有机污染物降解菌的筛选方法与流程

1.本发明涉及环境中有机污染物微生物修复技术领域，具体而言，涉及一种有机污染物降解菌的筛选方法。


背景技术：

2.石油是当今世界的主要能源支柱之一，在国民经济的发展中占有不可或缺的地位。在石油的开采、加工及运输过程中不可避免的出现泄漏和排放事故，其中我国每年约有10万吨石油进入土壤，污染土地面积约500万公顷，破坏了土壤的生态系统结构和功能，严重危害人体健康。我国主要石油化工和油田开采区(地下水、土壤)石油污染问题尤其突出。寻求针对石油类污染物经济有效、无二次污染的处理技术一直是近年来环境工程界甚为关注的热点。
3.目前，石油污染环境的修复技术主要分为：物理修复、化学修复和生物修复等。生物修复相较于物理修复和化学修复，具有成本低、操作简单、条件温和以及无二次污染等优势，具有广阔的发展前景。生物修复是指利用具有特殊功能的微生物将污染物作为碳源或能源，进行生化代谢，实现细胞增殖的目的。获得针对目标污染物具有高效降解能力的菌株，是生物修复技术中最为关键、重要的必要条件，但传统的分离、筛选方法操作繁琐、效率低下且容易遗漏有效菌株。
4.中国专利申请cn 108300674 a公布了一种石油降解菌及其获得方法和在降解原油中的应用，以原油为唯一碳源，富集培养5-7次后用pbs溶液稀释涂布，划线，分离出单菌株，后接入含原油的无机盐培养液中，检验其降解能力，以获得具有高效降解作用的菌株，其过程繁琐、筛选周期较长。中国专利申请cn 107058104 a公布了石油降解菌的培养方法，也是平板涂布、划线、斜面保藏，最后检验每一菌株的降解性能。中国专利申请cn 106754538 a公布了石油降解菌oil 2-3分离纯化方法及其应用，用于海上溢油降解，方法也是反复划线分离，直至分离筛选出生长良好、菌落单一的菌株。中国专利申请cn 107418916 a公布了筛选多环芳烃高效降解菌的方法及所得的高效降解菌，其中pahs降解菌筛选平板配置采用的是双层平板，将pahs母液与培养基混匀，等待凝固后进行后续操作。但存在如下问题：pahs母液中丙酮需要在培养基凝固前挥发完全，不易控制；上层平板中pahs的分布及厚度对于菌株对pahs的摄取有一定的影响，易遗漏有效菌株；制作过程略显繁琐。中国专利申请cn 103224885 a公布了一种基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法，具体涉及利用96孔微平板进行难降解污染物高效菌培养，但要求污染物配制成饱和的基质母液，对于原油和疏水性有机污染物并不适用。
5.因此，急需针对组分复杂、疏水性强的有机污染物建立一种快速高效筛选方法，以便于构建此类污染物的功能菌菌源库，从而进一步推动生物治理技术的发展和应用，降低经济成本。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于提供一种有机污染物降解菌的筛选方法，以缩短筛选周期。
7.为了实现上述目的，本发明提供了一种有机污染物降解菌的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤：s1，将有机污染物污染的土壤样品加入无机盐液体培养基中进行培养并进行第一次富集；s2，将第一次富集后的菌液涂布于含有有机污染物的固体培养基中进行培养筛选；s3，从培养筛选后的固体培养基中挑选单一菌落进行液体培养及第二次富集，获得降解菌。
8.进一步地，在步骤s1与步骤s2之间，筛选方法还包括：制备含有有机污染物的固体培养基的步骤。
