BCAT2抑制剂在制备预防和/或治疗BCAT2介导的相关代谢疾病药物中的用途的制作方法

bcat2抑制剂在制备预防和/或治疗bcat2介导的相关代谢疾病药物中的用途
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及bcat2抑制剂在制备预防和/或治疗bcat2介导的相关代谢疾病药物中的用途。


背景技术：

2.支链氨基酸(bcaa，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)是人体必需氨基酸。研究发现支链氨基酸在肥胖症及相关代谢疾病的患者血清中显著升高，并且高支链氨基酸的饮食能够增加肥胖症及相关代谢疾病的风险，低支链氨基酸的饮食能够缓解肥胖症及相关代谢疾病。然而在肥胖症中支链氨基酸的代谢功能一直不清楚。
3.支链氨基酸转氨酶(bcat)是支链氨基酸分解代谢的关键酶。bcat参与催化支链氨基酸的第一步反应，主要有两种亚型，一种是主要位于细胞胞浆中的bcat1，另一个是主要位于线粒体中的bcat2。它们催化相同的化学反应，即将支链氨基酸上的氨基转给阿尔法-酮戊二酸(α-kg)，产生对应的支链酮酸(bcka)和谷氨酸。进一步在bckdc等一系列相关酶的催化下最终生成乙酰辅酶a(ace-coa)和琥珀酰辅酶a(suc-coa)，进入三羧酸循环。肥胖症的主要表现为脂肪组织体积的扩增，在脂肪组织中，主要表达bcat2，不表达bcat1。因此，bcat2在肥胖症中的作用值得关注，然而目前并没有在脂肪组织中研究bcat2对肥胖的作用影响，也未曾有报道bcat2抑制剂对肥胖症的治疗作用。因此无法从根本上找到能够治疗肥胖症的药物。


技术实现要素：

4.本发明通过如下技术方案实现：
5.本发明的第一方面提供了一种bcat2抑制剂在制备预防和/或治疗bcat2介导的相关代谢疾病药物中的用途；
6.进一步的，所述bcat2抑制剂为替米沙坦；
7.进一步的，所述及相关代谢疾病选自脂肪肝、肥胖症、高甘油三酯症、高血糖、胰岛素抵抗、高胆固醇血症、糖尿病、bcat2高表达引起的炎症、bcat2高表达引起的肿瘤中的任意一种或几种；
8.进一步的，所述肥胖症的治疗指增加脂肪代谢产热和/或缩小脂肪体积；
9.所述bcat2高表达引起的炎症包括但不限于：脂肪组织炎症、无菌性炎症或肿瘤免疫性炎症；
10.所述bcat2高表达引起的肿瘤包括但不限于：胰腺癌、胃癌、肺癌或肝癌。
11.本发明的第二方面提供了一种ppar激动剂在制备预防和/或治疗ppar低表达引起的相关代谢疾病药物中的应用；
12.进一步的，所述ppar激动剂为替米沙坦；
13.进一步的，所述及相关代谢疾病选自脂肪肝、肥胖症、高甘油三酯症、高血糖、胰岛
素抵抗、高胆固醇血症、糖尿病、ppar低表达引起的炎症、ppar低表达引起的肿瘤中的任意一种或几种；
14.进一步的，所述肥胖症的治疗指增加脂肪代谢产热和/或缩小脂肪体积；
15.所述ppar低表达引起的炎症包括但不限于：
16.所述ppar低表达引起的肿瘤包括但不限于：胰腺癌、胃癌、肺癌或肝癌。
17.本发明第三方面提供了一种体外抑制由酶bcat2引起酶ppar活化的方法，通过替米沙坦来体外抑制酶bcat2的表达而引起酶ppar的活化。
附图说明
18.图1 bcat2
ko
小鼠模型的建立
19.图2三种脂肪组织中bcat2蛋白的表达情况
20.图3其他器官中bcat2蛋白的表达情况
21.图4 bcat2
ko
小鼠与对照组的体重曲线，其中，图4a为小鼠形貌拍摄照片、图4b为其体重值的变化趋势对比
22.图5小鼠的糖耐受和胰岛素抵抗实验
23.图6小鼠血清的脂代谢相关指标实验
24.图7小鼠解剖后三种脂肪的外观和重量
25.图8脂肪组织的病理切片
26.图9 bcat2敲除对活体小鼠的代谢指标实验
27.图10小鼠体表温度的红外热成像测量图
28.图11敲除bcat2后基因表达分析图
