一种治疗乙型肝炎的慢病毒载体、慢病毒颗粒及其制备方法和应用与流程

1.本技术涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种治疗乙型肝炎的慢病毒载体、慢病毒颗粒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.乙型肝炎病毒(hbv)感染是世界范围的严重公共卫生问题之一。hbv感染是导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌的重要原因。临床治疗慢性hbv感染的常用药物主要有核苷类似物和干扰素。核苷类似物无法完全清除肝细胞内的hbv dna，且长期使用易导致耐药突变株的出现以及停药后反弹。干扰素使用一个疗程(通常为48周)后hbeag血清学转换发生率仅33％，hbsag转阴率不及10％。干扰素单药治疗hbsag转阴率为3％-7％，仅仅稍高于核苷类似物，而且干扰素副作用较大也限制其应用。
3.目前广泛应用的乙肝蛋白疫苗通过诱导体液免疫，产生保护性抗体，达到预防的目的。大量的研究发现保护性抗体仅能够消除胞外病毒颗粒，而无法清除胞内感染的病毒，难以实现已感染患者的治疗。抗病毒治疗后hbsag阳性人群肝细胞癌发生率明显高于hbsag转阴的人群，hbsag阴转与肝脏功能改善、组织病理改善，以及长期预后改善相关，是目前国内外最新慢乙肝防治指南推荐的理想治疗目标，即功能性治愈，所以hbsag转阴即功能性治愈或临床治愈是当前慢性乙型肝炎治疗的主要追求目标。本领域仍然需要可用于治疗和/或预防hbv感染或治疗和/或预防由hbv引起的疾病的药物。
4.专利cn109923212a中慢病毒载体插入的hbv序列为基因型a型和c型的表面抗原、pol、hbx及共有核心mhci和mhcii表位序列及基因型a型和c型的表面b细胞表位的嵌合vlp，且所展示结果仅有免疫原性结果，治疗效果未知。而cn1209340a公开的抗原序列经比对为hbv基因型a型序列，a型hbv主要分布于欧洲及中非地区。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种治疗乙型肝炎的慢病毒载体，该慢病毒载体包含乙型肝炎病毒抗原的编码核苷酸序列，乙型肝炎病毒抗原选自核心抗原(hbcag)、pres1抗原(pres1)及大s抗原(larges)。优选的，乙型肝炎病毒抗原是大s抗原(larges)。
6.进一步的，核心抗原(hbcag)的氨基酸序列为seq id no:1所示序列；pres1抗原(pres1)的氨基酸序列为seq id no:4或7所示序列；大s抗原(larges)的氨基酸序列为seq id no:10或13所示序列。
7.进一步的，核心抗原(hbcag)的编码核苷酸序列为seq id no:3所示序列；pres1抗原(pres1)的编码核苷酸序列为seq id no:6或9所示序列；大s抗原(larges)的编码核苷酸序列为seq id no:12或15所示序列。
8.本发明还提供一种制备治疗乙型肝炎的慢病毒颗粒的方法，包括如下步骤：
9.a)使前述的慢病毒载体、表达gag、rev和/或pol蛋白的包装载体、表达包膜蛋白的
包膜载体共转染宿主细胞，或者使前述的慢病毒载体转染能够表达包膜蛋白以及能够表达gag、rev、pol蛋白中的一种或多种的宿主细胞；
10.b)培养转染的所述宿主细胞以使慢病毒载体包装成慢病毒载体颗粒；以及
11.c)收获步骤b)中产生的慢病毒载体颗粒。
12.本发明还提供一种制备治疗乙型肝炎的慢病毒颗粒，该慢病毒颗粒包含前述的慢病毒载体，或通过前述的方法制备而成。
13.本发明还提供一种前述的慢病毒载体、慢病毒颗粒在制备用于在有需要的对象中治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染或治疗和/或预防由乙型肝炎病毒感染引起的病症的药物组合物或疫苗中的应用。
14.本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物用于在有需要的对象中治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染或治疗和/或预防由乙型肝炎病毒感染引起的病症，所述药物组合物包括前述的慢病毒载体或慢病毒颗粒，以及药学可接受的载体。
15.其中，前述“对象”是哺乳动物，例如人。
16.本发明的有益效果包括：
17.本发明的免疫原能够覆盖大部分中国地区流行株序列，非整合型慢病毒载体能够在保证其安全性的前提下优化抗原提呈，打破免疫耐受。其动物实验数据证明了其良好的免疫原性，能够在野生小鼠体内诱导强烈的免疫应答。而在hbv慢性感染小鼠模型中也证实了显著的治疗效果，实现抗原和病毒dna清除，抗体转阳，且能激活较强的t细胞免疫反应，具有重要的临床转化潜力。
附图说明
18.图1为质粒图谱图；
19.图2为实验时间轴；
20.图3为小鼠中hbsag的检测图，其中，图3a-3e依次为aav-hbv感染的小鼠肌内注射慢病毒jw27、jw28、jw27 jw28、jw29和jw30；
21.图4为小鼠中hbv-dna的检测图，其中，图4a-4e依次为aav-hbv感染的小鼠肌内注射慢病毒jw27、jw28、jw27 jw28、jw29和jw30；
22.图5为使用小鼠ifn-γelispot测定分析诱导的t细胞应答结果图，其中，图5a-5e依次为jw27、jw28、jw27 jw28、jw29和jw30组；
23.图6示出肝组织hbcag免疫组化结果图。
具体实施方式
24.下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
25.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如sambrook et al.,“molecular cloning:a laboratory manual”；lewin,“genes viii”；及roitt et al.,“immunology”(第8版)，以
及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。
27.如本文所用，术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如，“a和/或b”涵盖了“a”、“a和b”以及“b”。例如，“a、b和/或c”涵盖“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。
[0028]“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。此外，本领域技术人员清楚多肽n端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本技术说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能不包含n端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列，相应地，其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子；反之亦然。
