一种评价保健品护肝功效的方法与流程

1.本发明属于保健品功效评价技术领域，具体涉及一种评价保健品护肝功效 的方法。


背景技术：

2.绿原酸(chlorogenic acid,cga)，又名单咖啡酰奎尼酸(caffeoylquinic acid, cqa)，是由咖啡酸(caffeic acid,ca)与奎尼酸(quinic acid,qa)组成的羧酚酸。 自然界中cga具有多种同分异构体，其中以5-咖啡酰奎尼酸最为常见(5-cqa， ipuac命名法)。另外，自然界中还存在绿原酸甲酯(methyl chlorogenate,mcga)， 二咖啡酰奎尼酸(dicaffeoylquinic acid,dicqas)和三咖啡酰奎尼酸 (tricaffeoylquinic acid,tricqas)等十多种cga衍生物。研究表明，cga是61 味中药材以及多种水果蔬菜中的主要有效成分，如杜仲、金银花、车前草、茵陈、 栀子、菊花、麦芽、木瓜和桑叶，向日葵、胡萝卜、菠菜和绿茶等，其中咖啡是 cga异构体衍生物最丰富、含量最多的饮料植物，每天喝两杯以上咖啡能摄入 0.5-1.0g cga。
3.肝脏是进行代谢不可或缺的器官，经常暴露于外源性和/或内源性刺激物中。 已有众多文献报道5-cqa通过调节多条信号通路抑制炎症因子的产生和氧化应 激缓解这些刺激物导致的肝损伤。比如，5-cqa通过下调stat3和nf-κb信号 通路抑制萘异硫氰酸萘酯(α-naphthylisothiocyanate,anit)诱导的肝内胆汁淤 积与肝损伤。5-cqa对铝诱导的小鼠急性肝毒性和血液毒性具有保护和预防作 用。5-cqa通过抑制内质网应激改善博来霉素(bleomycin)诱导的肺纤维化。5
‑ꢀ
cqa通过抑制氧化应激和细胞凋亡防止砷(arsenic)诱导的小鼠肝细胞毒性。
4.随着经济的发展，人们对于食品安全问题的重视越来越强。5-cqa作为人 们饮食中含量最丰富的多酚类化合物之一，已有大量文献报道其具有抗炎、保肝 利胆和抗肿瘤等多种药理活性。但是鲜有文献报道5-cqa的膳食饮用安全剂量 范围，以及超过多少浓度以上的5-cqa会抑制肝细胞的生长和造成肝损伤。评 价保健品护肝效果的传统方法主要是采用哺乳动物模型(小鼠或大鼠)，通过检 测肝组织中丙二醛(mda)，还原型谷胱甘肽(gsh)和甘油三酯(tg)共3个指 标的变化反映其护肝效果。但该方法也存在操作技术较难，哺乳动物个体差异较 大，成本高、周期长和难以实现高通量的不足之处。


技术实现要素：

5.本发明的目的：发明一种既能快速与低成本评价保健品尤其是含有5-咖啡 酰奎尼酸的保健品的保护肝细胞功效，又能为5-咖啡酰奎尼酸的膳食安全提供 科学指导的检定方法。
6.一种评价5-咖啡酰奎尼酸保护肝细胞功效的方法，包括以下步骤：
7.(1)配制5-咖啡酰奎尼酸供试品母液
8.称取适量供试品粉末，先用无水乙醇浸泡30min，再超声处理30min，最 后过滤除
菌，配制成5-cqa终浓度约为100mm的母液。
9.(2)配制5-咖啡酰奎尼酸标准品母液
10.将5-cqa标准品溶于二甲基亚砜(dmso)中，配制成终浓度为100mm的 母液。
11.(3)检测
12.以人源肝细胞作为供试细胞。首先采用实时无标记动态细胞分析技术绘制 与浓度梯度5-cqa孵育肝细胞的生长曲线，以及通过流式细胞术和cck-8试剂 检测浓度梯度5-cqa对肝细胞增殖的影响。然后采用乳酸脱氢酶细胞毒性检测 试剂盒检测浓度梯度5-cqa对肝细胞的毒性效价，和通过细胞克隆形成实验分 析肝细胞对浓度梯度5-cqa的敏感性。最后采用生物能量分析仪分析浓度梯度 5-cqa对肝细胞生物能量代谢的影响。
13.(4)评价
14.1)细胞存活率的计算
15.细胞存活率＝[(ae-ab)/(ac-ab)]
×
100％或[(ce-cb)/(cc-cb)]
×
100％
[0016]
