羟基红花黄色素A在增强耐力中的应用的制作方法

羟基红花黄色素a在增强耐力中的应用
技术领域
1.本发明涉及羟基红花黄色素a在增强耐力中的应用，属于天然产物健康营养领域。


背景技术：

2.在运动过程中，运动时间或运动强度的不同都会直接导致身体所需能量不同。在马拉松和自行车等耐力运动中，碳水化合物和脂肪的氧化代谢几乎提供了所有用于收缩骨骼肌所需的腺嘌呤核苷三磷酸(atp)。其中，碳水化合物为长时间耐力运动提供主要的所需能量。运动过程中，肌糖原的储备多少会直接影响着身体骨骼肌的运动能力，碳水化合物耗竭是人类和啮齿动物耐力的一个主要限制。
3.骨骼肌燃料选择偏好是指，在运动过程中，骨骼肌对供能能源物质的选择具有偏好性，其中，能源物质包括碳水化合物、脂肪酸和氨基酸；通常碳水化合物的氧化，特别是肌肉糖原的氧化，在高强度的运动中占主导地位，而脂肪的氧化在低强度的运动中更重要。最近的一些研究表明，在耐力运动中将骨骼肌燃料选择偏好从葡萄糖转移到脂肪可以有效对抗疲劳和延长耐力表现。此外，这种代谢燃料策略被证明可以提高代谢灵活性和能量资源效率，并增强运动相关的健康和长寿益处。
4.己糖激酶(hk)，磷酸果糖激酶(pfk)，丙酮酸激酶(pkm)是糖酵解途径中的不可逆步骤的三个关键酶，它们的活性直接影响着整个糖酵解代谢途径的速度和方向。脂肪酸转运蛋白(fatp)、肉碱棕榈酰转移酶1a(cpt1a)、酰基辅酶a脱氢酶极长链(acadvl)、电子转移黄素蛋白b(etfb)则是参与脂肪酸转运和氧化的基因。除了糖酵解、脂肪酸氧化在骨骼肌能量代谢的公认作用外，考虑到脂解产物可用于脂肪酸氧化，因而脂滴代谢也会影响骨骼肌能量代谢。由于甘油三酯脂酶(atgl)和激素敏感脂肪酶(hsl)可以催化甘油三酯转化为脂肪酸，因此它们也参与到了骨骼肌能量代谢的过程中。
5.目前市面上增强耐力的功能性食品主要含有三大类营养成分。第一类是通过抗中枢神经系统疲劳从而增强耐力的营养素，如支链氨基酸，咖啡因等；第二类是通过补充能量从而增强耐力的营养素，如膳食atp，磷酸肌酸，葡萄糖、一氧化氮，谷氨酰胺等，第三类是针对氧化应激介导的肌肉损伤的营养素，如维生素e，维生素c等。然而，这些物质在效果、副作用、安全性等方面仍存在一些问题。考虑到天然产物的低副作用，人们越来越关注低成本天然产物的鉴定，并将其用于增强耐力的产品中。
6.红花是菊科成员carthamus tinctorius l.的干燥花，为一种高度分枝的一年生或二年生草本。由于这种作物的强主根系统使其能够很好地克服极端温度、干旱、盐碱地和碱等环境压力，因此红花几乎在世界范围内都有栽培。红花的花瓣是提取红色或黄色色素的良好资源，其中，羟基红花黄色素a是影响红花生物活性的主要化合物。羟基红花黄色素a除了作为天然食用色素应用于日常食品中，还被用作功能性成分，添加到一些药物配方中。许多研究表明羟基红花黄色素a对糖尿病、脂肪、高脂血症、骨质疏松症、心血管疾病等代谢疾病具有有益作用。然而，迄今为止，对羟基红花黄色素a促进骨骼肌燃料选择偏好从葡萄糖转移到脂肪从而增强耐力的作用方面还未见报道。


技术实现要素：

7.[技术问题]
[0008]
本发明要解决的技术问题是现有增强耐力的功能性食品所含的营养成分在副作用、安全性等方面仍存在一些问题。
[0009]
[技术方案]
[0010]
本发明提供羟基红花黄色素a或含羟基红花黄色素a的组合物在制备用于增强耐力的功能性食品或药品或保健品或运动模拟药中的用途。所述羟基红花黄色素a的结构式如图1所示。所述增强耐力是指燃烧脂肪、对抗运动性疲劳、增强机体的运动能力等，包括延长机体运动时间、抑制糖酵解相关基因表达，促进脂肪酸氧化相关基因表达。所述糖酵解基因包括：hk1、pfk、pkm。所述脂肪酸氧化相关基因包括脂肪酸氧化基因：fatp、cpt1a、acadvl、etfb，和脂肪分解基因：atgl、hsl。
[0011]