[0029]“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是单链或双链rna或dna聚合物，任选地可含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸通过如下它们的单个字母名称来指代：“a”为腺苷或脱氧腺苷(分别对应rna或dna)，“c”表示胞苷或脱氧胞苷，“g”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“u”表示尿苷，“t”表示脱氧胸苷，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“d”表示a、t或g，“i”表示肌苷，并且“n”表示任何核苷酸。
[0030]“多肽”、“肽”、和“蛋白”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和adp-核糖基化。
[0031]“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
[0032]
如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。
[0033]
二、表达乙肝病毒(hbv)抗原的慢病毒载体、慢病毒颗粒和其制备方法
[0034]
本发明提供一种慢病毒载体，其包含乙型肝炎病毒抗原的编码核苷酸序列。
[0035]
如本文所用，“慢病毒载体”指衍生自慢病毒的核酸构建体，其用于将包含顺式作用慢病毒rna或dna序列的转基因转导至宿主细胞。慢病毒载体可以是复制缺陷型的，例如，其缺少功能性慢病毒蛋白例如gag、pol、rev和/或env蛋白的编码序列。在所述复制缺陷型的慢病毒载体包装成慢病毒颗粒时，需要以反式形式提供慢病毒蛋白(例如gag、pol、rev和/或env)。
[0036]
慢病毒载体可以rna或dna分子的形式存在。例如，所述慢病毒载体可以是重组dna分子的形式，如质粒(也称慢病毒转移载体)。慢病毒载体也可以是指完整慢病毒颗粒所包含的基因组核酸分子，其是单链rna分子。慢病毒载体也可以指整合进宿主细胞的dna序列。
[0037]
慢病毒载体可以来源于例如人免疫缺陷病毒(hiv-1或hiv-2)、猴免疫缺陷病毒(siv)、马传染性脑炎病毒(eiav)、山羊关节炎脑炎病毒(caev)、牛免疫缺陷病毒(biv)和猫免疫缺陷病毒(fiv)，其经修饰以除去涉及致病性的遗传决定簇并导入外源表达盒。
[0038]
在一些优选实施方案中，慢病毒载体为非整合型慢病毒载体。非整合型慢病毒载体能够有效避免病毒dna整合到人体基因组带来的潜在风险。
[0039]“慢病毒颗粒”或本文可互换使用“慢病毒载体颗粒”是指包含慢病毒蛋白及与之相关联的慢病毒基因组(如本文所述的慢病毒载体)的经包装的病毒颗粒，其可以感染宿主细胞并在宿主中表达病毒基因组所编码的蛋白。
[0040]
本发明所述的乙型肝炎病毒抗原可以是来自不同基因型或不同血清型的乙型肝炎病毒的抗原。例如，所述hbv可以选自基因型a、b、c、d、e、f、g、h。优选地，所述hbv是基因型c。或者，所述hbv可以选自血清型ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq 和adrq-。优选地，所述hbv是血清型adw或adr。在一些优选实施方案中，所述hbv是基因型c，血清型adr。
[0041]
在一些实施方案中，所述乙型肝炎病毒抗原选自核心抗原(hbcag)、pres1抗原(pres1)及大s抗原(larges)，或它们的组合。在一些优选实施方式中，所述乙型肝炎病毒抗原是大s抗原(larges)。
[0042]
在一些具体实施方案中，所述乙型肝炎病毒核心抗原(hbcag)包含seq id no:1所示氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述乙型肝炎病毒核心抗原(hbcag)的编码核苷酸序列针对在人中的表达进行密码子优化。在一些实施方案中，所述乙型肝炎病毒核心抗原(hbcag)的编码核苷酸序列示于seq id no:2或3。
[0043]
在一些具体实施方案中，所述乙型肝炎病毒pres1抗原(pres1)包含seq id no:4或7所示氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述乙型肝炎病毒pres1抗原(pres1)的编码核苷酸序列针对在人中的表达进行密码子优化。在一些具体实施方案中，所述乙型肝炎病毒pres1抗原(pres1)的编码核苷酸序列示于seq id no:5、6、8或9。
[0044]
在一些具体实施方案中，所述乙型肝炎病毒大s抗原(larges)包含seq id no:10或13所示氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述乙型肝炎病毒大s抗原(larges)的编码核苷酸序列针对在人中的表达进行密码子优化。在一些具体实施方案中，所述乙型肝炎病毒大s抗原(larges)的编码核苷酸序列示于seq id no:11、12、14或15。
[0045]
在一些优选实施方案中，所述乙型肝炎病毒抗原是乙型肝炎病毒大s抗原(larges)。在一些优选实施方案中，所述乙型肝炎病毒大s抗原(larges)包含seq id no:13所示氨基酸序列。在一些优选实施方案中，所述乙型肝炎病毒大s抗原(larges)的编码核苷酸序列示于seq id no:15。
[0046]
在一些实施方案中，所述乙型肝炎病毒抗原的编码核苷酸序列与调控元件可操作地连接。在一些实施方案中，所述调控元件是启动子。合适的启动子例如可以是β2微球蛋白启动子(β2m)。β2m启动子的实例例如可参见国际专利申请公开wo2013174630。
[0047]
在一些实施方案中，所述慢病毒载体还包含选自可操作连接的以下的一种或多种或全部元件：5’ltr、ψ元件、rre元件、cppt/cts元件、wpre元件和3’ltr。在一些实施方案中，
所述3’ltr缺失u3区(δu3)。
[0048]
在另一方面，本发明提供一种制备包含乙型肝炎病毒抗原的编码核苷酸序列的慢病毒载体颗粒的方法，所述方法包括：
[0049]
a)使本发明的慢病毒载体、表达gag、rev和/或pol的一或多种包装载体、表达包膜蛋白的包膜载体共转染合适的宿主细胞，或者本发明的慢病毒载体转染能够表达gag、rev、pol和/或包膜蛋白的合适的宿主细胞；
[0050]
b)培养转染的所述宿主细胞以使所述慢病毒载体包装成慢病毒载体颗粒；以及
[0051]
c)收获步骤b)中产生的慢病毒载体颗粒。
[0052]
在一些实施方案中，所述能够表达gag、rev、pol和/或包膜蛋白的合适的宿主细胞在转染本发明的慢病毒载体之前，已经用表达gag、rev和/或pol的一或多种包装载体、表达包膜蛋白的包膜载体转染。
[0053]
可以用任何其它病毒或非病毒的包膜蛋白进行假型包装，只要所述包膜蛋白适于包装以及适于进入靶细胞。在一些实施方案中，所述包膜蛋白是疱疹性口炎病毒的包膜糖蛋白(vsv-g)。例如所述包膜蛋白是indiana血清型(genbank acc.no.j02428)或new jersey血清型的疱疹性口炎病毒包膜蛋白。
[0054]
本领域已知并且本领域技术人员可以容易获得合适的用于包装慢病毒的表达gag、rev和/或pol的一或多种包装载体、表达包膜蛋白的包膜载体。在一些实施方式中，上述载体是质粒。
[0055]
