小胶质细胞充足的脑类器官的制作方法

小胶质细胞充足的脑类器官
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求保护2019年3月29日提交的新加坡申请号10201902893s的优先权的权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中以用于所有目的。
发明领域
3.本发明一般涉及细胞培养领域。具体而言，本发明涉及用于产生小胶质细胞充足的脑类器官的方法的用途。
4.发明背景
5.小胶质细胞为中枢神经系统的常驻免疫细胞。这些常驻大脑的巨噬细胞占脑中发现的总细胞的5-10％，并在脑发育、稳态和病理学中起重要作用。小胶质细胞监测(survey)大脑并在损伤时贡献于先天性免疫反应。此外，小胶质细胞不断与神经元突触相互作用，贡献于突触重塑和轴突生长。然而，因为缺乏重演小胶质细胞体内发育的适当的人类模型系统，对小胶质细胞的大部分研究使用动物模型进行。然而，人类模型系统对于理解小胶质细胞如何影响人中枢神经系统发育、生理学和病理学而言将是极其重要的。
6.随着干细胞技术的新进展，目前可能产生人诱导多能干细胞(ipsc)来源的三维脑类器官，其在一定程度上模拟人胎脑。已显示这些脑类器官形成神经上皮玫瑰花结(rosette)，其类似于发育中的大脑皮层。另外，在脑类器官中亦观察到中间祖细胞(tbr2-阳性)和皮质神经元的不同亚型(tbr1-阳性、ctip-阳性、satb2-阳性和cux1-阳性)。转录组学研究进一步显示，在这些类器官中产生的神经元细胞类型类似于人胎脑中的内源对应物。然而，尽管有这些相似性，因大多数缺乏脑发育和成熟所必需的小胶质细胞，现有的脑类器官仍未能完全重现人胎脑。就小胶质细胞在这些类器官中的出现而言，用以产生脑类器官的方法得到了不一致的结果。这阻碍了以破译人小胶质细胞在脑发育早期的作用为目标的小胶质细胞研究。
7.因此需要开发用于产生含有小胶质细胞的脑类器官的方法。
8.发明概述
9.在一方面，提供了用于产生小胶质细胞充足的脑类器官的方法，其包括以下步骤：将原始样(primitive-like)巨噬细胞与介于约15至约30日龄的脑类器官一起在低吸附细胞培养容器中的含csf-1的大脑类器官培养基中孵育以产生小胶质细胞。
10.在另一方面，提供了通过如本文所述的方法获得的小胶质细胞充足的脑类器官。
11.在另一方面，提供了用于筛选靶定小胶质细胞功能的化合物的方法，其包括以下步骤：将如本文所述的小胶质细胞充足的脑类器官与所述化合物接触并分析小胶质细胞的预定特性。
12.在另一方面，提供了用于筛选治疗神经退行性疾病的化合物的方法，其包括以下步骤：将如本文所述的小胶质细胞充足的脑类器官与所述化合物接触并分析小胶质细胞的预定特性。
13.在另一方面，提供了试剂盒，当用于如本文所述的方法时，其包括含csf-1的大脑
类器官培养基连同使用说明书。
14.在另一方面，提供了从小胶质细胞充足的脑类器官中分离一种或多种预定细胞群的方法，其包括以下步骤：
15.a)将小胶质细胞充足的脑类器官在消化液中于37℃孵育约30分钟；
16.b)机械搅动来自步骤a)的小胶质细胞充足的脑类器官；
17.c)使来自步骤b)的小胶质细胞充足的脑类器官在1400rpm于37℃热处理10分钟；
18.d)机械搅动来自步骤c)的小胶质细胞充足的脑类器官；
19.e)将来自步骤d)的小胶质细胞充足的脑类器官在室温孵育以允许碎片沉降；
20.f)移出消化液；
21.g)从消化液中分离一种或多种预定细胞群。
22.定义
23.如在本技术的上下文中使用的术语“类器官”，是指模拟器官的组织和功能的三维细胞结构。类器官由组织特异性细胞类型构成，其通过细胞分选和空间限制的谱系定向(commitment)自组织(self-organize)。类器官可来源于干细胞，例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞。术语“脑类器官”和“大脑类器官”在本说明书中可交换使用，是指具有类似于大脑的解剖学特征的类器官。一般会理解的是，脑类器官或大脑类器官由大脑的各种细胞类型组成。这些细胞类型可具有不同的发育潜能，某些细胞类型比其他细胞类型分化程度更低。
24.如在本文中使用的术语“小胶质细胞”，是指涉及中枢神经系统内的免疫系统调节的一类神经胶质细胞。这些细胞为存在于大脑中的中枢神经系统的组成型细胞。小胶质细胞构成脑中总神经胶质细胞群的20％。小胶质细胞在健康的中枢神经系统发育中起关键作用，并涉及影响中枢神经系统的疾病的发病、进展和消除。已知小胶质细胞选择性定植皮层的增殖区并吞噬神经前体细胞。小胶质细胞亦因其吞噬β淀粉样肽的能力而为人所知。如在本文中使用的术语“imicro”，是指模拟体内发现的小胶质细胞的细胞。可通过将原始巨噬细胞或原始样巨噬细胞与脑类器官共培养来产生imicro。术语“imicro”和“小胶质细胞样细胞”可交换使用。一般会理解的是，就表型、基因型和功能而言，小胶质细胞样细胞基本上类似于小胶质细胞。与小胶质细胞类似，小胶质细胞样细胞能够吞噬β淀粉样肽并在机械损伤之后延伸其树突。小胶质细胞样细胞亦在脑类器官中展现变形虫样形态，这是脑发育早期阶段的胎脑中的小胶质细胞展现的典型形态。小胶质细胞样细胞亦表达小胶质细胞特异性标志物，例如tmem119、p2ry12、sall1和merk。如在本文中使用的术语“小胶质细胞充足的脑类器官”，是指含有小胶质细胞或小胶质细胞样细胞的脑类器官。小胶质细胞充足的脑类器官可以是前脑类器官、中脑类器官或后脑类器官。前脑类器官可以是下丘脑类器官。