9.进一步地，制备含有有机污染物的固体培养基的步骤包括：在无机盐培养基中加入琼脂，待琼脂凝固后得到琼脂培养基；将有机污染物涂布于琼脂培养基中，得到含有有机污染物的固体培养基；优选地，有机污染物选自原油或柴油；或者有机污染物为多环芳烃类有机物和/或烷烃类有机物。
10.进一步地，将有机污染物涂布于琼脂培养基中包括：采用稀释剂对有机污染物进行稀释，得到稀释有机物；将稀释有机物涂布于琼脂培养基中。
11.进一步地，稀释剂为石油醚、正己烷、丙酮或乙醇。
12.进一步地，固体培养基中，有机污染物与菌液的质量体积比为5:1～3:100；优选地，有机污染物为原油或柴油时，有机污染物与菌液的质量体积比为8:1～10:1；优选地，有机污染物为多环芳烃时，有机污染物与菌液的质量体积比为1:100～3:100；优选地，有机污染物为烷烃类时，有机污染物与菌液的质量体积比为5:1～8:1。
13.进一步地，步骤s1包括：s11，取0.8～1.5g的有机污染物污染的土壤样品加入无机盐液体培养基中进行振荡培养2～4天；s12，向无机盐液体培养基加入0.4～0.7g有机污染物继续培养2～4天；s13，按5％～15％的接种比例进行连续转接富集培养；优选地，无机盐液体培养基包括：na2hpo
4 0.5～0.7g/l，k2hpo
4 0.1～0.3g/l，nano
3 3～5g/l，酵母粉0.3～0.7g/l，cacl
2 0.008～0.012g/l，feso
4 0.008～0.012g/l，mgso
4 0.02～0.04g/l，ph值为7.0～7.5。
14.进一步地，在步骤s2中，将第一次富集后的菌液涂布于含有有机污染物的固体培养基中，并置于29℃～32℃进行倒置培养筛选。
15.进一步地，步骤s3包括步骤：s31，从培养筛选后的固体培养基中挑选单一菌落；s32，将单一菌落置于lb液体培养基中进行第二次富集；以及s33，将第二次富集后的菌液进行划线纯化，获得降解菌；优选地，lb液体培养基包括：牛肉膏4～6g/l，蛋白胨8～12g/l，nacl4～6g/l，ph值为7.0～7.5。
16.进一步地，有机污染物为柴油、稠油、轻质油或重质油。
17.进一步地，有机污染物为疏水性有机物，优选疏水性有机物包括菲、芘、二苯并噻吩及咔唑中的一种或多种。
18.应用本发明的技术方案，通过只需采用单层固体无机盐培养基，将菌液涂布于含有石油类物质和其他疏水性有机物的固体分离培养基上进行培养筛选。该方法避免了传统筛选方法中利用lb平板将细菌全部分离出来，再经过大量的复筛获取有效降解菌的繁琐过
程，极大的缩短了筛选周期，提高了筛选效率，易发现高效功能菌株。而且，也解决了现有技术中采用双层平板分离法中有机溶剂易干扰、污染物与菌株接触不完全、过程繁琐的问题。且该方法中的有机污染物能够为微生物提供碳源，因此能够直接利用此类碳源的微生物即可生长，以此来提高筛选降解菌株的筛选效率，对于不同种类的油品(轻质原油、稠油、重质原油、柴油等，可以通过总石油烃或含油量表示油品浓度的降解效果)或不同结构的疏水性的有机物(菲、芘、二苯并噻吩、咔唑等，可以通过某一种特定的具体的化合物组成来体现降解效果)均适用，适合进一步推广。
具体实施方式
19.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
20.如背景技术所提及的，石油污染环境的修复越来越倾向采用生物修复技术。而目前针对石油类污染物的降解菌的筛选方法存在筛选方法操作繁琐、筛选周期长等缺陷。为了缩短筛选周期，在本技术一种典型的实施例中，提供了一种有机污染物降解菌的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤：s1，将有机污染物污染的土壤样品加入无机盐液体培养基中进行培养并进行第一次富集；s2，将第一次富集后的菌液涂布于含有有机污染物的固体培养基中进行培养筛选；s3，从培养筛选后的固体培养基中挑选单一菌落进行液体培养及第二次富集；s4，将第二次富集后的菌液进行划线纯化，获得降解菌。