用于制备慢病毒载体颗粒的合适的宿主细胞包括但不限于293细胞，例如293t细胞。
[0056]
适于本发明的慢病毒载体构建和病毒颗粒包装的一般方法可参见例如中国专利或专利申请cn101291688a、cn102083462b、cn104039968b、cn102083462b等。
[0057]
在另一方面，本发明提供一种包含乙型肝炎病毒抗原的编码核苷酸序列的慢病毒载体颗粒，其包含本发明的慢病毒载体或通过本发明上述的方法制备。
[0058]
三、疾病治疗和/或预防
[0059]
在另一方面，本发明提供本发明的慢病毒载体和/或慢病毒载体颗粒在制备用于在有需要的对象中治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染或治疗和/或预防由乙型肝炎病毒感染引起的病症的药物组合物中的用途。
[0060]
在另一方面，本发明提供一种用于在有需要的对象中治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染或治疗和/或预防由乙型肝炎病毒感染引起的病症的药物组合物，其包括至少一种本发明的慢病毒载体颗粒，以及药学可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物是乙型肝炎治疗性疫苗。
[0061]
如本文所用，“药学可接受的载体”是可以添加至活性药物成分以帮助配制或稳定制剂而不对患者引起显著不利的毒物学效果的物质，包括但不限于崩解剂、粘合剂、填充剂、缓冲剂、等张剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂或润滑剂。
[0062]“由乙型肝炎病毒感染引起的病症”包括但不限于乙型肝炎病毒感染引起的肝炎、肝硬化、肝癌等。
[0063]
在一些实施方案中，所述药物组合物包含两种或更多种本发明的慢病毒载体颗粒，其各自包含不同的乙型肝炎病毒抗原的编码核苷酸序列。例如，所述药物组合物可以包
含两种本发明的慢病毒载体颗粒，其中第一慢病毒载体颗粒包含乙型肝炎病毒核心抗原(hbcag)编码核苷酸序列，第二慢病毒载体颗粒包含乙型肝炎病毒pres1抗原(pres1)编码核苷酸序列。
[0064]
如本文中所使用的，术语“对象”是指哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，所述对象已经被乙型肝炎病毒感染。在一些实施方案中，所述对象未被乙型肝炎病毒感染。在一些实施方案中，所述对象已经被乙型肝炎病毒感染，且已经表现出由乙型肝炎病毒感染引起的疾病症状。在一些实施方案中，所述对象已经被乙型肝炎病毒感染，但没有表现出由乙型肝炎病毒感染引起的疾病症状。
[0065]
在一些实施方案中，所述乙型肝炎病毒可以选自基因型a、b、c、d、e、f、g、h。优选地，所述乙型肝炎病毒是基因型c。在一些实施方案中，所述乙型肝炎病毒可以选自血清型ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq 和adrq-。优选地，所述乙型肝炎病毒是血清型adw或adr。在一些优选实施方案中，所述乙型肝炎病毒是基因型c，血清型adr。
[0066]“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
[0067]
本发明的慢病毒载体颗粒的“治疗有效量”优选地导致乙型肝炎病毒载荷的降低，乙型肝炎症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于乙型肝炎感染的治疗，相对于未接受治疗的对象，“治疗有效量”优选地将乙型肝炎病毒载量减少至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，更优选至少约95％，更优选至少约100％。或者，所述“治疗有效量”优选地将对象体内的hbsag水平减少至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，更优选至少约95％，更优选至少约100％。
[0068]
在一些具体实施方案中，本发明的慢病毒载体颗粒的施用剂量可以包括每个剂量大约1x 107tu/ml至大约1x 108tu，例如大约1x 107tu、大约2x 107tu、大约3x 107tu、大约4x 107tu、大约5x 107tu、大约6x 107tu、大约7x 107tu、大约8x 107tu、大约9x 107tu、大约10x 107tu，优选大约5x 107tu的所述慢病毒载体颗粒。tu(transducing unit)是指具有生物活性(例如可以感染并进入靶细胞)的病毒颗粒数。
[0069]
本发明的慢病毒载体颗粒或药物组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种施用途径施用。本领域技术人员应当理解，施用途径和/或方式根据期望的结果而不同。合适的施用途径包括但不限于肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用等。在一些具体实施方案中，本发明的慢病毒载体颗粒或药物组合物通过肌肉内注射施用。
[0070]
本发明的慢病毒载体颗粒或药物组合物的示例性的治疗方案可以是每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。本发明的慢病毒载体颗粒或药物组合物可以施用一次，施用两次，或施用更多次。在一些具体实施方案中，本发明的慢病毒载体颗粒或药物组合物施用两次，例如在第一周施用一次，在第二周再次施用一次。
[0071]
四、病毒生产方法
[0072]
为构建表达核心抗原(hbcag)，pres1抗原(pres1)，大s抗原(larges)的重组慢病毒载体，从genbank下载了乙型肝炎病毒株fmc#97的hbcag，pres1和大s的编码序列并进行了密码子优化。将编码hbcag，pres1和大s的哺乳动物密码子优化序列克隆到flap-sp1b2m-wprem质粒的bamhi和xhoi限制内切酶位点，以生成pflap-sp1b2m-转基因-wprem。用无内毒素质粒中提试剂盒(qiagen,德国)获得质粒，并进行测序确保序列准确。
[0073]
病毒颗粒通过质粒在hek 293t细胞的瞬时磷酸钙转染产生(cacl20.125mm，1
×
hepes缓冲盐水ph7.10，70mm nacl，0.75mm na2hpo4·
2h2o，25mmhepes)，即用载体质粒trip/se、印第安纳血清型vsv-g包膜质粒和包装质粒共转染hek 293t细胞。转染前24小时细胞以7
×
106接种于10cm2聚苯乙烯处理的组织培养petri皿，培养基在转染前更换为新鲜完全培养基。转染前细胞至少80％铺满。转染24小时后换小体积无血清培养基以浓缩病毒颗粒，转染48小时后收获病毒颗粒，离心去除细胞。病毒于-80℃条件下保存。病毒滴度通过病毒与阿非迪霉素共感染hek 293t细胞后qpcr检测来测定。
[0074]
实施例1、候选乙肝治疗性慢病毒疫苗的构建
[0075]
1.1.乙肝基因型及血清型分类
[0076]
