和质控品中至少一种的应用。
[0037]
由于分离纯化得到的未知杂质i5纯度高，可作为标准品对替考拉宁成品进行定量检测，同时也可以作为对照品、校准品或质控品用于替考拉宁实验或生产质控，进一步也可以用于对其自身的药理、毒理研究。
[0038]
需要说明的是，在没有特别说明的情况下，在下文中氢氧化钠、磷酸钠、盐酸等分离纯化过程所涉及的全部试剂均至少为色谱纯。
[0039]
实施例1
[0040]
一种替考拉宁i5杂质的分离纯化方法，包括如下步骤：
[0041]
s1、取200mg的替考拉宁配置成10mg/ml的替考拉宁料液，并将替考拉宁料液倒入含有2.5g/l磷酸钠且ph＝12的溶液中，持续加热混合溶液12h，并保持混合溶液温度为80℃，获得料液a；
[0042]
s2、利用1mol/l氢氧化钠或1mol/l盐酸调节料液a ph至6.5；
[0043]
s3、取xb-c18-10μm并进行平衡，具体为：泵a(5.6mpa)中接入纯水、泵b接入20％乙醇，控制泵a和泵b的开度比为80:20，平衡流速为3.0ml/min，平衡时间为30min；
[0044]
s4、将料液a以流速3.0ml/min进行上住并以20％乙醇顶洗2bv，控制顶洗流速为3.0ml/min；
[0045]
s5、将40％乙醇接入泵b，将纯水接入泵a，并控制泵a与泵b的开度比为60：40，流速为3.0ml/min进行洗脱，收集14.5～15.2min洗脱液，获得料液b；
[0046]
s6、采用截留分子量为300d的纳滤膜进行纳滤浓缩，在纳滤过程中首先对料液b进行浓缩，然后边加水边浓缩，并检测纳滤膜出水端的乙醇度，当乙醇度为0时，说明赶醇结束，将滤液进行浓缩至1l；
[0047]
s7、对纳滤浓缩后的料液b用乙醇配制成20％乙醇的上柱液，总体积为1.2l；
[0048]
s8、新制与s3相同的色谱柱并进行平衡，具体为：将0.1wt％tfa-磷酸钠溶液接入泵a上，将10％乙醇接入泵b上，控制泵a与泵b的开度比为30:70，平衡流速为3.0ml/min，平衡时间为30min；
[0049]
s9、将料液b以3.0ml/min流速进行上柱并以10％乙醇顶洗2bv，控制顶洗流速为3.0ml/min；
[0050]
s10、将0.1wt％tfa-0.1wt％磷酸钠溶液接入泵a，将40％乙醇接入泵b，控制泵a与泵b的开度比为70:30，以3.0ml/min流速进行洗脱，收集14.5～15.2min洗脱液，获得料液c；
[0051]
s11、s3至s10重复3次，收集总料液c，采用与s6相同的纳滤浓缩方法对料液c进行纳滤浓缩至体积为200ml，然后进行冻干，冻干条件为：预冻﹣70
°
，冻干为20
°
，获得5.3g纯度为96.2％的i5杂质冻干粉。
[0052]
实施例2
[0053]
一种替考拉宁i5杂质的分离纯化方法，包括如下步骤：
[0054]
s1、取200mg的替考拉宁配置成10mg/ml的替考拉宁料液，并将替考拉宁料液倒入ph＝12的磷酸钠缓冲液中，持续加热混合溶液12h，并保持混合溶液温度为80℃，获得料液a；
[0055]
s2、利用1mol/l氢氧化钠或1mol/l盐酸调节料液a ph至6.0；
[0056]
s3、取xb-c18(10μm，4.6
×
150mm)并进行平衡，具体为：泵a中接入纯水、泵b接入20％乙醇，控制泵a和泵b的开度比为80:20，平衡流速为3.0ml/min，平衡时间为30min；
[0057]
s4、将料液a以流速3.0ml/min进行上住并以20％乙醇顶洗2bv，控制顶洗流速为3.0ml/min；
[0058]