25.如在本文中使用的术语“干细胞”，是指能够自我复制并能够分化成更高程度特化细胞的细胞。干细胞可包括但不限于胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞。多能干细胞为能够分化成三胚层(内胚层、中胚层或外胚层)的任一层的细胞。“胚胎干细胞”为胚泡的内细胞团的多能干细胞。“诱导多能干细胞”为从非多能细胞人工获得的多能干细胞，所述非多能细胞可以是成体体细胞。如在本文中使用的干细胞可包括但不限于人类、非人灵长类、鼠类和禽类干细胞。
26.如在本文中使用的术语“分化”是指这样的发育过程，细胞通过所述发育过程比其
直接前体细胞在发育路径进一步发育。分化细胞是指一种更高程度特化的细胞类型的细胞，其来源于细胞分化过程中的更低程度特化的细胞类型的细胞。分化细胞为在细胞谱系内具有更确定位置的细胞。
27.如在本文中使用的术语“神经祖细胞”(npc)，是指可分化成神经元和神经胶质细胞的神经系统的非成熟细胞。npc表达神经细胞系所特有的表型标志物，包括cd271、巢蛋白(nestin)、pax6、sox1、sox2、vim和hes2。npc可随例如神经元和神经胶质细胞等其他细胞类型一起存在于脑类器官中。co-npc是指与imac共培养的脑类器官的npc。
28.对于本技术的目的，术语“细胞培养”是指这样的过程，细胞通过所述过程在模拟其天然环境的控制培养基下在体外生长。细胞培养条件对于各种细胞类型而言不同，但可由具有一种或多种基底或者一种或多种培养基的合适容器组成，所述基底或培养基提供细胞生长所需的必需营养物并调节生化环境。可以在共培养中共同孵育两种或更多种细胞类型，其中将所述两种或更多种细胞维持在适于其共同生长的条件中。两种或更多种细胞类型可在相同表面或不同表面上生长。当两种或更多种细胞类型共培养或在相同的细胞培养中孵育时，细胞能够相互作用，由此一种细胞产生的分泌性可溶介质(mediator)可与另一种细胞相互作用。
29.本说明书上下文中的术语“巨噬细胞”，是指涉及探测、吞噬和杀灭细菌及其他有害生物的特化细胞。巨噬细胞在免疫和免疫反应中起重要作用。原始巨噬细胞在卵黄囊中产生自早期红骨髓祖细胞，并进一步分化成小胶质细胞。如在本文中使用的术语“imac”，是指模拟体内发现的原始巨噬细胞的细胞。术语“imac”和“原始样巨噬细胞”可交换使用。imac或原始样巨噬细胞可来源于多能细胞，例如ipsc或esc。一般会理解的是，就表型、基因型和功能而言，原始样巨噬细胞基本上类似于原始巨噬细胞。与原始巨噬细胞类似，原始样巨噬细胞表现出吞噬能力，以及在lps刺激之后释放促炎细胞因子，例如tnf-α、il-1β和il-6。如在本文中使用的术语“co-imac”，是指与脑类器官共培养的imac。
30.附图简述
31.当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详述将更好地理解本发明，其中：
32.图1显示脑类器官中的imac(ipsc来源的原始样巨噬细胞)的表征。a)显示产生小胶质细胞充足的脑类器官的示意图概述。在b)中，将脑类器官与imac共培养18天，用苯甲醇和苯甲酸苄酯(babb)透明化并以3d整体成像。方框区域在右边突出显示。箭头，类器官上的imac簇。c)共培养脑类器官的切片和免疫组织化学显示了类器官中imac的存在。方框区域在右边突出显示。在d)中，ki67免疫组织化学染色显示类器官中的某些imac为ki67阳性的，表明其在类器官中的增殖能力。e)显示gfp-阳性imac朝向双光子激光烧蚀诱导的神经损伤延伸其树突。f)显示gfp-阳性imac在类器官中活跃移动且其中某些含ab1-42肽-tamra，表明其检视(survey)类器官并吞噬肽的能力。方框区域在右边突出显示。
33.图2显示imac限制类器官的生长和神经祖细胞(npc)数量。a)显示在不存在和存在imac的情况下培养18天的第44天脑类器官的代表性3d影像。在不存在和存在imac的情况下随时间测定类器官大小的变化。b)显示流式细胞仪数据，显示了用以区分来自类器官的imac、npc、神经元和神经胶质细胞的标志物。构成每个类器官的各细胞类型的数量和％均获自流式细胞仪。
34.图3显示imac促进类器官中的轴突发生(axonogenesis)。a)显示单细胞rna-seq试
验程序的示意图概述。b)显示t-分布式随机邻域嵌入(t-sne)图，显示了在不存在imac(仅类器官)和存在imac(共培养)的情况下培养的类器官的细胞。在图中使用标记来标识4种主要群体(npc、神经元、imac和间充质细胞)。方框内为来自共培养的imac细胞簇并在右边突出显示。c)显示对共培养npc(co-npc)和共培养神经元(co-神经元)中的上调基因的go分析的结果，揭示了轴突发育和再生途径。d)为火山图，显示co-npc上调轴突长出(outgrowth)相关的蛋白(prph和dpysl4)。在e)中，免疫染色数据显示，co-npc与仅npc相比具有更多且更长的轴突。f)为火山图，显示共培养imac(co-imac)上调涉及神经发生和轴突发育的基因。g)显示对co-imac中上调的蛋白的go分析的结果，揭示了轴突导向途径。