21.本技术的降解菌的筛选方法，通过只需采用单层固体无机盐培养基，将菌液涂布于含有石油类物质和其他疏水性有机物的固体分离培养基上进行培养筛选。该方法避免了传统筛选方法中利用lb平板将细菌全部分离出来，再经过大量的复筛获取有效降解菌的繁琐过程，极大的缩短了筛选周期，提高了筛选效率，易发现高效功能菌株。而且，也解决了现有技术中采用双层平板分离法中有机溶剂易干扰、污染物与菌株接触不完全、过程繁琐的问题。且该方法中的有机污染物能够为微生物提供碳源，因此能够直接利用此类碳源的微生物即可生长，以此来提高筛选降解菌株的筛选效率，对于不同种类的油品(轻质原油、稠油、重质原油、柴油等，可以通过总石油烃或含油量表示油品浓度的降解效果)或不同结构的疏水性的有机物(菲、芘、二苯并噻吩、咔唑等，可以通过某一种特定的具体的化合物组成来体现降解效果)均适用，适合进一步推广。
22.在步骤s1与步骤s2之间，上述筛选方法还包括：制备含有有机污染物的固体培养基的步骤。在一种优选的实施例中，制备含有有机污染物的固体培养基的步骤包括：在无机盐培养基中加入琼脂，待琼脂凝固后得到琼脂培养基；将有机污染物涂布于琼脂培养基中，得到含有有机污染物的固体培养基。
23.通常有机污染物多为疏水性的，因而尽管前期的富集培养过程中添加了有机污染物进行培养和初步筛选，但筛选条件相对温和，仍是以富集菌种为主要目的。而在制备固体培养基时，有机污染物并不能与液体无机盐培养基均匀混合，因此即使加入琼脂将其固化，也难以获得有机污染物均匀分布的培养基。因此，通过琼脂固化后再将有机污染物均匀涂布于固体培养基的表面上，这样后续再在该含有有机污染物的固体培养基上涂布菌液时，则使得菌与有机污染物均匀分布于固体培养基表面，这样能够充分利用有机污染物的筛选条件来筛选对有机污染物有抗性的菌株，这样的筛选方法避免了传统方法中需要挑不同的
单菌落进行复筛等繁琐过程，大大提高了筛选效率，缩短了筛选周期。
24.上述将有机污染物涂布于琼脂培养基中的步骤，根据具体污染物种类的不同，涂布的操作略有不同。在一种优选的实施例中，上述有机污染物涂布于琼脂培养基中的步骤包括：采用稀释剂对有机污染物进行稀释，得到稀释有机物；将稀释有机物涂布于琼脂培养基中。
25.对于柴油、轻质原油(即轻质油)等流动性较强的石油类产品可直接在固体分离培养基中涂匀。对于稠油或重油等流动性差，黏度高的油品，可以先用石油醚(60-90℃)下稀释后再进行涂匀操作。从化学结构上来看，对于多环芳烃等其他疏水性有机物，可用丙酮等制备储备液，再进行涂匀操作。需要说明的是，需要等待丙酮完全挥发完后，再进行涂布。
26.上述无论是石油醚(60～90℃)还是丙酮，都可以视为有机污染物的稀释剂。除了这两种外，稀释剂还可以是正己烷或乙醇。经实验验证的稀释剂有石油醚和丙酮，由于正己烷与石油醚类似，也可以对流动性差的油品起到一定稀释作用；而乙醇与丙酮类似，挥发性比较强，因而也可以用作稀释剂。
27.上述筛选方法中，为了在提高筛选效率，缩短筛选周期的同时，提高筛选菌株的有效性，在上述固体培养基中涂布的有机污染物与涂布的菌液可以根据污染物种类的不同进行合理配比。在一种优选的实施例中，有机污染物与菌液的质量体积比为5:1～3:100。
28.当有机污染物为原油时，两者的用量比优选控制在8:1～10:1范围内；当有机污染物为多环芳烃时，两者的用量比优选控制在1:100～3:100范围内；当有机污染物为烷烃类时，两者的用量比优选控制在5:1～8:1范围内。
