一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法与流程

1.本发明涉及生物技术检测技术领域，具体涉及一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法。


背景技术：

2.海龙是我国重要的动物药材，具有温肾壮阳、散结消肿的功效，用药历史悠久，基原众多。中国药典中规定海龙药用基源为海龙科动物刁海龙solenognathus hardwickii(gray)、拟海龙syngnathoides biaculeatus(bloch)或尖海龙syngnathusa cuslinnaeus的干燥体。
3.目前市场上以尖海龙售卖的药材按照生物学分类鉴定实际为舒氏海龙syngnathus schlegeli。尖海龙分布于挪威、英国、爱尔兰等西欧地区，往非洲大陆直到好望角，在我国海域鲜有分布。舒氏海龙模式产地为中国烟台，在中国有广泛的采集记录。舒氏海龙是市场上价格低廉，供应量大的主流海龙品种。中医临床用药实际给付的均为舒氏海龙，二者具有实质等同性。
4.目前海龙的种类鉴别和质量控制方法主要有性状鉴定法、hplc指纹图谱法和分子生物学法。性状鉴定法一般要求海龙个体完整，且需要鉴定者具有丰富的经验，该方法存在一定的主观性；hplc指纹图谱法专属性较低；分子生物学法具有高专属性，但受限于样品中遗传物质保存的完好程度，对于海龙炮制品、提取物、虫蛀霉变以及多个个体混杂的样品，因提取dna困难而无法顺利实验。近年来，越来越多的方法和标准中使用特征肽段对天然药物进行鉴别或定量研究。各物种中所含的蛋白质存在个别位点氨基酸的差别，可用适当的蛋白酶将差异位点截取出来，作为具有标识意义的多肽段，即特征肽段。特征肽段的检测一般使用质谱手段，无需考虑蛋白质活性，制备方法简单且肽段性质较为稳定。现有的海龙鉴定的方法限制因素较多，无法在海龙粉末、炮制品、提取物等衍生制品中进行应用，海龙蛋白中的特征肽段，有潜力作为海龙物种鉴定的指标成分。目前，各数据库中均未收载舒适海龙相关蛋白序列信息，无法通过蛋白序列比对获得差异肽段，因此尚未有舒氏海龙特征多肽的相关记载。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法。本发明提供的特征多肽针对舒氏海龙具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于海龙药材种属鉴别，具体为舒氏海龙的鉴别，具有良好的应用前景。
6.本发明提供了一种舒氏海龙特征多肽，所述特征多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明还提供了上述技术方案所述特征多肽在鉴别舒适海龙中的应用。
8.优选的是，所述鉴别使用质谱法进行，检测离子对包括：质荷比为m/z513.7
→
558.3的定量离子，质荷比为m/z513.7
→
657.4的定性离子。
9.本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的特征多肽鉴别舒适海龙的方法，包括以下步骤：
10.(1)将预处理的海龙提取液或预处理的海龙粉滤液分别与胰蛋白酶混合，得到混合液，将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合，酶解后过滤，取滤液，得到供试品溶液；
11.(2)以上述技术方案所述舒适海龙特征肽为对照品，加水溶解，加碳酸氢铵水溶液稀释成不同的浓度，得到对照品溶液；
12.(3)利用三重四极杆质谱法进行检测分析；
13.所述步骤(1)或(2)之间没有时间先后顺序的限定。
14.优选的是，步骤(1)中，所述预处理的海龙提取液的制备方法包括以下步骤：将海龙粉碎，与水混合后煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，使用碳酸氢铵水溶液进行稀释，得到预处理的海龙提取液；
15.所述预处理的海龙粉滤液的制备过程包括以下步骤：将海龙粉与水混合，煎煮1h，过滤，取滤液，得到预处理的海龙粉滤液。
16.优选的是，所述胰蛋白酶以胰蛋白酶水溶液的形式进行添加，所述胰蛋白酶在所述胰蛋白酶水溶液中的质量浓度为1mg/ml。
17.优选的是，所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1％。
18.优选的是，所述酶解的条件为37℃酶解2h。
19.优选的是，所述三重四极杆质谱法以0.1％甲酸乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱：0～3min，5％a