35.图4显示表达plin2和脂滴的imac和胚胎小胶质细胞。a)为火山图，显示在co-imac中上调的涉及脂滴形成和脂类输出的基因。b)显示含脂滴的co-imac的活细胞成像(live imaging)。c)显示在类器官中表达脂滴和plin2的co-imac。箭头，imac中plin2和脂滴之间的重叠部分。d)显示微阵列数据，显示了plin2仅在小鼠脑发育的早期阶段在小胶质细胞中表达。e)显示免疫染色，显示了在小鼠胚胎小胶质细胞(e13.5)中表达的脂滴和plin2。f)显示免疫染色，显示了在人胚胎小胶质细胞(15周)中表达的脂滴和plin2。
36.图5显示imac影响类器官中的细胞的脂含量和代谢。a)描绘了火山图，显示co-npc中涉及糖酵解、oxphos和胆固醇生物合成的基因和蛋白的表达水平变化。b)显示go分析的结果，表明胆固醇生物合成途径为co-npc中下调最显著的途径。c)显示在共培养的类器官中发现更多脂滴。d)显示流式细胞仪数据，显示了co-npc与仅npc相比含有更高的脂含量。e)显示来自基于质谱的脂质组学数据，显示co-npc中更高水平的ce、dag和tag。
37.图6显示存在从imac向类器官中的细胞转运胆固醇。a)描绘了流式细胞仪数据和免疫染色，显示imac摄取bodipy-ce并将其储存在脂滴中。b)描绘了流式细胞仪数据，显示与imac共培养7天之后在类器官的细胞中发现的bodipy-ce。c)显示从类器官中分选的含bodipy-ce的co-npc。
38.图7显示与仅accutase处理相比，accutase和胶原酶处理从类器官中释放更多的活细胞。accutase在既往研究中常用于类器官的消化。仅使用accutase或使用accutase和胶原酶处理与imac共培养15-21天的类器官。连同胶原酶一起使用accutase，允许使用荧光激活细胞分选法(facs)从类器官中分选出更多的imac和其他细胞类型，以用于bulk-rna-seq和其他下游试验，例如单细胞分析、npc的2d培养。
39.图8显示在不存在或存在imac的情况下生长18天的类器官的大小。
40.发明详述
41.在第一方面，本发明涉及用于产生小胶质细胞充足的脑类器官的方法，其包括步骤：将原始样巨噬细胞与介于约15至约30日龄的脑类器官一起在低吸附细胞培养容器中的含csf-1的大脑类器官培养基中孵育以产生小胶质细胞。低吸附细胞培养容器可以是低吸附多孔板或超低吸附多孔板。本领域通常理解的是，低吸附或超低吸附细胞培养容器或培养板为阻止细胞吸附到容器或培养板上的容器或培养板。低吸附或超低吸附可通过多种手段来实现，例如通过用阻止细胞吸附的化合物涂敷容器或培养板。在一个实施方案中，低吸附细胞培养容器为超低吸附多孔板。
42.在一个实施方案中，脑类器官距离多能状态约23-29日龄。这将理解为意指多能细胞已分化约23-29日龄以产生脑类器官。在一个优选的实施方案中，脑类器官距离多能状态
约26日龄。
43.在一个实施方案中，大脑类器官培养基包含约25-100ng/ml csf-1。在另一个实施方案中，大脑类器官培养基包含100ng/ml csf-1。
44.在一个实施方案中，将少于约200,000个原始样巨噬细胞与脑类器官一起培养。在另一个实施方案中，将约150,000个或更少的原始样巨噬细胞与脑类器官一起培养。
45.在一个实施方案中，培养原始样巨噬细胞和脑类器官的步骤进行至少1周。可将原始样巨噬细胞和脑类器官一起培养约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周或约12周。培养时长将取决于所需的试验终点。
46.在一个实施方案中，原始样巨噬细胞与脑类器官一起培养或共培养导致原始样巨噬细胞分化成小胶质细胞。在一个实施方案中，imac与脑类器官一起培养或共培养导致imac分化成imicro。
47.较长时间的共培养可允许观察共培养在正常情况和患病情况下的长期效应。较长时间的共培养可用于观察药物筛选的效果。
48.原始样巨噬细胞分化成小胶质细胞，可通过检测小胶质细胞应答脑中损伤或吞噬β淀粉样肽的能力来测定。亦可通过定量例如tmem119、p2ry12、sall1和merk等小胶质细胞特异性标志物的表达水平来测定至小胶质细胞的分化。
49.原始样巨噬细胞与脑类器官一起孵育，可影响类器官的大小、类器官中npc的数量和比例、类器官中npc的成熟和脂类分布。例如，原始样巨噬细胞与脑类器官一起培养，可减小类器官的大小和类器官中npc的数量。在一个实施方案中，原始样巨噬细胞与脑类器官一起培养可导致npc中涉及细胞增殖的基因下调。这些基因包括但不限于top2a、cempf、cdc20和ube2c。