其中ae和ce分别为实验孔的吸光度和活细胞数，ac和cc分别为对照孔 的吸光度和活细胞数，ab和cb分别为空白孔的吸光度和活细胞数。
[0017]
2)与梯度浓度5-cqa孵育肝细胞生长曲线的绘制
[0018]
采用实时无标记动态细胞分析(rtca)技术动态监测梯度浓度5-cqa对 肝细胞生长的影响。
[0019]
3)细胞毒性率的计算
[0020]
细胞死亡率＝(实验孔吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸 光度-样品对照孔吸光度)]
×
100％
[0021]
4)肝细胞耗氧率(ocr)的测定
[0022]
首先将肝细胞与梯度浓度5-cqa孵育4h，然后通过加入4种线粒体呼吸 链复合物调节药物(寡霉素、fccp、鱼藤酮和抗霉素a)处理并测定不同时间 点的ocr值，可反映5-cqa对肝细胞氧化磷酸化水平的影响。
[0023]
5)肝细胞产酸率(ecar)的测定
[0024]
通过检测加入葡萄糖、寡霉素、2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)后细胞的反应，测 定不同时间点的产酸率，可反映细胞糖酵解速率的变化。细胞处理条件以及检测 过程均与ocr测定过程相似。
[0025]
6)克隆形成能力的测定
[0026]
肝细胞接种浓度为1
×
103个/孔，6孔板，24h后更换为含梯度浓度5-cqa 的细胞培养液，放入培养箱内孵育15天左右，每隔3天换液1次。然后采用甲 醇固定以及结晶紫染色。最后采用imagej软件统计每孔克隆数。克隆形成能力 的大小可反映肝细胞对膳食水平5-cqa的敏感性。
[0027]
本发明具备以下创新点和技术优势：
[0028]
1.真核细胞主要通过氧化磷酸化和糖酵解为细胞的生长及其正常生理功能 的维持提供能量。并且，线粒体还是细胞物质代谢的中心。目前,研究细胞氧化 磷酸化和有氧糖酵解主要是采用clark氧电极法和试剂盒测定细胞耗氧率(ocr) 以及相关中间代谢物，比如乳酸和葡萄糖。但是，这些检测方法存在检测指标相 对单一和操作复杂的缺陷。而本发明所述方法为评价5-cqa保护肝细胞功效提 供了可以具体量化的检测指标，尤其是可以在
肝细胞代谢5-cqa的半衰期时间 内(约3-4h)，对线粒体功能和细胞能量代谢进行整体评价，并且具有快速和稳 定性好的技术优势。
[0029]
2.首次从细胞增殖、毒性效应和细胞生物能量代谢等多角度综合评价5
‑ꢀ
cqa保护肝细胞的功效，并且制定了标准化的检测流程。
[0030]
3.通过多种技术手段进行综合评价，明确了5-cqa保护肝细胞的最佳浓度 范围为50-200μm。
[0031]
本发明的技术效果：
[0032]
本发明综合运用多种技术手段，从细胞增殖、毒性效应和细胞生物能量代谢 等方面系统评价了5-cqa保护肝细胞功效，从而为5-cqa的合理利用与膳食 安全提供科学指导。
[0033]
综上所述，为了解决以上技术难点，本发明以人正常肝细胞系l-02为研究 对象。通过多种技术手段系统评价5-cqa对肝细胞增殖、毒性效应和细胞生物 能量代谢的影响，尤其是本发明采用生物能量分析仪在肝细胞代谢5-cqa的半 衰期时间左右分析5-cqa作用肝细胞的有效浓度范围，从而为5-cqa的合理 利用以及患者膳食结构的改善提供科学依据。
附图说明
[0034]
图1为5-咖啡酰奎尼酸对肝细胞增殖的影响。
[0035]
图2为5-咖啡酰奎尼酸对肝细胞的毒性作用的结果图。
[0036]
图3为5-咖啡酰奎尼酸对肝细胞线粒体呼吸与糖酵解途径的影响。
[0037]
图4为5-咖啡酰奎尼酸对肝细胞克隆形成能力的影响。
[0038]
图5为5-咖啡酰奎尼酸的分子结构式图。
具体实施方式
[0039]
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0040]
英文缩略词对照表
[0041][0042][0043]