乙型肝炎病毒在繁殖的过程中其基因组核苷酸序列可发生变异，这种变异有时可导致病毒生物特性的变化。hbv不同基因型间的核苷酸差异可被用来追踪hbv的传播途径，鉴定传染源，确定传播关系及发病机制。目前确定的hbv基因型已经达到10个，10种基因型的地理分布已经明确。其中，基因型a主要分布于欧洲的西北部和中非，基因型b和c常见于亚洲，基因型d是地中海地区和中东到印度地区的优势基因型，基因型e主要见于非洲西部，基因型f和h多见于南美洲，基因型g可能起源于中美洲，基因型i多见于越南、老挝，基因型j主要见于日本。在中国大部分地区感染hbv的患者是以b、c两种基因型为主，约占95％以上，而a、d基因型的报道仅见于部分少数民族聚集区。中国hbv基因型的地理分布特点也存在较大的差异，北方地区主要流行c基因型，大部分地区超过90％，而南方地区以b基因型流行为主。研究表明，与基因型b型相比，基因型c型感染有更高的风险导致更严重的肝病如肝硬化及肝癌。
[0077]
hbv可分为9种血清型：ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq 和adrq-。血清型仅仅反映的是部分包膜蛋白氨基酸的差异，并没有真正地反映病毒的系统发生关系，且基因序列的单个核酸的变化就有可能改变血清亚型，故血清亚型并不能真正反映hbv基因序列的差异。研究发现血清型和基因型之间没有严格的对应关系，不同的血清型可属同一基因型，而同一血清型又可分布于不同基因型(见表1)。中国多为adw及adr亚型。
[0078]
表1基因型与亚基因型和血清型的对应关系
[0079]
基因型血清型基因组(bp)aadw2、adw13221badw2、ayw13215cadr、ayr、adw23215dayw2、ayw33182eayw43212fadw4、ayw4、adw23215
gadw23248hadw33215iadw3215jayw3182
[0080]
1.2.抗原设计及密码子优化
[0081]
选择了三种免疫原作为研究目标：核心抗原(hbcag)、pres1抗原(pres1 antigen)及大s抗原(large s antigen，包括pres1、pres2及表面抗原hbsag)。由于中国hbv主要基因型为b型和c型，因此选取基因型b型、血清型adw型hbv病毒株536207(genbank：ay220698.1)及基因型c型、血清型adr型hbv病毒株fmu#14(genbank：af411408.1)，其全长序列共3215碱基，其中2848-3205位为pres1编码基因，共360个碱基，2848-835位为large s编码基因，共1203个碱基，1901-2452位为core编码基因，共552个碱基。根据基因型c型hbv病毒株hbsag氨基酸序列比对，发现204位氨基酸多为ser，而本病毒株中204位氨基酸为arg，故调整密码子aga为agc(序列中高亮标出)。另外由于core基因同源性较高，不同病毒株间只有四个氨基酸不同，经过b型、c型病毒株编码core蛋白氨基酸序列比对，选择第5位、83位、87位、97位氨基酸出现频率最高氨基酸编码序列。所得各抗原编码序列具体如下：
[0082]
hbv b型pres1编码序列(seq id no:5)
[0083]
atgggaggttggtcttccaaacctcgaaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcacccctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggcctactcacaactgtgccagcagctcctcctcctgcctccaccaatcggcagttaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggcctga
[0084]
hbv b型large s编码序列(seq id no:11)
[0085]
atgggaggttggtcttccaaacctcgaaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcacccctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggcctactcacaactgtgccagcagctcctcctcctgcctccaccaatcggcagttaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatgcagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcaaaatactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaaaactggggaccctgtaccgaacatggagaacatcgcatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggaacacccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcctccaatttgtcctggttatcgctggatgtatctgcggcgttttatcatattcctctgcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcatcaacaaccagcaccggaccatgcaaaacctgcacgactcctgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaattcctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtctggctttcagttatatggatgatttggttttgggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctttatgccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaa
[0086]
hbv c型pres1编码序列(seq id no:8)
[0087]
atgggaggttggtcttccaaacctcgaaaaggcatggggacgaatctttctgttcccaatcctctgggattctttcccgatcaccagttggaccctgcgttcggagccaactcaaacaatccagattgggacttcaaccccaacaaggatcactggccagaggcaaatcaggtaggagcgggagcattcgggccagggttcaccccaccacacggcggtcttttggggtggagccctcaggctcaaggcatattgacaacagtgccagtagcacctcctcctgcctccaccaatcggcagtcagggagacagcctactcccatctctccacctctaagagacagtcatcctcaggcctga
[0088]
hbv c型large s编码序列(seq id no:14)
[0089]