29.图12敲除bcat2对ucp1产热相关蛋白的表达影响
30.图13替米沙坦对bcat20酶活曲线的影响。
31.图14等热滴定结合实验测定酶动力曲线。
32.图15 bcat20-替米沙坦结合拟合预测
33.图16质谱测定细胞内的代谢物水平
34.图17替米沙坦处理后的细胞收集蛋白检测ucp1的表达
35.图18替米沙坦处理细胞的co-ip实验
36.图19替米沙坦给药的小鼠体重曲线
37.图20小鼠的胰岛素抵抗实验
38.图21小鼠血清的脂代谢相关指标
39.图22小鼠解剖后三种脂肪的外观和重量
40.图23脂肪组织的病理切片
41.图24替米沙坦给药对活体小鼠的脂代谢相关指标
42.图25 bcat2敲除对的脂肪肝的影响
43.图26替米沙坦对脂肪肝的影响
44.有益效果
45.本发明通过实验证明:
46.1.本发明通过实验证明了抑制bcat2，能明显缓解高脂饮食造成的包括脂肪肝、高
甘油三酯症、高血糖、胰岛素抵抗、高胆固醇血症、糖尿病或者肥胖症、ppar低表达引起的炎症、ppar低表达引起的肿瘤等代谢相关疾病；
47.2.本发明通过实验证明替米沙坦(telmisartan)是bcat2的特异性抑制剂，确定替米沙坦直接结合bcat2抑制活性；
48.3.阐述替米沙坦作为bcat2抑制剂可以抑制脂肪细胞在肝中的代谢作用，有效抑制脂肪肝。
具体实施方式
49.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
50.本发明所述的替米沙坦(telmisartan)是一种非肽类血管紧张素ⅱ受体拮抗剂，可选择性的、难以逆转的阻滞ati受体，而对其他受体系统无影响。用于轻至中度高血压。结构式如式(i)所示：
[0051][0052]
以下实施例以及说明书附图中，替米沙坦或经替米沙坦处理的组均缩写为“tel”。
[0053]
实施例1敲除bcat2能够抑制肥胖症
[0054]
1.1制备小鼠模型。制备了条件性敲除bcat2的转基因小鼠模型，并通过转基因小鼠杂交分别获得aipoq-cre bcat2
flox/flox
小鼠(即bcat2
ko
小鼠，如图1所示)。使用pcr鉴定小鼠的基因型，发现bcat2
ko
小鼠是特异性的在脂肪组织中敲除bcat2的小鼠(如图2所示)，bcat2
ko
小鼠不再表达bcat2；bcat2
ko
小鼠在脂肪外的其他器官不受影响(如图3所示)。
[0055]
1.2对于脂肪的影响——改善肥胖、血糖、甘油三酯、脂肪酸、胆固醇及瘦素
[0056]
(1)高脂饲料(饲料中含脂60％)喂养bcat2
ko
小鼠和对照组小鼠(未作处理的正常小鼠)13周。bcat2
ko
小鼠能显著抵抗高脂饮食导致的肥胖，(如图4所示，图4a为小鼠形貌拍摄照片、图4b为其体重值的变化趋势对比；ko表示bcat2
ko
小鼠，wt表示未作处理的正常小鼠)；并且较对照组，bcat2
ko
小鼠血糖指标也明显改善(如图5所示，gtt和itt分别表示小鼠葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验；ko表示bcat2
ko
小鼠，wt表示未作处理的正常小鼠)；
[0057]
(2)显著改善血清中甘油三酯、脂肪酸、胆固醇及瘦素水平(如图6所示，ko表示bcat2
ko
小鼠，wt表示未作处理的正常小鼠)；
[0058]
(3)进一步分析其脂肪重量，发现在高脂饮食情况下，bcat2
ko
小鼠的白色脂肪要明显轻于对照组，说明明显减轻了肥胖症状。棕色脂肪变化不明显，说明不影响棕色脂肪的正常发育(图7a为直观体积比较，图7b为重量对比实验)；
[0059]
(4)病理分析也验证了bcat2
ko
小鼠相对于对照组，脂肪细胞大小明显小于对照组，且脂肪内脂滴更少(如图8所示)；
[0060]
(5)bcat2敲除对活体小鼠的代谢指标实验，分析小鼠的代谢活体指标，分别为耗氧量(图9a)、产热量(图9b)以及二氧化碳产量(图9c)，相对于对照组，发现bcat2