此外本发明中化合物1：5-咖啡酰奎尼酸，分子式为c
16h18
o9，cas号码为 327-97-9，结构式为图5所示。化合物1购于德国默克公司。
[0044]
实施例1.评价5-咖啡酰奎尼酸对肝细胞增殖的影响
[0045]
1.采用实时无标记动态细胞分析(rtca)技术绘制细胞生长曲线
[0046]
1.1实验方法：采用rtca系统动态监测不同剂量(0、200、400、800μm) 5-cqa对肝细胞l-02生长的影响。细胞起始接种密度为2
×
103/孔，培养板为整合 微电子生物感应芯片的10孔板，每孔大小与96孔板一致，5％co2、37℃细胞培 养箱中孵育过夜后，将培养基更换为加药或者不加药的dmem(10％fbs)培养 基，100μl/孔。然后放入rtca系统中动态监测100h内不同浓度5-cqa对l-02细 胞生长的影响。
[0047]
2.细胞增殖-毒性检测
[0048]
2.1实验方法：首先将l-02细胞计数后，接种于12孔/96孔板中，密度为 2
×
104/2
×
103个细胞每孔。细胞铺板24h后统一更换为不含或者含梯度浓度5
‑ꢀ
cqa的dmem(5％fbs)培养基(每组设置3个复孔)，37℃、5％co2浓度细 胞培养箱中孵育96h，每隔48h更换培养基1次。最后采用cck8试剂检测细 胞活性，或将每组细胞用胰酶消化后，加入等体积培养基重悬，并用流式细胞仪 进行活细胞计数。
[0049]
3.实验结果：如图1所示，体外实验表明适当浓度5-cqa对人正常肝细胞 具有保护作用，过量5-cqa会显著抑制肝细胞增殖。(a)采用rtca技术实 时监测梯度浓度5-cqa作用人正常肝细胞系l-02的生长曲线图；(b)采用流 式细胞仪对与梯度浓度5-cqa孵育96h的l-02细胞进行活细胞计数；(c)采 用cck8试剂检测与梯度浓度5-cqa孵育96h的l-02细胞活性，并绘制5
‑ꢀ
cqa作用l-02的剂量反应曲线以及计算5-cqa抑制l-02细胞生长的半抑制浓 度(ic50值)。图中数据均为mean
±
sd值(n＝3)，**p《0.01,***p《0.001。
[0050]
通过联合运用rtca、流式细胞术和cck8试剂绘制了梯度浓度5-cqa作 用肝细胞l-02的生长曲线以及剂量反应曲线。实验结果表明在dmem培养基 中孵育96h后，400μm以上5-cqa会显著抑制肝细胞的增殖，800μm 5-cqa 对肝细胞具有急性毒性作用，膳食水平5-cqa(＜200μm)对肝细胞增殖具有 微弱的促进作用，但是无统计学意义。5-cqa抑制肝细胞增殖的半抑制浓度 (ic50)为613.1μm。
[0051]
实施例2.评价5-咖啡酰奎尼酸对肝细胞的毒性作用
[0052]
1.乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒分析5-cqa对肝细胞的毒性作用
[0053]
1.1实验方法：
[0054]
1.1.1样品的准备(ldh释放检测)
[0055]
细胞起始接种密度为2
×
103个细胞/孔，96孔板。在37℃细胞培养箱中孵育24 h后，吸去培养液，用pbs液洗涤一次。更换为含1％fbs的新鲜dmem培养液， 100μl/孔，将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)， 未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细 胞孔(样品最大酶活性对照孔)，以及梯度浓度5-cqa处理的细胞孔(药物处理 样品孔)，并做好标记。在37℃细胞培养箱中孵育48h后，在不同组培养孔中补 加等体积相同培养基。孵育95h时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品 最大酶活性对照孔”中加入20μl试剂盒提供的ldh释放试剂，反复吹打数次混匀， 然后继续在细胞培养箱中孵育。孵育96h后，将细胞培养板用多孔板离心机400 g离心5min。分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即 进行样品测定。