50.原始样巨噬细胞与脑类器官一起孵育可促进npc的成熟。在一个实施方案中，原始样巨噬细胞可上调涉及轴突长出和神经发生的基因。这些基因可包括但不限于il-1b、il 10、nrg1、sema4c、vegfa和adam8。在另一个实施方案中，原始样巨噬细胞与脑类器官一起孵育可导致npc呈现更长且更多数量的轴突。
51.原始样巨噬细胞与脑类器官一起孵育或共培养可改善类器官中的脂类分布和npc中的脂含量。在一个实施方案中，原始样巨噬细胞与脑类器官一起孵育可导致原始样巨噬细胞中涉及脂滴形成和脂类运出的基因上调。这些基因可包括但不限于plin2、m1d1p1、arl4c、sept9和abca1。在另一个实施方案中，共培养脑类器官中的npc显示更高的中性脂含量。
52.在一个实施方案中，将通过本文所述方法产生的小胶质细胞充足的脑类器官的细胞分散并分离一种或多种预定细胞群。预定的细胞群可包括但不限于神经元、神经元祖细胞和神经胶质细胞。
53.在一个实施方案中，使用荧光激活细胞分选法(facs)或磁激活细胞分选法(macs)分离一种或多种预定细胞群。
54.在一个实施方案中，通过以下步骤从第一干细胞群产生用于如本文所述方法的原始样巨噬细胞：
55.i)在含gsk3抑制剂、bmp4和vegf的培养基中孵育所述干细胞以使所述干细胞分化成中胚层细胞系的细胞；
56.ii)在含fgf-2的培养基中孵育所述中胚层细胞系的细胞以使所述中胚层细胞系的细胞分化成成血管细胞；
57.iii)在含vegf和fgf-2的培养基中孵育所述成血管细胞；
58.iv)在含dkk1、scf、fgf2、il3和il6的培养基中孵育所述成血管细胞以使所述成血管细胞分化成造血细胞；
59.v)在含scf、fgf-2、il-3和il-6的培养基中孵育所述造血细胞以诱导所述造血细胞的成熟；
60.vi)在含csf-1的培养基中孵育所述成熟的造血细胞以使所述成熟的造血细胞分化成原始样巨噬细胞。
61.在一个实施方案中，在步骤i)中，gsk3抑制剂为chir99021并将干细胞培养长达2天以使所述干细胞分化成中胚层细胞系的细胞。
62.在另一个实施方案中，在步骤ii)中，将中胚层细胞系的细胞培养长达4天以使所述中胚层细胞系的细胞分化成成血管细胞。在又另一个实施方案中，步骤iii)和iv)在长达10天的时期进行。
63.在又另一个实施方案中，在步骤vi)中，将成熟的造血细胞培养长达10天以使所述成熟的造血细胞分化成原始样巨噬细胞。
64.在一个实施方案中，在26天的时间内产生原始样巨噬细胞。
65.在一个实施方案中，通过以下步骤从第二干细胞群产生用于如本文所述方法的脑类器官：
66.i)在低吸附细胞培养容器中孵育所述第二干细胞群以形成拟胚体(eb)；
67.ii)在神经诱导培养基中孵育所述拟胚体以使所述拟胚体分化成包含神经外胚层细胞的类器官；
68.iii)将包含神经外胚层细胞的类器官包埋在基质胶中并在含n2和无维生素a型b27的大脑类器官培养基中孵育包含神经外胚层细胞的类器官，以使所述包含神经外胚层细胞的类器官分化成包含神经上皮细胞的类器官；
69.iv)以与含有n2和含维生素a型b27的大脑类器官培养基孵育所述包含神经上皮细胞的类器官，以使所述包含神经上皮细胞的类器官分化成所述脑类器官。
70.在一个实施方案中，在从第二干细胞群产生脑类器官的方法的步骤i)中，低吸附细胞培养容器为u底培养板并将第二干细胞群培养长达6天以形成拟胚体(eb)。
71.在另一个实施方案中，在从第二干细胞群产生脑类器官的方法的步骤ii)中，将eb培养长达6天以使eb分化成包含神经外胚层细胞的类器官。
72.在又另一个实施方案中，在从第二干细胞群产生脑类器官的方法的步骤iii)中，将包含神经外胚层细胞的类器官在含无维生素a型b27的大脑类器官培养基中培养长达4天，以将所述包含神经外胚层细胞的类器官分化成所述包含神经上皮细胞的类器官。
73.在另一个实施方案中，在从第二干细胞群产生脑类器官的方法的步骤iv)之前或其期间，将基质胶从包含神经上皮细胞的类器官去除。
74.在又另一个实施方案中，在从第二干细胞群产生脑类器官的方法的步骤iv)中，以含有含维生素a型b27的大脑类器官培养基孵育包含神经上皮细胞的类器官长达26天，以将所述包含神经上皮细胞的类器官分化成脑类器官。
75.在一个实施方案中，以85rpm振荡孵育包含神经上皮细胞的类器官，以将所述包含神经上皮细胞的类器官分化成脑类器官。
76.在一个实施方案中，在约15-30天的时期从第二干细胞群产生脑类器官。在另一个实施方案中，在约23-29天的时期产生脑类器官。在一个优选的实施方案中，在约26天的时期产生脑类器官。
77.在一个实施方案中，所述第一和第二干细胞群为胚胎干细胞(esc)、诱导多能干细胞(ipsc)或其组合。在一个实施方案中，所述第一和第二干细胞群为人诱导多能干细胞。所述第一和第二干细胞群可以是相同或不同的干细胞。在一个实施方案中，所述第一和第二干细胞群为相同的干细胞。
78.在一方面，本发明提供了通过如本文所述方法获得的小胶质细胞充足的脑类器官。小胶质细胞充足的脑类器官可包含表达小胶质细胞特异性标志物的小胶质细胞样细胞，所述小胶质细胞特异性标志物例如tmem119、p2ry12、sall1和merk等。