ko
小鼠代谢明显更加旺盛；基础体测也高于对照组，热成像分析也揭示bcat2
ko
小鼠的腹股沟部位(即inguinal、颜色加深区域)的温度显著高于对照组，即代谢产热量要高于对照组(如图10所示)。
[0061]
实施例2敲除bcat2能够抑制肥胖症的机制研究
[0062]
2.1在细胞水平发现潜在的机制。分离小鼠的原代脂肪细胞，取5周龄雄性小鼠，从腹部剖开，剪下两侧腹股沟脂肪，在dmem(含1％胶原酶)培养基里剪碎，于37c震荡消化2h后离心去上层油脂，dmem培养基重悬沉淀，45μm滤膜过滤去掉未消化的组织块，滤出液离心后dmem培养重悬，置于10cm细胞培养皿中在培养箱中培养。传代于6孔板，细胞接触抑制后开始诱导成熟的脂肪细胞。诱导使用含有5mm 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine),1mm地塞米松(dexamethasone)，125nm吲哚美辛(indomethacin),850nm胰岛素(insulin)，1nm 3,3',5-三碘-l-甲状腺原氨酸(3,3',5-triiodo-l-thyronine)|和1μm罗格列酮(rosiglitazone)的培养基培养两天后，换成850nm胰岛素，1nm 3,3',5-三碘-l-甲状腺原氨酸|和1μm罗格列酮的培养基4天后脂肪细胞成熟。同时从bcat2
ko
小鼠和野生型小鼠中分离，成熟后使用蛋白印迹检测各蛋白表达、代谢物水平改变、基因转录水平变化，结果发现敲除bcat2能够明显促进脂肪细胞的产热基因(ucp1、cidea、cox8)上调(如图11所示)，促进细胞能量代谢增加(如图12所示)。
[0063]
实施例3bcat2抑制剂筛选。
[0064]
3.1bcat2蛋白纯化。以293t细胞cdna为模板，进行pcr反应以获得含有双酶切位点xbai和xhol的人源bcat2的pcr产物。酶切后的pcr产物和pet28a载体1％琼脂糖凝胶分离并胶回收试剂盒进行片段回收处理。将回收片段和载体以摩尔比3:1连接。得到片段后使用限制内切酶克隆至pet28a载体，将pet28a-bcat2转化至bl21(de3)感受态细胞，取质粒转化入50μlbl21感受态细胞，冰浴30min后放入42℃水浴锅中热激30s。加入无抗生素的lb液体培养基250μl于225rpm 37℃预摇40min后涂于添加有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基平板，37℃过夜培养。诱导表达蛋白。1l菌液于16c在iptg情况下诱导表达过夜，次日离心收集细菌，使用纯化缓冲液(20mm tris ph 8.0，150mm nacl)重悬，超声破碎仪50％震幅，5s间隔破碎细菌，离心收集上清。将上清经过5ml的镍离子交换柱吸附蛋白，咪唑洗脱，(洗脱缓冲液成分：25mmtris，150mm nacl，25mm imidazole，ph7.5)，竞争下洗脱含相似结构的组氨酸标签的目的蛋白。采用ge的akta蛋白纯化系统进一步纯化后收集浓缩蛋白。先启动akta系统，待有蛋白质经过uv检测到峰值时，收集蛋白。
[0065]
3.2酶活力检测。5μl纯化的bcat2蛋白溶于200μl bcat2酶活反应体系(5μm plp,50mm(nh4)2so4(含100mm nh
4
),0.05mm nadh,5mm dtt,5mm α-酮戊二酸，10mm l-亮氨酸，0.95u亮氨酸脱氢酶，100mm磷酸缓冲液钾，ph 7.4)，检测340nm的吸光值变化，取直线区间斜率作为统计结果，与不添加bcat2蛋白的空白对照组相比，相对酶活以百分比方式表示。使用fda approved drug library，终浓度为10μm加入上述的bcat2酶活体系反应检测吸光值变化。每组重复三次，空白对照组不加抑制剂，作为活力值的100％，替米沙坦能够抑制