s5、将40％乙醇接入泵b，将纯水接入泵a，并控制泵a与泵b的开度比为60：40，流速为3.0ml/min进行洗脱，收集14.5～15.2min洗脱液，获得料液b；
[0059]
s6、采用截留分子量为300d的纳滤膜进行纳滤浓缩，在纳滤过程中首先对料液b进行浓缩，然后边加水边浓缩，并检测纳滤膜出水端的乙醇度，当乙醇度为0时，说明赶醇结束，将滤液进行浓缩至1l；
[0060]
s7、对纳滤浓缩后的料液b用乙醇配制成20％乙醇的上柱液，总体积为1.2l；
[0061]
s8、新制与s3相同的色谱柱并进行平衡，具体为：将0.1wt％tfa-磷酸钠溶液接入泵a上，将10％乙醇接入泵b上，控制泵a与泵b的开度比为30:70，平衡流速为3.0ml/min，平衡时间为30min；
[0062]
s9、将料液b以3.0ml/min流速进行上柱并以10％乙醇顶洗2bv，控制顶洗流速为3.0ml/min；
[0063]
s10、将0.1wt％tfa-0.1wt％磷酸钠溶液接入泵a，将40％乙醇接入泵b，控制泵a与泵b的开度比为70:30，以3.0ml/min流速进行洗脱，收集14.5～15.2min洗脱液，获得料液c；
[0064]
s11、s3至s10重复5次，收集总料液c，采用与s6相同的纳滤浓缩方法对料液c进行纳滤浓缩至体积为200ml，然后进行冻干，冻干条件为：预冻﹣70℃，冻干为20℃，获得5.8g纯度为96.5％的i5杂质冻干粉。
[0065]
对比例1
[0066]
一种替考拉宁i5杂质的分离纯化方法，与实施例1的区别在于：在s3中采用rd-c18色谱柱(5μm，4.6
×
150mm，购于中谱科技)，以0.1wt％磷酸钠溶液为流动相a，以40％乙醇为流动相b，泵a与泵b的开度比为40:60；在s10中，以0.02mol/l碳酸氢铵溶液为流动相a，以40％乙醇为流动相b，泵a与泵b的开度比为70:35；经测量获得6.1g纯度约为92％的杂质i5。
[0067]
检测例1
[0068]
对实施例1中替考拉宁料液进行液相色谱分析，分析结果如图1和图2所示。从图1及图2可以看出，i5杂质的保留时间为15.750min，峰面积可达到3.93％。
[0069]
检测例1
[0070]
以实施例1中s1为基础，分别制备不同ph(2、4、6、8、10、12)的磷酸钠缓冲液并进行破坏性实验，并检测料液a中i5杂质纯度，实验结果如表1所示。
[0071]
表1
[0072] 替考拉宁料液中i5含量(％)料液a中i5含量(％)ph＝20.793.28ph＝40.793.92ph＝60.794.67ph＝80.794.82ph＝100.795.67ph＝120.796.79
[0073]
从表1可以看出，相较于其他ph，当磷酸钠ph为12时，i5的含量显著增加。
[0074]
检测例2
[0075]
分别对实施例1中的料液a、料液b、料液c和i5杂质冻干粉进行i5纯度/含量测定，测定结果为：料液a中i5含量为3.26％，通过第一次c18高压柱层析料液b中i5含量从3.26％提升至83.22％，并经过除醇和第二次c18高压柱层析料液c中i5含量从83.22％提升至96％，最终经过除醇和冻干使i5杂质冻干粉中i5纯度提高至96.2％。
[0076]
综上所述，本发明所提供的替考拉宁i5杂质的分离纯化方法及其应用，可有效分离出纯度高达96％及以上的未知杂质i5；并且由于分离纯化得到的未知杂质i5纯度高，可作为标准品对替考拉宁成品进行定量检测，同时也可以作为对照品、校准品或质控品用于替考拉宁实验或生产质控，进一步也可以用于对其自身的药理、毒理研究。
[0077]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。