[0056]
1.1.2检测工作液的配制(现配现用)：
[0057]
1)int溶液(1
×
)的配制：取56μl int溶液(10
×
)，加入504μl int稀释液， 混匀后即配置为560μl int溶液(1
×
)。
[0058]
2)ldh检测工作液的配制：依次加入560μl乳酸溶液、560μl int溶液(1x)、 560μl酶溶液，总共1680μl，颠倒混匀，注意避光操作。
[0059]
1.1.3样品测定：
[0060]
1)各孔分别加入60μl ldh检测工作液。
[0061]
2)混匀，室温避光缓慢震荡孵育30min。然后在490nm处测定吸光度。使用 600nm作为参考波长进行双波长测定。
[0062]
3)计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)。
[0063]
4)ldh release(100％)＝(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶 活性的吸光度-样品对照孔吸光度)
×
100
[0064]
5)绘制细胞毒性柱状图：纵座标为ldh release(100％)，横坐标为5-cqa浓 度。
[0065]
2.全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶(ldh)和碱性磷酸酶(alp)活性
[0066]
2.1实验方法：ldh和alp的测定均采用速率法，使用西门子advia2400全 自动生化分析仪进行检测，所有操作步骤均严格按照原装配套试剂说明书要求 执行。
[0067]
3.实验结果：如图2所示，细胞毒性检测实验表明适当浓度5-cqa对人正 常肝细胞具有保护作用，而过量5-cqa会显著抑制肝细胞生长以及损伤肝细胞。 (a)采用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒分析梯度浓度5-cqa对l-02细胞的 毒性作用；(b)采用生化分析仪检测与梯度浓度5-cqa孵育96h后l-02细胞 培养基上清中乳酸脱氢酶(ldh)活性，并用蛋白浓
度进行校正。图中数据均为mean
±
sd值(n＝3)，*p《0.05,***p《0.001。
[0068]
采用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒和生化分析仪检测与梯度浓度5-cqa 孵育96h，l-02细胞培养基上清与胞内ldh的活性，实验结果表明与50-300μm 5
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cqa孵育l-02细胞培养基上清中ldh活性显著降低(p＜0.05)，提示该浓度范围 5-cqa对l-02具有保护作用。然而600μm 5-cqa会导致ldh活性显著上升(p＜ 0.05)，提示该浓度具有肝细胞毒性。
[0069]
实施例3.生物能量测定仪分析5-咖啡酰奎尼酸对肝细胞能量代谢的影响
[0070]
1.seahorse生物能量测定仪检测5-cqa对肝细胞氧化磷酸化水平的影响
[0071]
1.1实验方法：
[0072]
a)细胞铺板：将对数生长期内的l-02细胞系消化计数，96孔海马培养微 型板中细胞密度为2.0万/孔，100μl dmem培养基，每种细胞系8个复孔，并 在培养板的四个角的孔中加入不含细胞的培养基作为空白对照。放置于37℃， 5％co2的细胞培养箱中培养过夜；
[0073]