→
8％a；流速为每分钟0.5ml。
20.优选的是，所述三重四极杆质谱法采用质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，选择质荷比m/z 513.7
→
558.3的定量离子，m/z 513.7
→
657.4的定性离子作为检测离子对。
21.本发明提供了一种舒氏海龙特征多肽。本发明提供的特征多肽作为舒氏海龙鉴别的指标成分，可与其他物种的海龙进行区分，为开发舒氏海龙及相关产品的鉴别方法奠定基础。具体的，本发明所述特征多肽具有以下有益效果：
22.(1)本发明通过将蛋白序列中的差异性多肽段截取出来，采用质谱进行检测，操作简单快捷，测定结果稳定，不受海龙样品的形态和加工过程的干扰，填补了舒氏海龙物种鉴别以及海龙制品中舒适海龙检测方法的空白；
23.(2)本发明提供的特征多肽及检测方法，为数据库缺乏的近缘物种中特征肽段的寻找提供了参考；
24.(3)本发明提供的特征多肽针对舒氏海龙具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于舒适海龙药材的鉴别，具有良好的应用前景。
附图说明
25.图1为本发明提供的海龙供试品溶液主成分分析结果图；
26.图2为本发明提供的对照品溶液测定后的标准曲线图；
27.图3为本发明提供的稳定性考察图。
具体实施方式
28.本发明提供了一种舒氏海龙特征多肽，所述特征多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示：ga-(hyp)-gavgptgar。本发明所述hyp为4hyp，即4-羟基脯氨酸。本发明提供了舒氏海龙具有特征性识别意义的肽段。本发明将舒氏海龙、刁海龙、拟海龙、多棘刁海龙等不同种海龙的水提取物经过胰蛋白酶酶解后，使用纳升液相色谱-高分辨质谱联用仪分析，获得海龙蛋白质全肽段质谱图；将质谱数据进行化学计量学分析，再使用三重四极杆质谱对实验结果进行专属性验证；最终提供了1个特征离子对，对应1条特征肽段，专属性验证结果良好。
29.本发明还提供了上述技术方案所述特征多肽在鉴别舒适海龙中的应用。
30.在本发明中，所述鉴别使用质谱法进行，检测离子对包括：质荷比为m/z 513.7(双电荷)
→
558.3的定量离子，质荷比为m/z 513.7(双电荷)
→
657.4的定性离子。
31.本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的特征多肽鉴别舒适海龙的方法，包括以下步骤：
32.(1)将预处理的海龙提取液或预处理的海龙粉滤液分别与胰蛋白酶混合，得到混合液，将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合，酶解后过滤，取滤液，得到供试品溶液；
33.(2)以上述技术方案所述舒适海龙特征肽为对照品，加水溶解，加碳酸氢铵水溶液稀释成不同的浓度，得到对照品溶液；
34.(3)利用三重四极杆质谱法进行检测分析；
35.所述步骤(1)或(2)之间没有时间先后顺序的限定。
36.本发明所述方法通过将蛋白序列中的差异性多肽段截取出来，采用质谱进行检测，操作简单快捷，测定结果稳定，不受海龙样品的形态和加工过程的干扰，填补了舒氏海龙物种鉴别以及海龙制品中舒适海龙检测方法的空白，为数据库缺乏的近缘物种中特征肽段的寻找提供了参考。
37.本发明将预处理的海龙提取液或预处理的海龙粉滤液分别与胰蛋白酶混合，得到混合液，将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合，酶解后过滤，取滤液，得到供试品溶液。在本发明中，所述预处理的海龙提取液的制备方法优选包括以下步骤：将海龙粉碎，与水混合后煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，使用碳酸氢铵水溶液进行稀释，得到预处理的海龙提取液。本发明优选取100g粉碎的海龙，煎煮液优选共计500ml。在本发明中，所述稀释优选为稀释10倍。具体的，本发明优选取煎煮液5ml，置于50ml两瓶中，使用碳酸氢铵水溶液稀释至刻度，摇匀，得到预处理的海龙提取液。在本发明中，所述预处理的海龙粉滤液的制备过程优选包括以下步骤：将海龙粉与水混合，煎煮1h，过滤，取滤液，得到预处理的海龙粉滤液。得到预处理的海龙提取液和预处理的海龙粉滤液后，本发明优选量取1～5ml海龙提取液或海龙粉滤液，优选加入胰蛋白酶溶液100μl，摇匀后，加碳酸氢铵水溶液至50ml，摇匀，密塞后进行酶解。在本发明中，所述酶解的条件优选为37℃酶解2h。酶解后，本发明优选放冷，更优选放冷至常温，本发明所述常温的温度范围优选为10～30℃。放冷后，本发明进行过滤，去滤液，作为供试品溶液。
