一种幽门螺杆菌表位肽及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种幽门螺杆菌表位肽及其应用。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(h.pylori)属于革兰氏阴性杆菌，其感染率高，可引起胃炎、胃溃疡甚至胃癌。仅有小部分被感染者会出现临床症状，而大部分无症状携带者常被忽视，间接导致了幽门螺杆菌在人群中广泛传播。迄今为止，由h.pylori感染引起的疾病主要采用三联法，即质子泵抑制剂加两种抗生素的方法进行抗菌治疗，但该方法存在抗生素耐药、副作用大、复发率高等缺陷。因此，开发新的预防及治疗h.pylori感染的方法是十分必要的。
3.卵黄抗体(免疫球蛋白卵黄，igy)是母鸡血液中存在的可传递至鸡卵黄并在仔鸡孵育过程中和孵育后对仔鸡起到保护作用的免疫球蛋白，也是卵黄中唯一的免疫球蛋白，具有良好的稳定性、耐高渗性、耐热、耐酸及耐碱性。由于卵黄抗体的制备不需要牺牲免疫过的动物，且可以连续地生产抗体，适合工业化推广应用。
4.单表位多聚抗原肽(sea-map)的设计可在较小的空间范围内聚集高浓度的有效抗原表位，使其免疫原性与线性抗原肽相比大大增强。本发明针对幽门螺杆菌设计了特异性单表位b细胞抗原肽，其本身具有良好的免疫原性，并创新性地基于这些高特异性单表位抗原肽制备了sea-map，以这些sea-map代替传统的线性肽抗原对禽类动物进行免疫，获得了特异性更强的卵黄抗体，为制备预防及治疗幽门螺杆菌的药品或制剂奠定了基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种幽门螺杆菌单表位抗原肽，所述的单表位抗原肽包含knligdkans(seq id no：1)，lpalkenngtvn(seq id no：2)，qainpdnltgs(seq id no：3)，rsryselgnty(seq id no：4)，hafikssffnsa(seq id no：5)，dkatnflgknn(seq id no：6)，skkkgsdhaa(seq id no：7)，yysfmgaelk(seq id no：8)中的任一种或其组合。
6.本发明的另一目的在于提供一种具有式i所示结构的树状表位肽，
[0007][0008]
其中，x为碱性氨基酸，z为幽门螺杆菌单表位抗原肽。
[0009]
本发明的优选技术方案中，所述的碱性氨基酸选自精氨酸(r)、赖氨酸(k)、组氨酸(h)的任一种。
[0010]
本发明的优选技术方案中，所述的单表位抗原肽选自knligdkans(seq id no：1)，lpalkenngtvn(seq id no：2)，qainpdnltgs(seq id no：3)，rsryselgnty(seq id no：4)，hafikssffnsa(seq id no：5)，dkatnflgknn(seq id no：6)，skkkgsdhaa(seq id no：7)，yysfmgaelk(seq id no：8)的任一种或其组合。
[0011]
本发明的另一目的在于提供本发明的单表位抗原肽或树状表位肽用于制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染相关疾病的药物中的应用。
[0012]
本发明的优选技术方案中，所述疾病选自急性胃炎、慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、萎缩性胃炎、胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤中的任一种或其组合。
[0013]
本发明的优选技术方案中，所述消化性溃疡选自胃溃疡、十二指肠溃疡、食管溃疡、胃空肠吻合口溃疡、胃粘膜meckel憩室溃疡中的任一种或其组合。
[0014]
本发明的另一目的在于提供一种卵黄抗体的制备方法，包括下述步骤：采用本发明的单表位抗原肽或树状表位肽免疫禽类动物，制得卵黄抗体。
[0015]
本发明的优选技术方案中，所述禽类动物选自鸡、鸭、鹅、鸟中的任一种或其组合。
[0016]
本发明的优选技术方案中，所述方法包括如下步骤：s1：采用所述单表位抗原肽或树状表位肽免疫禽类动物，制得卵黄抗体；
[0017]
s2：卵黄抗体的提取及纯化。
[0018]
本发明的优选技术方案中，s1包括下述步骤：
[0019]
(1-1)选取雌性禽类动物，将所述单表位抗原肽或树状表位肽与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，以1ml/只的免疫剂量在动物体的胸肌及大腿根部进行多点注射；
[0020]
(1-2)每隔两周，采用所述单表位抗原肽或树状表位肽与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化后的免疫原加强免疫一次，免疫剂量为1ml/只，优选加强免疫至少3次；
[0021]
(1-3)末次加强免疫后2周收集蛋，优选收集蛋至少2个月。
[0022]
本发明的优选技术方案中，收集未免疫蛋作为阴性对照品。
[0023]
本发明的优选技术方案中，s2包括下述步骤：
[0024]
(2-1)取消毒完毕的蛋，收集卵黄并刺破，量取10ml蛋黄液，加10倍双蒸水稀释，混匀后，调ph4-5，-20℃过夜，室温解冻，4℃下12000rpm离心30min，将上清液用滤纸过滤除脂，收集上清液，加入硫酸铵，使其终浓度为20％，静置1h后，4℃下12000rpm离心15min，收集沉淀；
[0025]
(2-2)将沉淀溶于20ml 0.01m ph7.4的pbs中，加入硫酸铵，使其终浓度为14％，静置1h后，4℃下12000rpm离心15min，将收集的沉淀溶于2ml 0.01m ph7.4的pbs中；置于双蒸水中搅拌透析，1h后，更换透析液1次，透析过夜后，收集透析上清液，以0.22μm滤膜过滤除菌后，无菌ep管盛装，-20℃保存。
[0026]
本发明的优选技术方案中，更换透析液2-5次，优选为3-4次。
[0027]
本发明的另一目的在于提供一种采用上述方法制备的卵黄抗体。