b)探针板水化：避光处取出探针板，拿下探针，每孔加入ph 7.4seahorse bioscience xf96校正液(ph 7.4)140μl，盖上探针。随后将探针板放置于ps装 置(37℃，无co2)中水化过夜，同时打开xf96仪器，启动xf96软件，以确 保设备稳定在37℃；
[0074]
c)xf分析培养基的配制：预先准备好一个洁净干燥的50ml小烧杯，分析 天平准确称取0.225g葡萄糖粉末于小烧杯中，在超净台中加入49ml的xf基 础培养基和1ml丙酮酸钠溶液(100mm)，反复吹打使葡萄糖粉末完全溶解。置 于37℃水浴锅锡箔纸避光温育20min，温育完成后用1m naoh调节ph至7.4。 在超净台中用0.22μm的小滤头过滤至50ml离心管中，4℃保存，用于ocr 测定；
[0075]
d)第二天，取出96孔海马培养微型板于显微镜下观察以确保细胞已完全贴 壁，吸出原有培养基，更换为含梯度浓度5-cqa的dmem培养基，100μl/孔， 37℃、5％co2细胞培养箱中孵育4h。然后弃加药培养基，加入120μl已温育 好的ocr培养基，轻轻晃动细胞板，再将培养基吸出，加入175μl新的ocr 培养基，随后将细胞培养板放入到ps装置中，约1h；
[0076]
e)ocr检测药物工作液的配制：取3个无菌的5ml ep管，每管加入3ml 的xf分析培养基，再分别向其中加入预先用dmso溶解好的浓度为2.5mm的 寡霉素，fccp，鱼藤酮和抗霉素a，依次为9.6，10.8，12，12μl，其中鱼藤酮 和抗霉素a加入到同一个ep管中，配制成浓度为：8，9，10，10μm的工作液， 吹打混匀，备用；
[0077]
f)加药：将配制好的寡霉素(oligomycin)，fccp，鱼藤酮(rotonone)/抗霉 素a(antimycin)三种工作液相应加入到探针板a,b,c三个孔中，每孔25μl， 4种药物最终浓度均为1μm。
[0078]
g)设置ocr测定程序，将探针板放入仪器中，运行程序，待探针板校正完 成后按要求更换细胞板。
[0079]
h)数据导出与分析。
[0080]
2.seahorse xf96生物能量分析仪测定5-cqa对肝细胞糖酵解水平的影响
[0081]
2.2实验方法：
[0082]
a)糖酵解测定方法与耗氧率测定方法类似，主要的不同为测试的培养基和 测试药物的配制；
[0083]
b)糖酵解测定培养基的配制：分析天平准确称取0.0146g谷氨酰胺于洁净 干燥的50ml烧杯中，于超净台加入50ml xf基础培养基，吹打使其充分溶解， 置于37℃水浴锅锡箔
纸避光温育20min，温育完成后用1m naoh调节ph至7.4。在超净台中用0.22μm的小滤头过滤至50ml离心管中，4℃保存，用于 ecar测定；
[0084]
c)ecar检测药物工作液的配制：取3个无菌的5ml ep管，每管加入3ml 的xf分析培养基，再向其中分别加入96μl的2.5m葡萄糖，9.6μl的2.5mm 寡霉素a，0.492g 2-脱氧葡萄糖，充分混匀，其中各个试剂的工作液浓度为：葡 萄糖(10mm)，寡霉素a(1μm)和2-脱氧葡萄糖(100mm)，以上药物均需现 配现用。
[0085]
3.实验结果：如图3所示，5-咖啡酰奎尼酸对肝细胞线粒体呼吸与糖酵解 途径的影响。(a)与梯度浓度5-cqa孵育后肝细胞总体的细胞耗氧率变化曲线； (b)肝细胞经5-cqa处理4h后细胞的基础呼吸；(c)最大呼吸；(d)储备 呼吸；(e)5-cqa处理对肝细胞内atp产生水平的影响；(f)经梯度浓度5
‑ꢀ
cqa预处理后肝细胞的总产酸率曲线。图中数值均为mean
±
sd值(n＝3)，*p 《0.05,***p《0.001。
[0086]