79.在另一方面，本发明提供了用于筛选靶向小胶质细胞功能的化合物的方法，其包括以下步骤：将如本文所述的小胶质细胞充足的脑类器官与所述化合物接触并分析小胶质细胞的预定特性。
80.在一个实施方案中，筛选靶向小胶质细胞功能的化合物的方法包括将化合物与小胶质细胞充足的类器官接触并将这些类器官与未接触所述化合物的类器官进行比较。该方法可进一步包括下游分析，包括功能研究(神经元电活动、小胶质细胞吞噬β淀粉样肽及其对机械损伤的反应)、单rna测序以及可促成神经元疾病的代谢改变的分析。
81.在一方面，本发明提供了用于筛选治疗神经退行性疾病的化合物的方法，其包括步骤：将如本文所述的小胶质细胞充足的脑类器官与所述化合物接触并分析小胶质细胞的预定特性。
82.在一个实施方案中，筛选治疗神经退行性疾病的化合物的方法包括将化合物与小胶质细胞充足的类器官接触并将这些类器官与未接触所述化合物的类器官进行比较。该方法可进一步包括下游分析，包括功能研究(神经元电活动、小胶质细胞吞噬β淀粉样肽及其对机械损伤的反应)、单rna测序以及可促成神经元疾病的代谢改变的分析。
83.所述预定特性可以是小胶质细胞的形态学特征、流式细胞仪图谱、基因表达谱、分布模式或其组合。
84.在一方面，本发明提供了一种试剂盒，当用于如在本文中所述的方法时，其包括含csf-1的大脑类器官培养基连同使用说明书。
85.在一个实施方案中，如本文所述的试剂盒进一步包括
86.a)含gsk3抑制剂、bmp4和vegf的第一培养基；
87.b)含bmp4、vegf和fgf-2的第二培养基；
88.c)含vegf和fgf-1的第三培养基；
89.d)含vegf、dkk1、scf、fgf-2、il-3和il-6的第四培养基；
90.e)含fgf、il6、il3和scf的第五培养基；和
91.f)含csf-1的第六培养基；
92.以从第一干细胞群产生原始样巨噬细胞；和
93.g)神经诱导培养基；
94.h)含n2和无维生素a型b27的大脑类器官培养基；和
95.i)含有n2和含维生素a型b27的大脑类器官培养基；
96.以从第二干细胞群产生脑类器官。
97.在一方面，本发明提供了从小胶质细胞充足的脑类器官中分离一种或多种预定细胞群的方法，其包括以下步骤：
98.a)将小胶质细胞充足的脑类器官在消化液中于37℃孵育约30分钟；
99.b)机械搅动来自步骤a)的小胶质细胞充足的脑类器官；
100.c)使来自步骤b)的小胶质细胞充足的脑类器官在1400rpm于37℃热处理10分钟；
101.d)机械搅动来自步骤c)的小胶质细胞充足的脑类器官；
102.e)将来自步骤d)的小胶质细胞充足的脑类器官在室温孵育以允许碎片沉降；
103.f)移出消化液；
104.g)从消化液中分离一种或多种预定细胞群。
105.在一个实施方案中，将步骤c)-f)重复至少再两次。
106.在另一个实施方案中，在步骤g)之前过滤并离心消化液。
107.在一个实施方案中，通过facs或macs分离一种或多种预定细胞群。所述一种或多种预定细胞群可包括但不限于神经元、神经元祖细胞、神经胶质细胞和原始样巨噬细胞。
108.在另一个实施方案中，消化液为比率9:1的accutase和胶原酶。
109.在一个实施方案中，将来自步骤g)的消化液过滤并进行下游试验。下游试验可包括但不限于流式细胞术、分选和免疫染色。
110.在本文中说明性描述的本发明可在不存在任一个要素或任何要素、任一个限制或任何限制的情况下适当实施，所述要素、限制未在本文中具体公开。因此，例如术语“包含”、“包括”、“含有”等，应扩展且不受限制地理解。另外，本文中所用的术语和表达是用作描述的术语而非限制的术语，以及不意图在使用所述术语和表达时排除显示和描述的特征的任何等同物或其部分，但认为在权利要求的发明范围内的各种修改为可能的。因此，应理解的是，尽管通过优选的实施方案和任选特征具体公开了本发明，但本文所公开的其中实施的本发明的修改和变动为本领域技术人员可采用的，且认为所述修改和变动在本发明的范围之内。
111.本文概括且通用地描述了本发明。落入通用公开内容之内的更窄的种类和亚属分组各自亦形成本发明的部分。这包括具有从属中移除任何主题物质的限制性条款或否定限制的本发明的通用描述，而不论移除的物质是否在本文中具体描述。
112.其他实施方案在下文权利要求和非限制性实施例之内。此外，当以马库什组的方式描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识的是，本发明亦因此以马库什组的任何独立元素或元素的亚组来描述本发明。
113.试验部分
114.通过参考具体实施例，将更详细地进一步描述本发明的非限制性实施例和比较性实施例，不应将所述实施例理解成以任何方式限制本发明的范围。
115.材料和方法
116.人ipsc来源的巨噬细胞产生
117.为了产生人imac，在第一步(第0-6天)，使用添加chir99021的改良方案重建中胚