所述功能性食品包括：功能性饮料、功能性冲剂、功能性泡腾片、功能性饼干、功能性胶囊等。可以用于马拉松、自行车等耐力运动。
[0012]
所述药品包括用于治疗骨骼肌慢性疾病和/或治疗骨骼肌损伤的药物，模拟运动刺激等的药物。所述骨骼肌慢性疾病包括：骨质疏松、肌少症、慢性骨骼肌损伤等。
[0013]
所述保健品包括：用于提升耐力，缓解疲劳等的保健食品。
[0014]
所述羟基红花黄色素a或含有羟基红花黄色素a的组合物能够增强运动耐力表现，是因为它们能够促进骨骼肌燃料选择偏好从葡萄糖转移到脂肪从而有效对抗疲劳和延长耐力表现。所述促进骨骼肌燃料选择偏好从葡萄糖转移到脂肪是指在指在一定剂量和范围内，羟基红花黄色素a刺激抑制肌细胞的葡萄糖摄取，降低肌细胞中的糖酵解基因hk1、pfk、pkm的表达和甘油三酯含量，增加脂肪酸氧化基因fatp、cpt1a、acadvl、etfb和脂肪分解基因atgl、hsl的表达。促进骨骼肌燃料选择偏好从葡萄糖转移到脂肪有利于提高耐力运动的表现。
[0015]
所述羟基红花黄色素a的来源可以是：红花、红花种子、红花粕、红花籽、红花四物汤、八味冠心宁胶囊等。
[0016]
本发明还提供用于增强耐力表现的组合物，所述组合物为含有羟基红花黄色素a或羟基红花黄色素a衍生物的组合物。
[0017]
所述组合物，还包括药学上接受的辅料，包括溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
[0018]
所述组合物，还可以包含其他对机体耐力有利的补充成分。补充成分可选自蛋白质、氨基酸(分支或不分支)、糖(单糖或复合糖)、肌酐、电解质、肌酸、维生素、矿物质以及补充训练饮食的其他因子。
[0019]
[有益效果]
[0020]
(1)红花在中国新疆等地区广泛种植；富含羟基红花黄色素a的红花黄色素已被国家列为允许在食品中使用的食品添加剂。因此本发明选用天然产物羟基红花黄色素a来增强耐力，具有原料来源广、价格亲民、无毒副作用的好处。
[0021]
(2)羟基红花黄色素a还是一种抗氧化剂，并且还具有抗炎，抗心血管疾病等其他有益的健康功效。因此除了增强耐力外，羟基红花黄色素a还能对人体产生健康益处。
[0022]
(3)本发明通过灌胃羟基红花黄色素a标品对小鼠进行给药处理，发现羟基红花黄色素a显著提高了小鼠在疲劳转棒设备和跑步机上的运动时间。从油红染色和qpcr结果来看，给药组骨骼肌的脂滴含量显著减少，糖酵解相关基因显著下降，脂肪分解，脂肪酸氧化相关基因显著上升，改变了骨骼肌燃料选择的倾向。本发明继续在体外实验中进行验证，用羟基红花黄色素a纯品刺激分化的c2c12成肌细胞，从尼罗红染色和qpcr结果来看，与空白组相比，羟基红花黄色素a显著抑制了葡萄糖的摄取，减少了细胞中的脂滴含量。
附图说明
[0023]
图1为羟基红花黄色素a的化学结构式。
[0024]
图2表明在耐力运动中，补充羟基红花黄色素a对小鼠运动耐力表现的影响。数据用平均值
±
标准误差表示，每组三次平行。与对照相比，*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001(t检验)。
[0025]
图3表明补充羟基红花黄色素a对小鼠骨骼肌糖酵解相关基因的影响。a-c分别表示用rt-qpcr分析hk1、pfk和pkm的mrna水平。数据用平均值
±
标准误差表示，每组三次平行。与对照相比，*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001(单因素方差分析)。
[0026]
图4表明补充羟基红花黄色素a对小鼠骨骼肌脂肪酸氧化相关基因的影响。a-d分别表示用rt-qpcr分析fatp、cpt1a、acadvl和etfb的mrna水平。数据用平均值
±
标准误差表示，每组三次平行。与对照相比，*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001(单因素方差分析)。