29.上述步骤s1为常规操作步骤，按照已知方法进行培养富集即可。在本技术一种优选的实施例中，步骤s1包括：s11，取0.8～1.5g的有机污染物污染的土壤样品加入无机盐液体培养基中进行摇床振荡培养2～4天；s12，向无机盐液体培养基加热0.4～0.7g有机污染物继续培养2～4天；s13，按5％～15％的接种比例进行连续转接富集培养；优选地，无机盐液体培养基包括：na2hpo
4 0.5～0.7g/l，k2hpo
4 0.1～0.3g/l，nano
3 3～5g/l，酵母粉0.3～0.7g/l，cacl
2 0.008～0.012g/l，feso
4 0.008～0.012g/l，mgso
4 0.02～0.04g/l，ph值为7.0～7.5。
30.通过将有机污染物污染的土壤样品置于无机盐液体培养基中培养，在通过多次转接扩大富集培养，从而获得足够用于后续筛选的土壤菌株，便于进行饱和筛选，避免遗漏菌株。
31.上述步骤s2中，琼脂固化后得到的固体培养基在培养时，通常将培养皿置于温箱中，设定合适的温度进行倒置培养。在一种优选的实施例中，将第一次富集后的菌液涂布于含有有机污染物的固体培养基中，并置于29℃～32℃进行倒置培养筛选。优选在30℃或31℃进行培养。具体的培养时间可以是24～48小时，也可以需要适当缩短或延迟几个小时，比如可以是15小时、16小时、17小时，18小时，20小时，22小时等，也可以是50小时，54小时等。不过，若在其他培养条件都正常的前提下，通常时间过长也无菌落生长的话，大概率不是能够降解该有机污染物的菌株。而若在短时间内能够生长的菌落往往可能是降解活性比较强的菌株。
32.上述步骤s3中挑选单菌落进行液体培养富集的步骤也是常规的步骤，按照现有操作进行即可。在本技术一种优选的实施例中，上述步骤s3包括步骤：s31，从培养筛选后的固
体培养基中挑选单一菌落；s32，将单一菌落置于lb液体培养基中进行第二次富集；以及s33，将第二次富集后的菌液进行划线纯化，获得降解菌；优选地，lb液体培养基包括：牛肉膏4～6g/l，蛋白胨8～12g/l，nacl 4～6g/l，ph指为7.0～7.5。
33.分别挑选不同的单菌落进行富集培养，从而获得众多不同菌株的富集产物。而将第二次富集后的菌液进行划线纯化目的是为了进一步提高菌株的纯度，便于制备成菌源液，进行后续的降解性能考察。
34.本技术的上述筛选方法，有机污染物从石油产品种类上来分，可以是柴油、稠油、轻质油或重质油。从有机物结构成分角度来分，上述有机污染物为疏水性有机物，优选疏水性有机物包括菲、芘、二苯并噻吩及咔唑中的一种或多种。本技术的筛选方法不仅效率高，而且适用范围广。不仅仅重油，其他柴油、稠油等油品均含有多环芳烃，本技术中所指的是针对不同性质的油品总石油烃具有降解效果的菌株的筛选。该种方法也可以提高对某特定油品降解菌的筛选效果。
35.下面将结合具体的实施例来进一步说明本技术的有益效果。需要说明的是，以下实验中按以下公式计算降解率：
36.η＝(c
0-c1)/c0。
37.其中，c0表示空白对照实验(不加菌)，c1表示降解实验(加菌)。该数值大于0就认为有降解效率。
38.实施例1
39.原油降解菌的筛选：
40.(1)取自胜利油田周围四种污染程度不同的土壤样品，每份土壤样品三个平行。100ml无机盐培养液中加入1g土壤样品，于摇床30℃，160rpm培养三天后继续加入0.5g原油，继续培养三天后转接至新鲜石油无机盐培养基驯化一周。
41.无机盐培养基配方：na2hpo
4 0.6g/l，k2hpo
4 0.2g/l，nano
3 4g/l，酵母粉0.5g/l，cacl
2 0.01g/l，feso
4 0.01g/l，mgso