层构造(specification)并诱导人成血管细胞样细胞形成。通过与bmp-4和vegf一起孵育来将人ipsc集落特化为中胚层，并通过在分化的头2天与chir99021一起孵育来增强其分化。通过加入fgf-2替换chir99021来诱导成血管细胞形成(第2-4天)，然后用vegf和fgf-2维持(第4-6天)。在下一步(第6-10天)，特别添加dkk1(抑制wnt信号转导以促进原始血细胞生成的wnt拮抗剂)来诱导成血管细胞向造血细胞的定型。通过继续与scf、fgf-2、il-3和il-6一起孵育来使造血细胞成熟，加入所述细胞因子以促进血细胞生成成熟和csf-1r表达(第12-16天)。从第16天起，通过暴露给csf-1来起始向人imac的最终分化。更详细地说，将人ipsc(hd33i)培养至75％汇合，然后用1mg/ml胶原酶(gibco，17104-019)消化20分钟。通过机械刮取收集细胞，产生50-200um的聚集物，在300g离心，用mtesr1重悬并以1:25的比率(大约1.0x 105个细胞)传代至基质胶包被的6孔板上。从次日开始，每隔一天更换全部培养基，在分化过程期间，使细胞在补充有以下细胞因子的stempro培养基中培养接着的16天：分化第0天(5ng/ml bmp4、50ng/ml vegf和2um chir99021)，分化第2天(5ng/ml bmp4、50ng/ml vegf和20ng/ml fgf2)，分化第4天(15ng/ml vegf和5ng/ml fgf2)，分化第6-10天(10ng/ml vegf、10ng/ml fgf2、50ng/ml scf、30ng/ml dkk-1(rnd，5439-dk)、10ng/ml il-6(rnd，206-il)和20ng/ml il-3)，分化第12和14天(10ng/ml fgf2、50ng/ml scf、10ng/ml il-6和20ng/ml il-3)。从第16天分化开始，将细胞转至补充有50ng/ml csf-1的sf-diff，并且每3天进行全部培养基更换直至第25天分化，这是漂浮细胞用于试验的时间。亦将细胞在低氧培养箱中培养前8天，设置成5％co2和5％o2，并在第8天分化之后在标准培养箱中培养。漂浮细胞通常在约分化第7天出现，将其收集并在培养基更换期间再接种至基底细胞上。
118.产生ipsc来源的脑类器官
119.使用以下方案产生三维脑类器官。从第0天至第6天，通过在含hesc培养基的低吸附u底96孔板中培养人ipsc来形成拟胚体(eb)。从第6天至第11天，通过在神经诱导培养基中培养eb来诱导神经外胚层形成。从第11天至第15天，通过用基质胶包埋类器官并将其在含大脑类器官培养基(含有无维生素a型b27)的10cm培养皿中培养来诱导神经上皮细胞形成。从第15天至第26天，将培养基更换成大脑类器官培养基(含有含维生素a型b27)并将含有类器官的10cm培养皿置于85rpm的振荡器以诱导大脑组织形成。
120.背侧和腹侧前脑类器官的产生以及与imac的共培养
121.根据birey等2017年描述的方案从人ipsc产生背侧前脑类器官(hcs)。在第0天，将人ipsc集落转移至含有补充了dorsomorphin(5um)、sb-431542(10um)和rock抑制剂(10um)的15ml hps培养基的超低吸附10cm培养皿。从第2天起，每天更换培养基(不含rock抑制剂)直至第5天。在第6天，将培养基更换成补充有egf2(20ng/ml)和fgf2(20ng/ml)的神经培养基(nm)以用于接着的19天(前10天每天更换培养基，以及后9天每隔一天更换培养基)。从第25天起，将fgf2和egf更换成bdnf(20ng/ml)和nt3(20ng/ml)(每隔一天更换培养基)。从第43天起，将不含生长因子的nm用于每四天的培养基更换。根据birey等2017年描述的方案从人ipsc产生腹侧前脑类器官(hss)。除了从第4天至第23天添加iwp-2(5um)同时从第12天至第23天添加sag(100nm)，使用与背侧类器官相同的方案。将腹侧前脑类器官与gfp阳性imac共培养2周，然后与背侧前脑类器官融合。为了使背侧和腹侧前脑类器官融合，将类器官置于1.5ml微量离心管中并培养3天，在第2天更换培养基。融合之后，将类器官转移至iwaki板。使用基质胶将类器官稳定在iwaki板上。使用共聚焦激光扫描电子显微镜(olympus，日
本)获取活细胞影像并使用imaris软件(bitplane)分析。
122.从人ipsc培养前脑类器官
123.为了产生前脑特异性类器官，在传代后7天用iv型胶原酶分离人ipsc集落，用新鲜干细胞培养基洗涤并在15ml锥形离心管中培养。在第1天，将经分离和洗涤的ipsc集落转移至含3ml干细胞培养基(无fgf-2)加上2μm dorsomorphine(sigma)和2μm a83-01(tocris)的超低吸附6孔板(corning costar)。在第5-6天，将一半的培养基替换成由dmem:f12、1xn2添加剂(invitrogen)、10μg/ml肝素(sigma)、1x青霉素/链霉素、1x非必需氨基酸、1x glutamax、4ng/ml wnt-3a(r&d systems)、1μmchir99021(cellagentech)和1μm sb-431542(cellagentech)组成的诱导培养基。在第7天，用基质胶(bd biosciences)包埋类器官并使之继续在诱导培养基中生长再6天。