[0027]
图5表明补充羟基红花黄色素a对小鼠骨骼肌脂滴含量和脂肪分解相关基因的影响。(a)表示对小鼠比目鱼肌sol、腓肠肌gas进行油红染色。(b)表示用rt-qpcr分析脂解相关基因atgl、hsl的mrna水平。数据用平均值
±
标准误差表示，每组三次平行。与对照相比，*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001(单因素方差分析)。
[0028]
图6羟基红花黄色素a处理不同浓度和不同时间后c2c12细胞糖酵解相关基因在mrna水平中的表达变化。(a)表示分别用0、100、200、400μmol/l的羟基红花黄色素a处理c2c12细胞24h，用rt-qpcr分析hk1、pfk和pkm的mrna水平。(b)表示用100μmol/l的羟基红花黄色素a分别处理c2c12细胞0、4、12、24h，用rt-qpcr分析hk1、pfk和pkm的mrna水平。数据用平均值
±
标准误表示，每组三次平行。与对照相比，*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001(单因素方差分析)。
[0029]
图7羟基红花黄色素a处理不同浓度和不同时间后c2c12细胞脂肪酸氧化的相关基因在mrna水平中的表达变化。(a)表示分别用0、100、200、400μmol/l的羟基红花黄色素a处理c2c12细胞24h，用rt-qpcr分析fatp、cpt1a、acadvl和etfb的mrna水平。(b)表示用100μmol/l的羟基红花黄色素a分别处理c2c12细胞0、4、12、24h，用rt-qpcr分析fatp、cpt1a、acadvl和etfb的mrna水平。数据用平均值
±
标准误表示，每组三次平行。与对照相比，*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001(单因素方差分析)。
[0030]
图8羟基红花黄色素a处理不同浓度和不同时间后c2c12细胞脂滴含量和脂肪分解相关基因在mrna水平中的表达变化。通过尼罗红测定法测定细胞甘油三酯。棕榈酸在c2c12肌管中诱导过多的脂质积累，并显示了来自用hsya处理的c2c12肌管的尼罗红染色的(a)代
表性图像。尼罗红，红色；细胞核，蓝色。(b)表示分别用0、100、200、400μmol/l的羟基红花黄色素a处理c2c12细胞24h，用rt-qpcr分析atgl和hsl的mrna水平。(c)表示用100μmol/l的羟基红花黄色素a分别处理c2c12细胞0、4、12、24h，用rt-qpcr分析atgl和hsl的mrna水平。数据用平均值
±
标准误差表示，每组三次平行。与对照相比，*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001(单因素方差分析)。
具体实施方式
[0031]
实施例1
[0032]
羟基红花黄色素a促进骨骼肌燃料选择偏好从葡萄糖转移到脂肪从而增强运动耐力表现作用的验证
[0033]
1实验方法
[0034]
1.1动物实验
[0035]
购买自南京大学模型动物研究中心的5周雄性小鼠被饲养在无特定病原体的动物房中。在此期间，小鼠可以自由进食和饮水。动物房的暗/光循环为12小时，温度和湿度分别保持在23
±
2℃和50％
±
5％。本实验中的所有程序和方案均经江南大学动物伦理委员会标准批准。
[0036]
