分离检测加替羧酸乙酯和/或相关杂质的方法与流程

1.本发明涉及药物分析技术领域，特别是涉及一种利用高效液相色谱法分析加替羧酸乙酯及相关杂质的方法。


背景技术：

2.莫西沙星是一种近乎白色晶体粉末的化学品，分子式为c
21h24
fn3o4，氟喹诺酮类抗菌药。dna拓扑异构酶抑制剂，可用于治疗金葡菌、流感杆菌、肺炎球菌等引起的社会获得性肺炎，慢性支气管炎急性发作，急性窦炎等。属第四代喹诺酮类抗菌药物，是新一代抗菌谱广的抗生素。该品对常见的呼吸道病菌，如肺炎链球菌、嗜血流感杆菌、卡他莫拉汉菌以及部分金黄色葡萄球菌都具有很强的抗菌活性.特别是对肺炎链球菌，抗菌作用强大。临床用于治疗急性窦腺炎、慢性支气管炎的急性发作、社区获得性肺炎，以及无并发症的皮肤感染和皮肤软组织感染。本品特点是几乎没有光敏反应，具有良好的组织穿透力，在肺组织中也可达到很高浓度，是治疗呼吸道感染较好的药物。
3.加替羧酸乙酯为莫西沙星关键起始原料，对加替羧酸乙酯的质量把控有利于保障莫西沙星药物的质量。根据盐酸莫西沙星ep10.3药典质量标准中成品中可能含有的已知杂质结构式，推测原料加替羧酸乙酯中可能存在以下2个与加替羧酸乙酯结构高度类似的杂质：
[0004][0005]
而目前暂无相关文献或资料有公开对这两个杂质进行分离检测的方法。