atgggaggttggtcttccaaacctcgaaaaggcatggggacgaatctttctgttcccaatcctctgggattctttcccgatcaccagttggaccctgcgttcggagccaactcaaacaatccagattgggacttcaaccccaacaaggatcactggccagaggcaaatcaggtaggagcgggagcattcgggccagggttcaccccaccacacggcggtcttttggggtggagccctcaggctcaaggcatattgacaacagtgccagtagcacctcctcctgcctccaccaatcggcagtcagggagacagcctactcccatctctccacctctaagagacagtcatcctcaggccatacagtggaattccacaacattccaccaagctctgctagaccccagagtgaggggcctatactttcctgctggtggctccagttccggaacagtaaaccctgttccgactactgcctcacccacatcgtcaatcttctcgaggactggggaccctgcaccgaacatggagaacacaacatcaggattcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggagcacccacgtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcttgtcctccaatttgtcctggctatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactaccaaggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggaacatcaactaccagcacaggaccatgcaagacctgcacgattcctgctcaaggaacctctatgtttccctcttgttgctgtacaaaaccttcggacggaaactgcacttgtattcccatcccatcatcctgggctttcgcaagattcctatgggagtgggcctcagtccgtttctcctggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtttggctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagcctgtacaacatcttgagtccctttttacctctattaccaattttcttttgtctttgggtatacatttga
[0090]
hbv core编码序列(seq id no:2)
[0091]
atggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctctgctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacggcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttaatgaatctagccacctgggtgggaagtaatttggaagatccagcatccagggaattagtagtcagctatgtcaacgttaatatgggcctaaaaatcagacaactattgtggtttcacatttcctgtcttacttttgggagagaaactgttcttgaatatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcccgcatatagaccgccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttagacgaagaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttag
[0092]
将以上编码序列提供给苏州金唯智公司做基因合成，合成前根据综合在各宿主中的偏好性、gc含量、高级结构以及排除酶切位点等，按人的密码子优化，优化后序列为：
[0093]
hbv b型pres1密码子优化序列(adw-pres1)(seq id no:6)
[0094]
atgggcggctggagcagcaagcccagaaagggcatgggcaccaacctgagcgtgcccaaccccctgggcttcttccccgaccaccagctggaccccgccttcaaggccaacagcgagaaccccgactgggacctgaacccccacaaggacaactggcctgacgccaacaaggtgggcgtgggagctttcggccctggcttcacccctccccatggaggactgctgggctggagccctcaggctcagggactgctgaccacagtgcccgctgctcctcctcctgccagcaccaacaggcagctgggcagacagcccacacccctgagccctcctctgagagacacccacccccaggcctga
[0095]
hbv b型large s密码子优化序列(adw-larges)(seq id no:12)atgggaggctggtcctccaaacccaggaagggcatgggcacaaacctgtccgtgcccaaccctctgggctttttccccgaccaccagctggaccccgccttcaaggctaacagcgagaaccccgactgggacctgaatccccacaaggacaattggcccgatgccaataaggtgggcgtgggcgccttcggccctggatttacacccccccatggaggactgctgggatggtcccctcaggcccaaggcctgctgaccacagtgcccgctgctcctccccctgcttccaccaatagacagctcggcagacagcccacacccctgtcccctcctctgagggacacccatccccaggccatgcagtggaatagcaccaccttccaccagacactgcaggaccccagggtgagagccctgtacttccccgccggaggttctagcagcggaacagtgagccccgcccagaacacagtgtccgccatcagcagcattctgtccaagacaggcgaccccgtgcccaacatggagaacatcgccagcggactcctgggacctctcctggtgctgcaggccggcttcttcctgctgaccaagatcctgaccatcccccagagcctggattcctggtggaccagcctgaactttctgggaggcacccccgtgtgcctgggccagaatagccagagccagatctcctcccacagccctacctgctgcccccctatctgccctggatacaggtggatgtacctgaggaggttcatcatcttcctgtgcattctgctgctgtgcctcatctttctgctggtgctgctggattaccagggcatgctgcctgtgtgtcccctgatccccggcagcagcaccacaagcaccggcccctgtaagacctgtaccacccccgcccagggaacctccatgttcccttcctgctgctgcaccaagcccaccgacggcaactgtacatgcatccccattcccagcagctgggcctttgctaaattcctgtgggagtgggcctccgtgagattcagctggctgtccctgctggtgcctttcgtgcagtggttcgtgggactgtcccccacagtgtggctgtccgtgatctggatgatctggttctggggccccagcctgtacaacatcctgagccctttcatgcccctgctgcccatcttcttttgcctctgggtgtacatttga