在第14天，通过使用5ml移液枪头吹吸(pipetting up and down)将包埋的类器官从基质胶机械分离到培养板上。通常将10-20个类器官转移至含分化培养基的12孔旋转式生物反应器(spinω)的各孔，所述分化培养基由dmem:f12、1x n2和b27添加剂(invitrogen)、1x青霉素/链霉素、1x 2-巯基乙醇、1x非必需氨基酸、2.5μg/ml胰岛素(sigma)组成。在第71天，将分化培养基换为成熟培养基，其由neurobasal(gibco)、1x b27添加剂、1x青霉素/链霉素、1x 2-巯基乙醇、0.2mm抗坏血酸、20ng/ml bdnf(peprotech)、20ng/ml gdnf(peprotech)、1ng/ml tfgβ(peprotech)和0.5mm camp(sigma)组成。类器官可在成熟培养基中生长超过110天。每隔一天更换全部培养基。对于静止培养，遵循相同方案产生第14天的类器官，然后将其维持在具有分化培养基的超低吸附6孔板(corning costar)中。
124.从人ipsc培养中脑类器官
125.为了产生中脑特异性类器官，在传代后7天用iv型胶原酶分离人ipsc集落并在15ml锥形离心管中用新鲜的干细胞培养基洗涤。在第1天，将经分离和洗涤的ipsc集落转移至含eb培养基的超低吸附6孔板，所述eb培养基由dmem:f12、15％knockout血清替代物、1x glutamax、1x2-巯基乙醇、100nm ldn-193189、10μm sb-431542、100ng/ml shh(peprotech)、2μm purmorphamine(stemgent)、100ng/ml fgf-8(peprotech)组成。在第5天，将eb培养基逐渐转换成shh培养基，其由dmem:f12、1x n2添加剂、1x glutamax、100nm ldn-193189、3μm chir99021、100ng/ml shh、2μm purmorphamine、100ng/ml fgf-8组成。在第7天，将shh培养基替换成诱导培养基，其由dmem:f12、1x n2添加剂、1xglutamax、100nm ldn-193189、3μm chir99021组成。在第14天，将10-20个类器官转移至含分化培养基的spinω，所述分化培养基由neurobasal、1x b27添加剂、1xglutamax、1x 2-巯基乙醇、20ng/ml bdnf、20ng/ml gdnf、0.2mm抗坏血酸、1ng/ml tfgβ和0.5mm camp组成。每隔一天更换全部培养基。
126.从人ipsc培养下丘脑类器官
127.为了产生下丘脑特异性类器官，在传代后7天用iv型胶原酶分离人ipsc集落并在15ml锥形离心管中用新鲜的干细胞培养基洗涤。在第1天，将经分离和洗涤的ipsc集落转移至含干细胞培养基的超低吸附6孔板(corning costar)。一天之后(第2天)，将干细胞培养基替换成诱导培养基a，其由dmem:f12、10％knockout血清替代物、1x非必需氨基酸、1x青霉素/链霉素、1x 2-巯基乙醇、1x glutamax、2.5μm ldn-193189(stemgent)、3μm sb-431542和450μm 1-硫代甘油(sigma)。在第4天，将培养基转换成诱导培养基b，其由dmem:f12、10％
knockout血清替代物、1x非必需氨基酸、1x青霉素/链霉素、1x glutamax、1x n2添加剂、10ng/ml wnt-3a、20ng/ml shh和2μm purmorphamine组成。在第7天，将5-10个类器官转移至12孔旋转生物反应器并将诱导培养基b替换成分化培养基，其由dmem:f12/neurobasal(1:1比率)、1x b27添加剂、1x非必需氨基酸、1x青霉素/链霉素、1x glutamax、10ng/ml fgf-2和10ng/ml ctnf(peprotech)组成。每隔一天更换培养基。
128.用于神经诱导培养基的试剂配制
129.将dmem-f12与1％n2添加剂(体积/体积)、1％glutamax添加剂(体积/体积)和1％mem-neaa(体积/体积)合并。加入肝素(终浓度1μg ml-1
)并使用真空驱动0.2μm过滤装置过滤培养基。
130.用于大脑类器官分化培养基的试剂配制
131.对于约250ml的培养基，将125ml dmem-f12与125ml neurobasal、1.25ml n2添加剂、62.5μl胰岛素、2.5ml glutamax添加剂、2.5ml mem-neaa和2.5ml青霉素-链霉素合并。在dmem-f12中配制1:100稀释的2-巯基乙醇并将87.5μl的该溶液加入培养基中。加入2.5ml b27添加剂。
132.从小胶质细胞充足的脑类器官中分离一种或多种预定细胞群的消化方案