技术实现要素：

[0006]
有鉴于此，本发明的目的之一是提供一种利用hplc法分离加替羧酸乙酯和/或相关杂质的方法，通过该方法可以有效分离相关物质并减少分离时间。
[0007]
为了实现上述目的，本发明提供的方案为：
[0008]
hplc法分离加替羧酸乙酯和/或相关杂质的方法，所述方法采用的色谱柱是以苯基键合硅胶为填充剂，采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，将所述加替羧酸乙酯和/或相关杂质进行分离；所述相关杂质为杂质moxh-sm1a、杂质moxh-sm1b、杂质moxh-sm1e、杂质moxh-sm1m、杂质moxh-sm1g、杂质moxh-sm1h、杂质moxh-sm1j、杂质moxh-sm1f、杂质moxh-sm1i中的一种或多种；所述加替羧酸乙酯、相关杂质的结构式具体如下：
[0009][0010][0011]
所述流动相a为缓冲盐溶液，流动相b为有机溶剂；
[0012]
进一步，所述缓冲盐溶液为磷酸二氢钾溶液和三乙胺的混合溶液，所述缓冲盐溶液ph为2.8～3.2；
[0013]
具体的，所述缓冲盐溶液ph为3.0；
[0014]
具体的，所述缓冲盐溶液使用磷酸调节ph；
[0015]
进一步，所述缓冲盐溶液中磷酸二氢钾浓度为0.005～0.05mol/l，所述缓冲盐溶液中三乙胺体积百分比为0.05～5.0％。
[0016]
具体的，所述缓冲盐溶液中磷酸二氢钾质量浓度为2.72g/l，所述缓冲盐溶液中三乙胺体积百分比为0.3％；
[0017]
进一步，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中的一种或多种；
[0018]
具体的，所述有机溶剂为甲醇；
[0019]
进一步，所述梯度洗脱为：
[0020]
时间/分钟流动相a/％流动相b/％038-4258-6234060203070232080292080304060374060；
[0021]
具体的，所述梯度洗脱为：
[0022]
时间/分钟流动相a/％流动相b/％0406034060203070232080292080304060374060；
[0023]
进一步，所述方法中流动相流速为0.9～1.1ml/min；所述方法中色谱柱柱温为23～27℃；
[0024]
具体的，所述方法中流动相流速为1.0ml/min；所述方法中色谱柱柱温为25℃。
[0025]
本发明目的之二是提供一种鉴定加替羧酸乙酯和/或相关杂质的方法，该方法有效鉴定相关物质，并减少鉴定时间；
[0026]
为了实现上述目的，本发明提供的方案为：
[0027]
hplc法鉴定加替羧酸乙酯和/或相关杂质的方法，利用目的一中所述方法将所述加替羧酸乙酯及相关杂质进行分离，通入检测器中进行检测，所述检测器检测波长为210～340nm；所述相关杂质为目的一中所述相关杂质；将检测得到的色谱图与已知对照品色谱图进行对比，鉴定检测物中是否含有所述加替羧酸乙酯和/或相关杂质；
[0028]
具体的，所述检测器检测波长为250nm。
[0029]
本发明目的之三是提供一种利用hplc法测定加替羧酸乙酯和/或杂质moxh-sm1f和/或杂质moxh-sm1i的方法；该方法可有效测定相关物质的含量，并控制测定时间；
[0030]
为了实现上述目的，本发明提供的方案为：
[0031]
hplc法测定加替羧酸乙酯和/或杂质moxh-sm1f和/或杂质moxh-sm1i的方法，利用目的一中所述方法将所述加替羧酸乙酯和/或杂质moxh-sm1f和/或杂质moxh-sm1i进行分离，在检测波长为250nm的检测器中进行检测得到色谱图，根据峰面积计算所述加替羧酸乙酯和/或杂质moxh-sm1f和/或杂质moxh-sm1i的含量；
[0032]
具体的，所述方法具体步骤如下：
[0033]
s1：试剂配制
[0034]
取供试样品溶于稀释剂，得供试品溶液；取对照品溶于稀释剂，得对照品溶液；放入控温2～8℃的进样盘中；
[0035]
s2：分离
[0036]
利用目的一中所述方法，将所述加替羧酸乙酯和/或杂质moxh-sm1f和/或杂质moxh-sm1i分离；
[0037]
s3：鉴定
[0038]
利用目的二中所述方法，鉴定检测物中是否含有所述加替羧酸乙酯和/或杂质moxh-sm1f和/或杂质moxh-sm1i；
[0039]
s4：含量计算
[0040]
根据得到的色谱图，测量峰面积，计算所述加替羧酸乙酯和/或杂质moxh-sm1f和/或杂质moxh-sm1i的含量；
[0041]
进一步，所述稀释剂为水和乙腈；
[0042]
具体的，所述稀释剂为体积比1:1的水和乙腈。
[0043]
本发明的有益效果在于：
[0044]
1.本发明提供的分析方法能很好地将与加替羧酸乙酯结构高度类似的杂质moxh-sm1f、杂质moxh-sm1i分离检测。
[0045]
2.本发明提供的分析方法主成分及供试品中可能存在的其他已知杂质与杂质moxh-sm1f和杂质moxh-sm1i间的分离度均大于1.5，方法专属性强、耐用性好、灵敏度高、重现性好。
[0046]
3.本发明提供的分析方法可在37分钟内将与加替羧酸乙酯结构高度类似的杂质moxh-sm1f和杂质moxh-sm1i与加替羧酸乙酯很好分离并进行准确定量，且能与加替羧酸乙酯中可能存在的其他7个已知杂质有效分离，提供了现有技术未能解决的加替羧酸乙酯中已知杂质的分离测定问题。
附图说明
[0047]
图1：混合溶液hplc色谱图；
[0048]
图2：检测限hplc色谱图；
[0049]
图3：耐用性1hplc色谱图；
[0050]
图4：耐用性2hplc色谱图；
[0051]
图5：耐用性3hplc色谱图；
[0052]
图6：耐用性4hplc色谱图；