4 0.03g/l，调节ph至7.2。121℃灭菌20min，cacl2和mgso
4 分开单独灭菌，feso4过滤除菌。
42.(2)制备无机盐固体培养基，灭菌后倒入平板培养皿中，待平板凝固。取原油的石油醚(沸程60-90℃)溶液，用涂布器缓慢均匀的涂抹在平板上(这个对石油醚没有确定的浓度比例，由于油品来源、黏度、性质各不一致，一般要求配制成的油品具有可流动性，能够均匀涂抹至平板表面即可)。其中，原油与菌液的质量体积比为8：1。
43.(3)用无菌水配制培养液浓度梯度为10-3
至10-6
，向凝固后的平板培养皿中加入100μl菌液，涂布器沾取无水乙醇在酒精灯上点燃进行灭菌，涂布器冷却之后进行涂布，按照顺时针或者逆时针涂抹均匀，至感觉到平板表面发涩即可。放入培养箱中30℃恒温倒置培养24-48h。
44.(4)定期观察平板，待菌落长出后，挑选不同形态的菌落接种至lb培养基中富集，划线纯化后制备菌源液。
45.(5)接种10％菌源液至原油降解培养基中，培养7d测定降解率。其中，原油降解培养基为无机盐培养基中加入原油，原油在无机盐培养基中的浓度为5g/l。
46.结论：经15天的筛选，共长出27株菌株形态不一的菌落，进行划线纯化后进行7d降解实验，发现其中17株菌具有降解效率，该筛选方法的有效率为62.96％。
47.实施例2
48.柴油降解菌的筛选：
49.柴油降解菌的驯化、分离方法与上述原油降解菌的筛选方法类似，唯一不同的是无机盐固体培养基的制备中，取100μl柴油用涂布器均匀的涂抹在平板上(其中，柴油与菌液的质量体积比为8:1)。
50.结论：经15天的筛选，共长出34株菌株形态不一的菌落，进行划线纯化后进行7d降解实验，发现其中28株菌具有降解效率，该筛选方法的有效率为82.35％。
51.实施例3
52.多环芳烃降解菌的筛选：
53.(1)选择菲、芘、咔唑、二苯并噻吩，配制丙酮储备溶液(10g/l)，用0.22μm滤膜过滤除菌后，取400μl加入到100ml已高温灭菌的无机盐培养基中，于30℃，160rpm条件下摇床振荡培养过夜，待丙酮完全挥发后，加入1g石油污染的土壤样品，摇床振荡培养3d。
54.(2)将培养液10％转接至新鲜的培养基中继续培养7d。
55.(3)制备无机盐固体分离培养基。将100μl多环芳烃的丙酮溶液涂布到无机盐固体培养基上，待丙酮完全挥发。取10-4
、10-5
、10-6
与10-7
四个稀释度的菌液稀释涂布(其中，多环芳烃与菌液的质量体积比分别为：1:100(即0.01g:1ml)，于培养箱中30℃培养24-48h。
56.结论：经12天的筛选，共长出17株菌株形态不一的菌落(菲)，具有降解作用的菌株10株，筛选方法的有效率为58.82％。共长出12株菌株形态不一的菌落(芘)，具有降解作用的菌株8株，筛选方法的有效率为66.67％。共长出11株菌株形态不一的菌落(咔唑)，具有降解作用的菌株6株，筛选方法的有效率为54.54％。共长出13株菌株形态不一的菌落(二苯并噻吩)，有降解作用菌株5株，筛选方法的有效率为38.46％。
57.实施例4
58.实施例4与实施例1的唯一区别在于：固体培养基中，原油与菌液的质量体积比为8:1(g:ml)。
59.结论：经15天的筛选，共长出27株菌株形态不一的菌落，进行划线纯化后进行7d降解实验，发现其中17株菌具有降解效率，该筛选方法的有效率为62.96％。
60.实施例5
61.实施例5与实施例1的唯一区别在于：固体培养基中，原油与菌液的质量体积比为10:1。
62.结论：经15天的筛选，共长出24株菌株形态不一的菌落，进行划线纯化后进行7d降解实验，发现其中13株菌具有降解效率，该筛选方法的有效率为54.17％。
63.实施例6