bcat2的酶活(如图13所示)。
[0066]
3.2测定酶动力曲线。通过改变底物亮氨酸的浓度，从0.1mm到5mm梯度。等热滴定实验使用纯化的bcat2蛋白和替米沙坦，结果如图14中上图所示，替米沙坦能够直接结合bcat2蛋白，将图14中上图的数据绘制成曲线得图14的下图(仪器自动绘制)，可以看出，替米沙坦结合bcat2蛋白后，体系短时间内急剧放热，随着时间推移，热量逐渐释放完毕，曲线变得平缓，n、k、h、s分别表示化学计量比、结合常数、焓变和熵变。
[0067]
3.3模拟bcat2和替米沙坦的结合。通过bcat2结构模型和替米沙坦化学结构进行软件拟合，发现替米沙坦能够结合在bcat2蛋白表达的一个口袋，改变了bcat2蛋白的正常结构以抑制其活性(如图15所示，图15a表示替米沙坦与bcat2蛋白的结合完成图；图15b为表示替米沙坦与bcat2蛋白结合位点的局部放大图，f30、v654为替米沙坦的结合位点；1均表示替米沙坦)。
[0068]
实施例4替米沙坦活体水平能够抑制bcat2活性
[0069]
4.1脂肪细胞使用替米沙坦5μm处理过夜，收集细胞提取代谢物发现能够显著减少bcaa下游的代谢物(如图16所示)；收集细胞蛋白进行蛋白印迹检测实验发现替米沙坦处理能够高表达代谢相关基因(如图17所示)。
[0070]
4.2替米沙坦处理细胞后的co-ip实验：脂肪细胞使用替米沙坦5μm处理过夜，使用免疫共沉淀prdm16蛋白，发现处理组能够增加与ppar的结合，增强代谢相关基因的转录水平，结果示替米沙坦能够增强pparr与prdm16的结合，从而促进ppar上调，使得脂质代谢活跃(如图18所示)。
[0071]
实施例5替米沙坦能够在小鼠水平抑制肥胖症
[0072]
替米沙坦处理小鼠实验。使用高脂饲料诱导小鼠肥胖，同时给予小鼠灌胃5mg/kg的替米沙坦，每天一次，如图19～图23所示，“hfd”表示高脂饲料喂养的小鼠，“hfd tel”表示高脂饲料与替米沙坦同时喂养的小鼠。空白对照组使用生理盐水，13周后检测小鼠体重。发现替米沙坦处理小鼠能够抵抗肥胖(如图19所示，图19a为实验前后小鼠形貌变化的照片、图19b为其体重值的变化趋势对比)；并且血糖指标也明显改善(参见图20)；分析血清瘦素、血清胆固醇、甘油三酯、脂肪酸都有明显的改善(参见图21)；进一步分析脂肪重量，发现替米沙坦处理小鼠的白色脂肪要明显轻于对照组(图22a为直观体积比较，图22b为重量对比实验)；病理分析也验证了替米沙坦处理的小鼠，脂肪细胞大小明显小于对照组，脂肪内脂滴更少(参见图23)；分析替米沙坦给药对活体小鼠的脂代谢相关指标，分别为耗氧量(图24a)、产热量(图24b)以及二氧化碳产量(图24c)，发现替米沙坦处理小鼠代谢明显更加旺盛，基础体测也高于对照组，热成像分析也揭示替米沙坦处理小鼠代谢产热量要高于对照组(如图24所示，“control”表示空白对照组；“tel”表示加入替米沙坦喂养的小鼠)。
[0073]
实施例6敲除bcat2能够抑制脂肪肝
[0074]
野生型(wt)小鼠和bcat2敲除小鼠(ko)给予高脂饮食13周后解剖示肝外观，对比图25-a1和图25-a2可以看出，bcat2敲除减轻了肝脏脂肪样变，对比图25-b1和图25-b2可以看出，病理切片显示，bcat2敲除减轻了肝细胞的脂肪浸润。
[0075]
实施例7替米沙坦能够在小鼠水平抑制脂肪肝
[0076]
对比图26-a1和图26-a2可以看出，对比对照组小鼠(hfd)和替米沙坦给药组小鼠(hfd tel)在给予高脂饮食13周后解剖示肝外观，替米沙坦减轻了肝脏脂肪样变。病理切片
并染色，对比对照组小鼠(hfd)和替米沙坦给药组小鼠(hfd tel)，由图26-b1和图25-b2可以看出替米沙坦减轻了肝细胞的脂肪浸润；
[0077]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。