[0096]
hbv c型pres1密码子优化序列(adr-pres1)(seq id no:9)
[0097]
atgggcggatggtcctccaagcctagaaagggcatgggcaccaatctgtccgtgcccaaccccctgggctttttccccgatcaccagttagatcctgccttcggcgccaacagcaacaaccctgactgggacttcaaccccaacaaggatcactggcccgaggccaatcaagtgggcgctggagctttcggccctggcttcacacctccccatggaggactgctgggctggtcccctcaggcccagggaattctcacaacagtgcccgtggcccctcctcccgctagcaccaacaggcagagcggcaggcagcccacacctatcagcccccctctgagagattcccacccccaggcctga
[0098]
hbv c型large s密码子优化序列(adr-larges)(seq id no:15)atgggcggatggtcctccaagcctagaaagggcatgggcaccaatctgtccgtgcccaaccccctgggctttttccccgatcaccagttagatcctgccttcggcgccaacagcaacaaccctgactgggacttcaaccccaacaaggatcactggcccgaggccaatcaagtgggcgctggagctttcggccctggcttcacacctccccatggaggactgctgggctggtcccctcaggcccagggaattctcacaacagtgcccgtggcccctcctcccgctagcaccaacaggcagagcggcaggcagcccacacctatcagcccccctctgagagattcccacccccaggccatccagtggaatagcaccaccttccaccaagccctgctcgaccctagggtgaggggcctgtactttcccgctggcggcagctccagcggcacagtgaatcccgtgcccacaaccgcctcccctacctcctccattttcagcagaaccggcgaccccgcccccaacatggagaacacaacctccggctttctcggccctctgctggtgctgcaggccggcttcttcctgctgacccgtattttaaccatcccccagagcctggactcctggtggacctccctgaacttcctgggaggagcccctacctgtcccggacagaactcccagtcccctaccagcaatcactcccccaccagctgccctcctatctgccccggctacaggtggatgtgtctgaggaggttcatcatcttcctgttcatcctgctgctgtgcctcattttcctgctggtgctgctggactaccagggcatgctgcccgtgtgtcctctgctgcccggcacaagcaccacaagcaccggcccctgcaagacctgtaccatccccgcccagggcacctccatgtttccctcctgctgctgcaccaagccctccgatggcaactgcacctgcatccctatcccctcctcctgggccttcgccagattcctgtgggaatgggcttccgtgaggttctcctggctgtccctgctggtgccctttgtgcagtggtttgtgggcctgagccctacagtgtggctgtccgtgatctggatgatgtggtattggggcccctccctgtacaacatcctgagccccttcctgcccctgct
gcccatcttcttctgcctgtgggtgtacatctga
[0099]
hbv core密码子优化序列(seq id no:3)
[0100]
atggacatcgacccttacaaggagttcggcgccagcgtggagctcctgagcttcctgcccagcgacttctttcccagcatcagagacctgctggacaccgccagcgccctgtacagggaagccctggagagccccgagcactgtagccctcaccacaccgccctcagacaggccatcctgtgctggggcgagctgatgaacctggccacctgggtgggaagcaacctggaagaccccgcctccagggagctggtggtgtcctacgtgaacgtgaacatgggcctgaagatcaggcagctgctgtggttccacatcagctgcctgaccttcggcagagaaaccgtgctggagtacctggtgagcttcggcgtctggatcagaacccctcctgcctacagaccccctaacgcccccatcctgtccaccctgcccgagaccacagtggtgaggaggagaggcaggagccccagaaggaggacccctagccccaggaggaggagaagccagtcccccaggagaagaaggtcccagtccagggagagccagtgctga
[0101]
每段序列5’端插入bamh i酶切位点ggatcc，3’端插入xhol酶切位点ctcgag。合成后将目的基因序列构建至真核表达载体pcdna3.1( )。测序验证免疫原基因全长无误。所选抗原氨基酸序列如下：
[0102]
hbv core氨基酸序列(seq id no:1)
[0103]
mdidpykefgasvellsflpsdffpsirdlldtasalyrealespehcsphhtalrqailcwgelmnlatwvgsnledpasrelvvsyvnvnmglkirqllwfhiscltfgretvleylvsfgvwirtppayrppnapilstlpettvvrrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsqsresqc
[0104]
hbv b型pres1氨基酸序列(seq id no:4)
[0105]
mggwsskprkgmgtnlsvpnplgffpdhqldpafkansenpdwdlnphkdnwpdankvgvgafgpgftpphggllgwspqaqgllttvpaapppastnrqlgrqptplspplrdthpqa
[0106]
hbv c型pres1氨基酸序列(seq id no:7)
[0107]
mggwsskprkgmgtnlsvpnplgffpdhqldpafgansnnpdwdfnpnkdhwpeanqvgagafgpgftpphggllgwspqaqgilttvpvapppastnrqsgrqptpispplrdshpqa
[0108]
hbv b型large s氨基酸序列(seq id no:10)
[0109]