64.正十六烷降解菌的筛选：
65.(1)取自胜利油田周围四种污染程度不同的土壤样品，每份土壤样品三个平行。100ml无机盐培养液中加入1g土壤样品，于摇床30℃，160rpm培养三天后继续加入1ml正十六烷，继续培养三天后转接至新鲜正十六烷无机盐培养基驯化一周。
66.无机盐培养基配方：na2hpo
4 0.6g/l，k2hpo
4 0.2g/l，nano
3 4g/l，酵母粉0.5g/l，cacl
2 0.01g/l，feso
4 0.01g/l，mgso
4 0.03g/l，调节ph至7.2。121℃灭菌20min，cacl2和mgso4分开单独灭菌，feso4过滤除菌。
67.(2)制备无机盐固体培养基，灭菌后倒入平板培养皿中，待平板凝固。将正十六烷用0.22μm微孔滤膜除菌后，用涂布器缓慢均匀的涂抹在平板上。其中，正十六烷与菌液的质量体积比为5:1。
68.(3)用无菌水配制培养液浓度梯度为10-3
至10-6
，向凝固后的平板培养皿中加入100μl菌液，涂布器沾取无水乙醇在酒精灯上点燃进行灭菌，涂布器冷却之后进行涂布，按照顺时针或者逆时针涂抹均匀，至感觉到平板表面发涩即可。放入培养箱中30℃恒温倒置培养24-48h。
69.(4)定期观察平板，待菌落长出后，挑选不同形态的菌落接种至lb培养基中富集，划线纯化后制备菌源液。
70.(5)接种10％菌源液至原油降解培养基中，培养7d测定降解率。其中，正十六烷降解培养基为无机盐培养基中加入正十六烷，正十六烷在无机盐培养基中的浓度为7.75g/l(10ml/l)。
71.结论：经15天的筛选，共长出38株菌株形态不一的菌落，进行划线纯化后进行7d降解实验，发现其中26株菌具有降解效率，该筛选方法的有效率为68.42％。
72.实施例7
73.实施例7与实施例1的唯一区别在于：固体培养基中，正十六烷与菌液的质量体积比为8:1。
74.结论：经15天的筛选，共长出35株菌株形态不一的菌落，进行划线纯化后进行7d降解实验，发现其中22株菌具有降解效率，该筛选方法的有效率为62.86％。
75.对比例1
76.中国专利cn 108300674 a公布了一种石油降解菌及其获得方法和在降解原油中的应用，具体为提供mycobacterium sp.csc-6的富集分离和纯化方法。即：首先取油泥样品加入无机盐培养基中，在30℃摇床上培养7-10d，然后连续转接富集培养5-7次后，进行连续稀释6次，将不同稀释梯度培养液涂布平板，培养3-7d后分别挑选出不同数量、不同颜色、菌落形态的细菌，分别划线，纯化培养得到单菌。最后在30℃的摇床上振荡培养3-7天，进行降解效率测定。筛选时间约为41天-84天，获得一株对原油有高效、稳定降解作用的菌株csc-6。
77.从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明提供一种改进的石油及疏水性有机物好氧降解菌的快速高效筛选方法，只需采用单层固体无机盐培养基，将石油类物质和其他疏水性有机物直接均匀的涂抹在固体分离培养基上，然后吸取适量菌液涂抹在培养基表面，待培养基发涩为止，最后进行恒温培养待菌株长出。该方法极大的缩短了传统筛选方法中利用lb平板将细菌全部分离出来，再经过大量的复筛获取有效降解菌的过程，提高了筛选效率，易发现高效功能菌株；解决了双层平板分离法中有机溶剂易干扰、污染物与菌株接触不完全、过程繁琐的问题。且该方法对于不同种类的油品(轻质原油、稠油、重质原油、柴油等)及疏水性的有机物(菲、芘、二苯并噻吩、咔唑等)均适用，适合进一步推广。
78.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。