小鼠适应两周后，将小鼠随机分为四组，包括对照组、hsya治疗组(灌胃给药，50mg/kg/d)、运动组和运动-hsya治疗组(灌胃给药，50mg/kg/d)。其中，对照组和运动组用生理盐水灌胃三周，剂量是按小鼠体重(g)*10μl。将hsya溶于生理盐水，配置成5mg/ml的hsya溶液，hsya治疗组和运动-hsya治疗组灌胃给药3周，剂量是小鼠体重(g)*10μl hsya溶液。小鼠灌胃三周后，运动组和运动-hsya治疗组被放置于跑步机和疲劳转棒系统进行适应训练，连续3天。3天后，我们使用相同的仪器对运动组和运动-hsya治疗组的小鼠进行跑步测试和疲劳转棒测试。最后用co2安乐死所有小鼠，收集小鼠的腓肠肌(gas)、胫骨前肌(ta)和足底(sol)，将右腿gas、sol固定在4％多聚甲醛中，便于稍后进行油红染色，其余组织用液氮立即冷冻，再放入-80℃保存用于之后rna的提取。
[0037]
1.2油红染色
[0038]
将肌肉(右腿gas、sol)固定在4％多聚甲醛中，随后将样品脱水并包埋在石蜡中。然后使用切片机将样品切割成5微米厚的切片。切片用油红o染色。用倒置光学显微镜来观察切片。
[0039]
1.3细胞培养，细胞处理，尼罗红染色
[0040]
c2c12小鼠成肌细胞被放置于37℃和5％co2的细胞培养箱中培养，生长于含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的dulbecco改良eagle培养基中。当细胞长到培养皿的80％，将培养基中10％胎牛血清替换为2％马血清，从而诱导成肌细胞分化为肌管。
[0041]
分化三天后，对c2c12肌管进行以下处理：(1)用0、20、50、100、200、400mm浓度梯度的羟基红花黄色素a处理c2c12肌管细胞12小时，(2)用100mm羟基红花黄色素a分别刺激c2c12肌管细胞0、4、12、24小时，(3)用0.4mm棕榈酸刺激c2c12肌管细胞12小时，随后将c2c12肌管细胞固定在甲醛中，并与尼罗红在室温下共同孵育10分钟。随后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚固定细胞10分钟。用倒置光学显微镜来观察细胞染色情况。
[0042]
1.4rna提取和实时定量荧光pcr
[0043]
使用trizol从c2c12肌管或各种组织样本中提取总rna。使用nanodrop确认rna质量，然后使用prime script rt系统进行cdna合成。qrt-pcr在abi7900 qrt-pcr系统上进行。每个样品做三次平行，使用的rt-pcr引物序列如下表1所示。
[0044]
表1
[0045][0046]
2.实验结果
[0047]
2.1羟基红花黄色素a显著增加了小鼠的耐力运动表现
[0048]
从图2可以看出，与对照小鼠相比，补充羟基红花黄色素a的小鼠，其疲劳转棒时间，跑步时间，跑步距离显著增加。可见补充羟基红花黄色素a，的确可以提高耐力表现。
[0049]
2.2羟基红花黄色素a促进小鼠骨骼肌中的燃料选择从葡萄糖转向脂肪
[0050]
从图3可以看出，羟基红花黄色素a抑制了小鼠骨骼肌中糖酵解相关基因的表达。图4则表明羟基红花黄色素a促进了小鼠骨骼肌中脂肪酸氧化相关基因的表达。图5a表明补充羟基红花黄色素a减少了小鼠骨骼肌中的脂滴含量。和这个结果一致的是，图5b表明羟基红花黄色素a显著增加了小鼠骨骼肌中脂解相关基因的表达。综上所述，我们认为羟基红花黄色素a促进小鼠骨骼肌中的燃料选择从葡萄糖转向脂肪。
[0051]
2.3羟基红花黄色素a促进c2c12细胞中的燃料选择从葡萄糖转向脂肪
[0052]
我们在体外再次验证了羟基红花黄色素a对肌细胞燃料选择的影响。我们发现在不同浓度、不同时间的羟基红花黄色素a标品刺激下，c2c12细胞中的糖酵解相关基因的表达显著下降，而脂肪酸氧化和脂解相关基因的表达显著上升(图6，7，8b，c)。和体内实验结果一致，尼罗红染色表明羟基红花黄色素a处理显著降低了c2c12细胞中的脂滴含量。(图8a)
[0053]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。