38.在本发明中，所述胰蛋白酶以胰蛋白酶水溶液的形式进行添加，所述胰蛋白酶在所述胰蛋白酶水溶液中的质量浓度为1mg/ml。在本发明中，所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1％。
39.本发明以上述技术方案所述舒适海龙特征肽为对照品，加水溶解，加碳酸氢铵水溶液稀释成不同的浓度，得到对照品溶液。在本发明中，所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1％。本发明对所述舒适海龙特征肽的来源没有特殊限定，采用人工合成方法即可，如本发明舒氏海龙特征肽是委托强耀生物科技有限公司按照指定的氨基酸序列合成所获得。在本发明中，对照品溶液的制备方法更优选为：称取舒适海龙特征肽10mg，置50ml量瓶中，加水溶解并定容，精密量取上述溶液5ml，置200ml量瓶中，加1％碳酸氢铵水溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；分别精密吸取上述贮备液1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、25ml置50ml量瓶中，加1％碳酸氢铵水溶液稀释至刻度，摇匀，制成系列浓度对照品溶液。
40.本发明利用三重四极杆质谱法进行检测分析。在本发明中，所述三重四极杆质谱法优选以0.1％甲酸乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱：0～3min，5％a
→
8％a；流速为每分钟0.5ml。在本发明中，所述三重四极杆质谱法优选采用质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，选择质荷比m/z 513.7(双电荷)
→
558.3的定量离子，m/z 513.7(双电荷)
→
657.4的定性离子作为检测离子对。
41.下面结合具体实施例对本发明所述的一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
42.(一)仪器和材料
43.thermo easy-nlc 1000纳升液相，thermo scientific orbitrap-fusion高分辨质谱，ab triple quad 6500 高效液相色谱质谱联用仪，赛多利斯xse205电子天平，胰蛋白酶(sigma公司生产)、碳酸氢铵、乙酸均为分析纯。甲酸、乙腈均为色谱纯。
44.用于进行实验的海龙样品为市场收集，经山东省农业科学院pcr实验鉴定基源。
45.(二)测定条件
46.1、orbitrap-fusion高分辨质谱测定条件
47.色谱条件：以thermo acclaim pepmap c18柱(100μm
×
3.5cm，5μm)脱盐富集，thermo acclaim pepmap c18柱(75μm
×
15cm，3μm)分离，流速300nl/min，流动相a为2％乙腈的0.1％甲酸水溶液，流动相b为含98％乙腈的0.1％甲酸水溶液，进行梯度洗脱(0～1min，1％b
→
6％b；1～96min，6％b
→
22％b；96～113min，22％b
→
30％b；113～117min，30％b
→
95％b；117～120min，95％b)。
48.质谱条件：离子源为nanospray flex纳喷源。以正离子模式进行分析，喷雾电压为1800v，离子传输毛细管温度为275℃，s-lens传输效率设置为60％。一级质谱采用orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000，采集范围为350～1550(m/z)；二级质谱采用orbitrap作为质量分析器，采用rapid scan模式进行扫描，利用top20数据依赖模式进行母离子选择，采用hcd模式进行碎裂，碎裂能量nce设置为30％。
49.2、三重四极杆质谱测定条件
50.以0.1％甲酸乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱(0～3min，5％a
→
8％a)；流速为每分钟0.5ml。采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(esi )，进行多反应监测(mrm)，选择质荷比m/z 513.7(双电荷)
→
558.3(定量离子)，m/z 513.7(双电荷)
→
657.4(定性离子)作为检测离子对。
51.实施例1
52.舒适海龙特征肽段寻找
53.(1)供试品溶液的制备