[0053]
图7：耐用性5hplc色谱图；
[0054]
图8：耐用性6hplc色谱图；
[0055]
图9：耐用性7hplc色谱图；
[0056]
图10：耐用性8hplc色谱图。
具体实施方式
[0057]
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和
调整，仍属于本发明的保护范围。
[0058]
实施例1
[0059]
取本品适量，精密称定，加稀释剂(水-乙腈，体积比为1:1)溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液，配制好后立即放入控温5℃的进样盘中；精密量取5.0ml置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取2.0ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
[0060]
用以苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；以缓冲盐(称取磷酸二氢钾2.72g，加水1000ml溶解，加入三乙胺3.0ml，用磷酸调节ph 3.0)为流动相a，以甲醇为流动相b，按表1进行线性梯度洗脱，检测波长为250nm；流速为每分钟1.0ml；柱温为25℃。
[0061]
表1梯度洗脱表
[0062]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0406034060203070232080292080304060374060
[0063]
精密称取加替羧酸乙酯moxh-sm1系统适用性对照品1(含加替羧酸乙酯moxh-sm1、杂质moxh-sm1i、杂质moxh-sm1f)适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液，配制好后立即放入控温5℃的进样器中。取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按杂质moxh-sm1f、moxh-sm1、杂质moxh-sm1i顺序出峰，杂质moxh-sm1f和主成分间分离度应符合要求。精密量取供试品溶液、对照溶液10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按加校正因子的主成分对照法计算两杂质的含量。
[0064]
实施例2
[0065]
专属性
[0066]
加替羧酸乙酯sm1中可能存在的杂质：杂质moxh-sm1a、杂质moxh-sm1b、杂质moxh-sm1e、杂质moxh-sm1m、杂质moxh-sm1g、杂质moxh-sm1h、杂质moxh-sm1j、杂质moxh-sm1f、杂质moxh-sm1i共计9个杂质，本方法中将对杂质moxh-sm1f、杂质moxh-sm1i进行研究。
[0067]
分别取空白溶液、杂质定位溶液、其他杂质混合溶液、供试品溶液、混合溶液各10μl，依次进样，记录色谱图，测定结果见表2、3，图附1。
[0068]
表2混合溶液hplc色谱图积分结果
[0069][0070]
表3专属性试验测定结果
[0071][0072]
结论：空白溶液和供试品溶液主成分均不干扰杂质moxh-sm
1f
和杂质moxh-sm
1i
的检测，主成分及供试品中可能存在的其他已知杂质与杂质moxh-sm
1f
和杂质moxh-sm
1i
间的分离度均大于1.5，方法专属性符合要求。
[0073]
实施例3
[0074]
检测限
[0075]
取检测限溶液连续进样3次，计算主峰峰高与噪声的比值(信噪比)。试验结果见表4、5，附图2。
[0076]
表4检测限hplc色谱图积分结果
[0077][0078]
表5检测限测定结果
[0079][0080]
结论：杂质moxh-sm1f检测限浓度为0.074μg/ml，以在供试品中存在浓度表示为0.007％，信噪比均值为14.2；杂质moxh-sm1i检测限浓度为0.065μg/ml，以在供试品中存在浓度表示为0.007％，信噪比均值为10.9；主成分sm1检测限浓度为0.064μg/ml，以在供试品中存在浓度表示为0.006％，信噪比均值为8.4，均符合检测限的要求。
[0081]
实施例4
[0082]
色谱条件耐用性
[0083]
取“专属性”项下混合溶液，分别使用正常色谱条件，预定测试的不同柱温、柱流速、流动相b相甲醇起始比例、流动相a相缓冲盐ph值进行测试，待仪器系统稳定后分别测试，记录各峰间的分离度，考察各已知杂质相对保留时间及归一化含量变化情况。试验结果见下表2、6-14，图1、图3-10。
[0084]
表6耐用性1hplc色谱图积分结果
[0085][0086]
表7耐用性2hplc色谱图积分结果
[0087][0088][0089]
表8耐用性3hplc色谱图积分结果
[0090][0091]
表9耐用性4hplc色谱图积分结果
[0092][0093][0094]
表10耐用性5hplc色谱图积分结果
[0095][0096]
表11耐用性6hplc色谱图积分结果
[0097][0098][0099]
表12耐用性7hplc色谱图积分结果
[0100][0101]
表13耐用性8hplc色谱图积分结果
[0102][0103][0104]
表14色谱条件变化耐用性试验测定结果
[0105][0106]
结论：色谱条件有微小波动时，杂质moxh-sm1f与主峰间分离度均大于1.5，杂质moxh-sm1i与邻近组分间分离度均大于1.4，方法耐用性较好。
[0107]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。