[0028]
本发明的另一目的在于提供所述单表位抗原肽或树状表位肽用于制备卵黄抗体中的应用。
[0029]
本发明的另一目的在于提供所述卵黄抗体在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染相关疾病的制品中的应用。
[0030]
本发明的优选技术方案中，所述制品选自药品、保健品、功能性食品、特殊医学用途配方食品(fsmp)中的任一种或其组合。
[0031]
本发明的优选技术方案中，所述药品选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、混悬液、丸剂、散剂、滴丸、糖浆剂、合剂、露剂、泡腾剂、乳剂、茶剂中的任一种或其组合。
[0032]
本发明的优选技术方案中，所述保健品选自饮品、汤品、茶、酒、蜂制品、鲜汁、药膳中的任一种或其组合。
[0033]
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
[0034]
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
[0035]
1.本发明设计并筛选出了幽门螺杆菌高免疫原性单表位抗原肽，可诱导产生针对幽门螺杆菌的高特异性抗体。
[0036]
2.基于筛选出的单表位抗原肽制备了单表位多聚抗原肽(sea-map)，树枝状表位肽的设计可增加抗原肽的分子量和生物活性，使连接的表位肽的朝向具有一致性，在单位空间内指数级增加了表位肽的特异性结合能力和反应敏感性，利于诱导产生高滴度的特异性抗体。
[0037]
3.采用源于幽门螺杆菌单表位抗原肽制备的sea-map免疫禽类动物获得了高特异性卵黄抗体，对幽门螺杆菌的抑制率高，利于大规模工业生产，为幽门螺杆菌感染相关疾病的预防和治疗提供了新的手段。
具体实施方式
[0038]
以下结合具体实施方案对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0039]
实施例1卵黄抗体的制备
[0040]
选取20周龄母鸡，将seq id no：1-8所示的单表位抗原肽分别与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，以1ml/只的剂量在母鸡的胸肌及大腿根部进行多点注射；每隔两周，采用所述单表位抗原肽或树状表位肽与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化后的免疫原加强免疫一次，免疫剂量1ml/只，共加强免疫3次；末次加强免疫后2周收集鸡蛋，同时收集未免疫蛋作为阴性对照品。
[0041]
取消毒完毕的鸡蛋，收集卵黄并刺破，量取10ml蛋黄液，加10倍双蒸水稀释，混匀后，调ph值为4-5，-20℃过夜，室温解冻，4℃下12000rpm离心30min，将上清液用滤纸过滤除脂，收集上清液，加入硫酸铵，使其终浓度为20％，静置1h后，4℃下12000rpm离心15min，收集沉淀；将沉淀溶于20ml 0.01m ph7.4的pbs中，再加入硫酸铵，使其终浓度为14％，静置1h后，4℃下12000rpm离心15min，将收集的沉淀溶于2ml 0.01m ph7.4的pbs中；置于双蒸水中搅拌透析，1h后更换透析液1次，共4-5次，透析过夜后，收集透析液，以0.22μm滤膜过滤除菌后，无菌ep管盛装，-20℃保存。采用elisa法测定不同抗原肽所获得的卵黄抗体的效价，结果见表1。
[0042]
表1
[0043]
线状单表位抗原肽卵黄抗体效价阴性对照——seq id no：11:512seq id no：21:1024seq id no：31:1024seq id no：41:256seq id no：51:1024seq id no：61:512seq id no：71:1024seq id no：81:1024
[0044]
实施例2卵黄抗体的制备
[0045]
选取20周龄母鸡，将基于seq id no：1-8所示的单表位抗原肽通过固相合成法制备的树状表位肽分别与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，按照实施例1的方法免疫母鸡并提取纯化卵黄抗体。采用elisa法测定不同树状表位肽所获得的卵黄抗体的效价，结果见表2。
[0046]
表2
[0047]
编号树状表位肽卵黄抗体效价1阴性对照——2式i，其中x＝r，z＝seq id no：11:64003式i，其中x＝r，z＝seq id no：21:64004式i，其中x＝r，z＝seq id no：31:128005式i，其中x＝r，z＝seq id no：41:32006式i，其中x＝r，z＝seq id no：51:256007式i，其中x＝r，z＝seq id no：61:3200
8式i，其中x＝r，z＝seq id no：71:128009式i，其中x＝r，z＝seq id no：81:6400
[0048]
实施例3卵黄抗体对幽门螺杆菌的杀菌效果
[0049]
幽门螺杆菌(h.pylori)ss1菌株于bhi培养液中，在三气培养箱(o
2 5％，co
2 15％，n
2 85％)中，37℃培养72h，菌落浓度达到109个/ml后，取1mg实施例2编号4、6、8的卵黄抗体，加入到1ml细菌悬液中，混匀后孵育1h后，将菌液涂布在bhi琼脂培养基上，上述条件下培养48h进行菌落计数，并计算抑制率。
[0050]
以牛血清白蛋白代替卵黄抗体用作空白对照，以另一种常见的口腔细菌金黄色葡萄球菌为阴性对照(lb培养基，37℃，5％co2培养)。结果见表3。
[0051]
表3
[0052]
组别菌体抑制率(％)h.pylori0s.aureus0h.pylori bsa4h.pylori 4号卵黄抗体82h.pylori 6号卵黄抗体88h.pylori 8号卵黄抗体78s.aureus bsa2s.aureus 4号卵黄抗体3s.aureus 6号卵黄抗体1s.aureus 8号卵黄抗体5
[0053]
以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。