54.海龙水提液：取供试品海龙100g粉碎，置三角瓶中，加水煎煮三次，分别4h，3h，2h，合并煎煮液，共500ml，微沸浓缩至液体粘稠，转移至硅胶碗中，于60℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥至固体，得海龙水提物；
55.供试品溶液：称取海龙水提物样品0.1g，加1％碳酸氢铵水溶液50ml，超声处理30min使溶解，用微孔滤膜过滤，取续滤液100μl，加1mg/ml的胰蛋白酶水溶液10μl，37℃酶解2h，取出放冷至室温，即得。
56.(2)特征离子的选择及序列推测
57.供试品溶液通过纳升液相色谱-高分辨质谱分析后，将质谱数据导入科迈恩数据分析软件，进行样品一级和二级质谱离子信息的化学计量学分析，通过pca主成分分析结果可以看到舒氏海龙与其它物种的海龙分别落在不同区域(图1)，说明舒适海龙中存在特征成分。进一步分析得到代表舒适海龙差异性的质谱离子对信息m/z 513.7(双电荷)
→
558.3、657.4。通过进一步解析，推测该离子对应的舒适海龙特征肽段序列为ga-(hyp)-gavgptgar。
58.按照推测的氨基酸序列委托合成舒适海龙特征肽对照品，将对照品与舒适海龙供试品溶液同时检测，两者保留时间与二级质谱信息均一致，从而确认该序列正确性。
59.效果验证
60.1、舒适海龙特征肽专属性研究
61.采用三重四极杆质谱测定条件对所有物种海龙的水提物进行检测，结果显示三批舒氏海龙种均出现舒适海龙特征肽色谱峰，而其它刁海龙、拟海龙、多棘刁海龙、宝珈枪吻海龙、长粗吻海龙、葛氏海龙中均未出现相应的色谱峰。表明该特征肽为舒适海龙中特有，可以作为指标成分对舒适海龙进行鉴别。
62.2、舒适海龙特征肽在海龙粉和海龙提取物中的应用
63.(1)样品制备
64.海龙提取液供试品溶液制备：取供试品海龙100g粉碎，置三角瓶中，加水煎煮三次，分别4h，3h，2h，合并煎煮液，共500ml；取海龙提取液5ml，置50ml量瓶中，加1％碳酸氢铵水溶液稀释至刻度，摇匀，量取1ml至5ml量瓶中，加1mg/ml胰蛋白酶水溶液100μl，摇匀，再加1％碳酸氢铵水溶液定容至刻度，摇匀，密塞，37℃恒温酶解2h，放冷，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
65.海龙粉供试品溶液制备：取海龙粉1g，加水50ml煎煮1h，滤过，取滤液1ml至5ml量瓶中，自“加1mg/ml胰蛋白酶水溶液100μl”起，照上文方法制备。
66.系列浓度对照品溶液：称取舒适海龙特征肽对照品10mg，置50ml量瓶中，加水溶解并定容，精密量取上述溶液5ml，置200ml量瓶中，加1％碳酸氢铵水溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。分别精密吸取上述贮备液1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、25ml置50ml量瓶中，加1％碳酸氢铵水溶液稀释至刻度，摇匀，制成系列浓度对照品溶液。
67.(2)利用三重四极杆质谱测定条件进行测定。
68.(3)仪器精密度考察
69.取对照品溶液，连续进样6针，定量离子峰面积rsd分别为0.35％，表明方法精密度
良好。
70.(4)线性关系考察
71.取系列浓度对照品溶液进样测定，分别以定量离子峰面积值为纵坐标，以对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性方程y＝4961021.6967x-154493.9504，r＝0.9999，方法线性关系良好(见图2)。
72.(5)重复性考察
73.取海龙提取液样品，平行制备六份供试品溶液，照上述测定方法进行测定。定量离子峰面积测定结果rsd为1.04％。方法重复性良好。
74.(6)稳定性考察
75.取上述重复性测定样品，连续进样24h，以进样次序为横坐标，以每次进样测得的峰面积为纵坐标绘图，总进样峰面积rsd为1.31％，可见样品在24h内稳定性良好，具体结果如图3所示。
76.(7)样品测定
77.对收集的10批舒氏海龙提取液样品和2批舒氏海龙粉样品进行测定，结果均检出舒适海龙特征肽，表明该特征肽可用于海龙制品中舒氏海龙成分的鉴别。
78.对比例1
79.将318个候选离子中筛选出5个具有鉴别潜力的离子信息，经过三重四极杆质谱验证，并不是任意的离子均能够实现舒氏海龙成分的鉴定，部分离子对舒适海龙的专属性不足，仅质核比为513.7的离子专属性良好，具体结果见表1。
80.表1专属性验证结果
[0081][0082]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。