133.将类器官置于含0.6ml消化液的1.5ml eppendorf管中，所述消化液含有以9:1的比率混合的accutase和胶原酶。于37℃孵育30分钟之后，通过使用1ml移液枪头轻柔吹吸10次来搅动混合物，以从类器官中释放细胞。将混合物置于1400rpm的加热块中于37℃处理10分钟以进一步从类器官中释放细胞。通过使用1ml移液枪头轻柔吹吸10次来搅动混合物，以进一步从类器官中释放细胞。使混合物在室温孵育以允许碎片沉降至离心管的底部，并收集含有已消化细胞的上清液。向含有碎片的离心管中加入新的消化液。使所述离心管经历另一轮加热块处理和吹吸以从上清液(消化液)中收集更多单细胞。使收集的上清液过滤通过70um滤纸，离心并用抗体染色以用于facs。神经元、神经元祖细胞、神经胶质细胞和原始样巨噬细胞(imac)能够使用facs分离。
134.实施例1：原始样巨噬细胞(imac)定植脑类器官并分化成在功能上有活性的小胶质细胞样细胞(imicro)
135.使用图1a所示的方案，从相同的人ipsc产生大脑类器官和原始样巨噬细胞(imac)。早至受孕后4.5周便在人胎脑中观察到小胶质细胞。将imac与模拟早期妊娠阶段胎脑的相对年轻的脑类器官(第26天)共培养。使用补充有100ng/ml csf-1的类器官生长培养基进行共培养，每三天更换一半培养基。另外，用于共培养的超低吸附24孔板使imac最小程度地吸附到培养板上，从而使其与类器官的物理相互作用达到最大。另外，每孔培养一个类器官，这确保有足够的空间和营养物用于其生存和生长。
136.共培养15天之后，观察到imac以单个细胞以及以细胞簇定植在类器官的表面(图1b)。类器官的横断面影像显示，亦在类器官内部发现许多的imac，表明其穿透进入类器官的能力(图1c)。在类器官中发现的某些imac为ki67

，表明其增殖能力(图1d)。
137.小胶质细胞因其应答脑中的炎症或损伤的能力而为人所知。为了检测imac是否应答类器官中的损伤，将类器官与gfp

imac共培养并使之随后经历激光诱导的神经元损伤。活细胞成像显示，gfp

imac在损伤之后开始朝损伤部位延伸其突触，这是体内小胶质细胞面对神经元损伤的典型行为(图1e)。小胶质细胞亦因其吞噬β淀粉样肽的能力为人所知，所
imac含有脂滴(图4b)，以及免疫染色表明plin2的表达和脂滴几乎都限于co-imac，但不在类器官的其他细胞类型中(图4c)。类似地，仅在鼠胎脑和人胎脑的小胶质细胞中观察到脂滴和plin2表达(图4d和4e)。然而，在成年鼠脑和灵长类脑的小胶质细胞中未观察到其表达(未显示数据)。这表明co-imac和胚胎小胶质细胞可能在驱动神经元细胞中的代谢改变上起核心作用，所述代谢改变对于脑发育而言可能是必需的。
149.实施例5：imac影响类器官中细胞的脂含量和代谢
150.co-npc和npc之间deg的进一步分析表明，大部分deg为涉及例如糖酵解、oxphos和重要胆固醇生物合成等代谢途径的基因(图5a)。这通过蛋白质组学分析进一步验证(图5a)。基因本体(go)分析表明，胆固醇生物合成途径为co-npc中最显著下调的途径(图5b)。
151.鉴于胞内高胆固醇水平通常导致涉及胆固醇生物合成的基因下调，进行了一项研究以调查与imac共培养之后co-npc中的脂含量是否有任何增加。横截面类器官上的bodipy
tm 493/503染色(其将中性脂染色)表明，与仅类器官相比，更多脂滴存在于共培养类器官中且在类器官内分布更广泛(图5c)。接着，将类器官消化成单细胞并用bodipy
tm 493/503染色以用于流式细胞仪分析。流式细胞仪数据指出，与仅npc相比，中性脂含量在co-npc中更高(图5d)。为进一步验证此项，进行基于质谱的脂质组学以定量co-npc和仅npc中的脂类。数据表明，与仅npc相比，在co-npc中有更多的中性脂类，例如二酰基甘油(dag)、三酰基甘油(tag)和胆固醇酯(ce)(图5e)。总的说来，数据表明，添加imac调整类器官中的脂类分布以及尤其调整npc中的脂含量。
152.实施例6：imac将胆固醇转运至类器官中的细胞
153.已知星形细胞为成年脑中合成和代谢脂类的主要细胞群。已显示来自哺乳动物中枢神经系统的培养的神经元需要星形细胞来源的胆固醇以形成大量且有效的突触。然而，在脑发育的早期阶段不存在星形细胞。因此，在早期发育可通过小胶质细胞来执行所述功能。为了检验在类器官中是否存在任何的从co-imac向co-npc转运胆固醇，将imac与绿色荧光fl c12胆固醇酯(bodipy-ce)一起培养过夜，并在与类器官共培养之前用pbs洗涤三次。免疫染色显示，imac摄取bodipy-ce并将其储存在脂滴中，如通过与plin2蛋白的重叠部分所示(图6a)。然后将含bodipy-ce的imac与类器官共培养7天并对类器官进行流式细胞仪分析。流式细胞仪数据表明，类器官中的npc、神经元和神经胶质细胞含有bodipy-ce(图6b)。为进一步确认此项，从类器官中分选co-npc并进行免疫染色。影像明确显示在co-npc的内部发现ce-fitc(图6c)。总的说来，数据表明，存在从imac向类器官中的细胞转运胆固醇。
154.等同物
155.呈现上述实施例以用于阐述本发明的目的，且不应将其理解为对本发明的范围施加任何限制。将显而易见的是，可对上述和在实施例中阐述的本发明的具体实施方案做出许多修改和变动，而不会背离本发明潜在的原则。本技术意图包含所有这些修改和变动。