mggwsskprkgmgtnlsvpnplgffpdhqldpafkansenpdwdlnphkdnwpdankvgvgafgpgftpphggllgwspqaqgllttvpaapppastnrqlgrqptplspplrdthpqamqwnsttfhqtlqdprvralyfpaggsssgtvspaqntvsaissilsktgdpvpnmeniasgllgpllvlqagfflltkiltipqsldswwtslnflggtpvclgqnsqsqisshsptccppicpgyrwmylrrfiiflcilllclifllvlldyqgmlpvcplipgssttstgpcktcttpaqgtsmfpsccctkptdgnctcipipsswafakflwewasvrfswlsllvpfvqwfvglsptvwlsviwmiwfwgpslynilspfmpllpiffclwvyi
[0110]
hbv c型large s氨基酸序列(seq id no:13)
[0111]
mggwsskprkgmgtnlsvpnplgffpdhqldpafgansnnpdwdfnpnkdhwpeanqvgagafgpgftpphggllgwspqaqgilttvpvapppastnrqsgrqptpispplrdshpqaiqwnsttfhqalldprvrglyfpaggsssgtvnpvpttasptssifsrtgdpapnmenttsgflgpllvlqagfflltriltipqsldswwtslnflggaptcpgqnsqsptsnhsptscppicpgyrwmclrrfiiflfilllclifllvlldyqgmlpvcpllpgtsttstgpcktctipaqgtsmfpsccctkpsdgnctcipipsswafarflwewasvrfswlsllvpfvqwfvglsptvwlsviwmmwywgpslynilspflpllpiffclwvyi
[0112]
1.3.慢病毒构建
[0113]
将含hbv c型pres1、large s及core抗原的重组质粒与包装载体和包膜载体共转
染细胞，进行慢病毒包装。所用质粒载体结构如图1所示。合成后慢病毒对应序号为jw27、jw28、jw29。此外对照组为插入绿色荧光蛋白gfp的慢病毒，命名为jw30，插入gfp序列如下：
[0114]
gfp编码序列(seq id no:16)
[0115]
atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttcggttatggtgttcaatgctttgcgagatacccagatcatatgaaacagcatgactttttcaagagtgccatgcctgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataa
[0116]
实施例2、乙肝治疗性慢病毒疫苗在aav-1.3hbv小鼠模型中的效果评价
[0117]
2.1实验方法
[0118]
小鼠hbv感染模型的建立
[0119]
使用6-8周龄或体重为20g左右的c57bl/6j小鼠，小鼠购买于北京维通利华公司，购买回来后于动物房适应环境1周左右，尾静脉注射aav8-1.3hbv 5e 10gc(基因组拷贝)/只，注射体积为200μl。所用aav8-1.3hbv(购买于广州派真生物技术有限公司)为基因型d型hbv，其基因组序列为seq id no:17所示序列。
[0120]
乙肝治疗性慢病毒疫苗免疫
[0121]
小鼠尾静脉注射aav-1.3hbv 4周后建立持续感染模型，于小鼠后腿大腿肌肉注射jw27、jw28、jw29及jw30慢病毒，注射量为5e 7tu，注射体积为50μl。jw27为表达hbv基因型c型core抗原慢病毒，jw28为表达hbv基因型c型pres1抗原慢病毒，jw29为表达hbv基因型c型large s抗原(pres1 pres2 hbsag)抗原慢病毒，jw30为表达gfp的对照慢病毒。
[0122]
hbsag检测
[0123]
将3μl血清原液加入297μl pbs中，配制成100
×
稀释液，将稀释液送金域医学检验进行hbsag检测，检测试剂盒为雅培乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法),检测下限为5iu/ml。
[0124]
小鼠血清hbv-dna检测
[0125]
使用湖南圣湘生物医学的病毒核酸定量测定试剂盒(一步法)，操作步骤按照说明书执行。
[0126]
anti-hbs检测
[0127]
将3μl血清原液加入297μl pbs中，配制成100
×
稀释液，将稀释液送金域医学检验进行anti-hbs检测，检测试剂盒为雅培乙型肝炎病毒表面抗体定量测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)，检测下限为10iu/l。
[0128]
肝组织he及ihc检测
[0129]
将小鼠用水合氯醛进行腹腔注射麻醉，当小鼠进入深度麻醉后，用剪刀将小鼠胸腔打开，从心尖部位注射5ml pbs，观察肝脏颜色变化，直至肝脏变白为止，取一部分肝脏组
织放于福尔马林固定剂中，转送谷歌生物进行石蜡包埋，然后进行he染色、hbcag 染色。
[0130]
小鼠ifn-gamma elispot检测
[0131]
单细胞获取及刺激：
[0132]
将小鼠颈椎脱臼处死后放入75％酒精中浸泡5min；打开小鼠腹腔，取出脾脏，放入5ml 1640培养基中；用纱布将脾进行研磨，将研磨后的液体转移至15ml离心管中；600g离心5min，弃去上清；用3ml裂红液重悬，混匀；裂解3min后，加入5ml含10％ncs的1640培养基；600g离心5min，弃上清；用1ml完全培养基重悬后进行计数；使用肽库进行刺激，肽库分别为core、pres1、pres2以及hbsag，每条肽的最终工作浓度为2ug/ml，使用pma ionomysin刺激作为阳性对照。
[0133]
细胞功能ifn-gamma elispot检测：
[0134]
(1)将细胞按照1x106/100μl的浓度加入至96孔板中，每孔100μl，按要求加入100μl混有il-2的刺激肽，每条肽的终浓度为2μg/ml，37℃，5％二氧化碳中孵育6天，其中在第三天的时候进行半数换液，并加入相同浓度的il-2和刺激肽。
[0135]
(2)elispot板抗体过夜包被：按实验需求孔数将抗ifn-gamma抗体按1:200(按说明书推荐)稀释于无菌pbs，100μl/孔加入elispot板中，4℃孵育过夜。
[0136]
(3)将过夜孵育的elispot板取出，弃去孔内液体，加入200μl完全培养基(洗涤一次，放置3min，弃去。加入200μl完全培养基，室温封闭2h。
[0137]
(4)封闭结束后，弃去培养基，将对照组实验组和处理实验组细胞悬浮至终体积100-150μl，另加阳性、阴性孔对照。轻轻混匀后，放于湿盒中，于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24小时左右。
[0138]
(5)弃去培养物。加200μl蒸馏水/孔洗2次，每次放置3-5min后再弃去，将残留液体在吸水纸上拍干。加200μl/孔pbs 0.05％吐温洗3次。
[0139]
(6)将生物素偶联的检测抗体按1:250稀释于pbs 10％ncs中，100μl/孔加入，室温孵育2h。
[0140]
(7)弃去液体，加入200μl/孔pbs 0.05％吐温洗3次。每次放置1-2min后弃去。
[0141]
(8)将streptavidin-hrp按1:100稀释于pbs 10％ncs中，100μl/孔加入，室温孵育1h。
[0142]