经50-400μm 5-cqa处理后，肝细胞整体ocr曲线相比对照组会显著上 升。如图3a所示，寡霉素处理后肝细胞ocr会显著的下降，而在解偶联剂fccp 处理后肝细胞ocr显著上升。有趣的是，经50-400μm 5-cqa处理后，肝细胞 的ocr上升幅度较对照组均更大，而且在50-200μm浓度范围内呈浓度依赖 性。通过对细胞进行以上4种氧化磷酸化和电子传递链调节剂处理，测定相应 的ocr，经过统计分析探讨5-cqa对肝细胞线粒体呼吸的影响。如图3a所示， 细胞测定的初始ocr(0-16min)与鱼藤酮/抗霉素a处理后细胞的ocr的差值 作为细胞的基础ocr(basal respiration)；细胞经fccp处理后增加的ocr与鱼 藤酮/抗霉素a处理后细胞的ocr之间差值为细胞的最大ocr(maximalrespiration)；细胞经fccp处理后增加的ocr与细胞测定的初始ocr之间差值 为细胞的储备呼吸(spare respiration)；初始ocr与寡霉素处理后的ocr之间 差值为细胞的atp产生(atp production)；细胞经鱼藤酮/抗霉素a处理后细胞 的ocr曲线以下部分为非线粒体呼吸(non-mitochondrial respiration)。如图3b
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e所示，肝细胞与100-400μm 5-cqa孵育4h后，肝细胞的基础呼吸、最大呼 吸和储备呼吸均会显著的上升，200-400μm 5-cqa也会显著促进肝细胞内atp 的产生，其中以200μm 5-cqa作用效果最佳。然而800μm 5-cqa对肝细胞线 粒体生物能量代谢的4个指标均未有显著影响。并且相对对照组，800μm 5-cqa 处理后肝细胞的ocr上升幅度反而更小。此外，本发明采用生物能量分析仪检 测经200-800μm 5-cqa处理4h后肝细胞的ecar值，如图3f所示，5-cqa 处理后肝细胞的糖酵解过程均未受影响。综上所述，生物能量分析仪是一种评价 5-咖啡酰奎尼酸保护肝细胞功效的理想检定方法。
[0087]
实施例4.集落克隆形成实验分析肝细胞对5-咖啡酰奎尼酸的敏感性
[0088]
1.实验方法：1)细胞铺板：首先采用血球计数板对l-02细胞进行计数，然 后接种1000个细胞于6孔板中，每组设置3个重复孔。细胞铺板24h后统一更换为 含有或者不含梯度浓度5-cqa的dmem(10％fbs)培养基，每隔3天换液1次， 细胞培养箱中培养15-20天，直到形成肉眼可见克隆。2)细胞固定：弃去培养基， 用pbs轻轻漂洗细胞2次，将6孔板倒扣吸水纸上，室温干燥15min；每孔加入2 ml甲醇，固定15min，弃甲醇，室温干燥15min。3)细胞染色：每孔加入2ml结 晶紫染色液，染色15-20min；回收染液，并用蒸馏水轻轻冲洗以去除残余染液， 室温干燥15min，拍照。
[0089]
2.统计学分析
[0090]
本发明所有数据均使用graphpad prism 5.0软件进行统计学分析，3次以上的 独
立重复实验结果用均数
±
标准差(mean
±
sd)表示，所使用的统计学方法为独 立重复样本t检验或one-way anova。p《0.05表示两组之间存在显著性统计 学差异。
[0091]
3.实验结果：如图4所示，(a)用结晶紫染色液染色检测5-cqa对l-02细 胞克隆形成能力的影响；(b)imagej软件定量分析5-cqa作用l-02细胞克隆 形成效果。图中数据均为mean
±
sd值(n＝3)，***p《0.001。
[0092]
200μm 5-cqa对l-02细胞克隆形成数量没有显著影响，然而300μm 5
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cqa几乎会完全抑制l-02细胞克隆的形成(p＜0.001)。综上所述，在50-200 μm浓度范围内，合理膳食5-cqa对肝细胞具有保护作用。然而过量5-cqa也 会显著抑制肝细胞增殖以及导致肝细胞损伤。
[0093]
对于本领域技术人员而言，可以根据上述实施方案加以改进或变换本发明， 而所有这些改进或变换都应属于本发明权利要求的保护范围。