(9)弃去反应液，加入200μl/孔pbs 0.05％吐温洗4遍。每次放置1-2min后弃去。加入200μl/孔pbs洗2遍，弃去。
[0143]
(10)每ml显色缓冲液加1滴显色底物，混匀后，100μl孔加入。室温避光反应5-60min。待有较清晰红色点显出时，将板子于自来水轻轻冲洗5min，停止反应。
[0144]
(11)将板自然晾干。
[0145]
实验设计
[0146]
实验时间轴如图2所示。实验时间表如表2所示，第十周jw27、jw28及jw30第三针免疫使用new jersey vsv-g包膜的慢病毒。每周收集血清进行hbsag、hbeag和hbv-dna检测。
[0147]
表2.实验时间表
[0148][0149]
2.2实验结果
[0150]
hbv小鼠模型构建
[0151]
本实验将5e 10gc(genome copies)的aav8-1.3hbv病毒通过尾静脉注射100只小鼠，雌雄各50只，编号174-273(174-223为雄性，224-273为雌性)。2周后随机挑取雌雄各10只进行hbsag和hbv dna检测，验证小鼠是否感染hbv，结果如下表3和表4所示。
[0152]
表3.小鼠hbsag检测
[0153]
编号(雄鼠)hbsag(iu/ml)编号(雌鼠)hbsag(iu/ml)184809234691188166623675718919672371758196159724030020121342438842082169249679214135725449821620942559052171235264366220178126980
[0154]
表4.小鼠hbv dna检测
[0155][0156]
结果显示aav8-1.3hbv已成功在所选小鼠体内造成感染。4周时对100只小鼠进行hbsag及hbv dna检测。根据hbsag(表5)及hbv dna(表6)数据可以看出，100只小鼠均已成功感染hbv。
[0157]
表5.小鼠hbsag检测
[0158]
[0159][0160]
表6.小鼠hbv dna检测
[0161]
[0162][0163]
实验分组
[0164]
由于个体差异，小鼠体内hbsag和hbv dna水平不均一，为降低个体间差异，雌雄小鼠中各挑取表面抗原及病毒参数相近的25只小鼠，随机分5组，每组5只雄鼠5只雌鼠，分组情况如下表7：
[0165]
表7.实验分组
[0166]
[0167][0168]
用治疗性慢病毒疫苗免疫
[0169]
确定小鼠hbv持续性感染模型建立后，进行治疗性疫苗免疫，5组分别肌肉注射lv-jw27、lv-jw28、lv-jw27 28、lv-jw29及lv-jw30。疫苗注射剂量为5e 7tu/只，体积为50μl。其中lv-jw27 28为联合免疫，左右腿肌肉分别注射lv-jw27和lv-jw28。一周后进行第二次免疫加强。第二次免疫5周后进行第三次免疫，第三次免疫加强换用new jersey vsv-g包膜慢病毒，剂量为5e 7tu/只，体积为50μl。由于缺少jw29 new jersey vsv-g包膜慢病毒，故只有lv-jw27、lv-jw28、lv-jw27 28、及lv-jw30四组进行第三次免疫加强。
[0170]
治疗性慢病毒疫苗对小鼠乙肝感染的影响
[0171]
外周血中hbsag水平的变化
[0172]
从第4周进行初次免疫后每周采集外周血进行血清中hbsag和hbv dna的检测。效果最为明显的为jw29号组(图3d)，5只雄鼠在初次免疫后hbsag即出现大幅下降，雌鼠中有3只在9周后hbsag持续下降，至19周时，组内共有3只实现hbsag转阴，27周时有5只实现hbsag转阴，38周时6只实现hbsag，转阴率达60％(表8)。jw27组(图3a)有一只雄鼠在第7周时死亡，在第一针免疫后，5只雄鼠hbsag均下降，之后有所回弹。从15周以后，组内9只小鼠hbsag持续下降，至38周时，有4只实现hbsag转阴(表8)。jw28组(图3b)在初次免疫后至15周，hbsag均处于波动状态，维持相对稳定，15周后至观察期结束hbsag均有所下降，1只实现hbsag转阴(表8)，整体治疗效果不明显。jw27 jw28联合免疫组(图3c)在初次免疫至第10周第三次免疫加强期间，组内小鼠hbsag维持稳定，第10周免疫后，4只小鼠hbsag开始持续下降直至转阴。至27周时，已有5只实现抗原转阴，至38周观察结束，组内共有6只实现hbsag转阴(表8)。jw30组为对照组(图3e)，除一只小鼠自身清除hbv外，剩余9只在观察期内hbsag维持稳定。
[0173]
表8.hbsag转阴
[0174][0175]
外周血中hbv dna水平的变化
[0176]
jw27组小鼠外周血中hbv dna(图4a)在初次免疫至15周中逐渐上升维持较高水平，直至38周时，4只雄鼠hbv dna无明显下降，依然处于较高水平，而5只雌鼠中有4只在15周后hbv dna开始持续下降，至38周时，3只雌鼠实现hbv dna清除(表9)。jw28组小鼠外周血中hbv dna(图4b)同样在初次免疫至15周时逐渐上升，之后整体维持较高水平，至38周时有1只实现转阴(表9)，其余9只依然维持高水平，无明显效果。jw27 jw28联合免疫组外周血中hbv dna(图4c)同样在初次免疫至15周时维持稳定或增高趋势，15周后8只hbv dna明显下降，在38周时有2只小鼠实现hbv dna转阴(表9)。jw29组小鼠外周血hbv dna(图4d)在初次免疫至13周时处于波动状态，整体维持相对稳定水平，至15周后，6只小鼠hbv dna明显下降，并在23周时即有5只小鼠实现hbv dna转阴，至38周时共有6只小鼠hbv dna转阴(表9)，其中4只雌鼠，2只雄鼠，这6只小鼠同样实现hbsag转阴，达到治愈状态。jw30对照组(图4e)除实现自身转阴的1只小鼠，剩余9只hbv dna在观察期维持稳定状态。
[0177]
表9.hbv dna清除
[0178][0179]
外周血中anti-hbs的检测
[0180]
表面抗体是机体对乙肝病毒免疫产生的保护性抗体，其出现表明对hbv感染产生特异性免疫，血清中检测不到病毒。对jw27、jw28、jw27 jw28、jw29及jw30组中小鼠不同时间点的外周血血清进行anti-hbs检测，结果如下表所示(表10)：jw27、jw28及jw29组中抗体转阳时间点均与hbsag转阴时间点相对应。
[0181]
表10.anti-hbs抗体检测
[0182]
[0183][0184]
小鼠脾细胞ifn-γelispot检测
[0185]
将jw27、jw28、jw27 jw28、jw29及jw30组小鼠脾细胞分离加入检测孔中过夜培养，同时加入特异抗原基因型b型pres1多肽、基因型c型pres1多肽、pres2多肽、core多肽及hbsag多肽刺激。
[0186]
结果显示(图5)，jw27、jw28、jw27 28及jw29组均针对特异性抗原有免疫反应，jw29最强。
[0187]
肝组织hbcag免疫组化
[0188]
各组的代表性肝组织hbcag免疫组化结果如图6所示，显微镜200
×
下的视野。每只取3个视野计算hbcag阳性细胞数取平均值得出阳性率，结果见表11。
[0189]
表11.肝细胞中hbcag的ihc染色
[0190][0191]
2.3结论
[0192]
总的而言，本发明的乙肝治疗性慢病毒疫苗，特别是能够表达larges抗原的治疗性疫苗，能够起到很好的乙肝治疗效果，实现hbsag清除、hbv dna清除。