一种干细胞3d培养用毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及干细胞培养领域，尤其是涉及一种干细胞3d培养用毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体及其制备方法 。
背景技术：
2.干细胞种类很多，已经在疾病治疗、医美、抗衰、药物筛选等众多领域大量应用。干细胞培养已经成为整个干细胞产业链发展的制约瓶颈，干细胞培养器已经成为干细胞培养领域的开发热点。按干细胞培养装置的特点，分为2d培养与3d培养两大类。2d培养主要通过增大皿进行，批量换液、扩散法供气。3d培养主要在立体容器中完成，可以自主调控培养液的组成，可以主动向培养液供气，对培养过程的调控手段更丰富，3d培养技术逐渐成为干细胞产业链的主流。
3.干细胞3d培养载体是影响干细胞3d培养产业链发展的重要因素，有众多厂家进行干细胞3d培养载体研究开发，但多数厂家在制造干细胞3d培养载体尤其是多孔微载体时都是采用有机溶剂，包括苯，作为致孔剂，对培养的干细胞有潜在的危害，迫切需要探索对干细胞友好的致孔剂。
4.同时，传统的干细胞培养都采用胰酶消化干细胞，从而使干细胞从不溶的载体上解离下来；这样分离干细胞的方法对干细胞损伤极大，更好的方式是专一性裂解培养载体从而释放干细胞，最大限度地减少对干细胞的操作。干细胞产业急需要能够在不伤害干细胞条件下裂解的、多孔的、适宜于干细胞生存与系列的新型干细胞3d培养载体。
技术实现要素：
5.针对上述不足，本发明提供一种干细胞3d培养用毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体及其制备方法，其实质以对干细胞友好的碳酸钙材料为致孔剂，利用稀酸就可以把碳酸钙溶解除去，整个干细胞3d培养用胶原载体制造过程中不使用有机溶剂，有效避免利用挥发法去除致孔用有机溶剂造成的干细胞3d培养载体内有机溶剂残留问题。同时，可以利用胶原蛋白酶和完成多孔载体的温和裂解，有效减少裂解载体释放干细胞时对干细胞的损伤。
6.本发明提供一种干细胞3d培养用毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体及其制备方法，具体如下：s1 将明胶、氨基聚糖与三偏磷酸钠按比例制备混合胶液，再将纳米碳酸钙充分分散在胶液中；s2 将胶液拉制成薄壁毛细管，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s3将胶液制成厚壁管并将多根毛细管包裹形成毛细管束，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s4 将完成交联固定后的毛细管束冷冻并切割制成小段；
s5将小段的毛细管束置于稀酸溶液中，利用稀酸使碳酸钙溶解并形成毛细管束中管壁的微孔管道；s6 将小段的毛细管束充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存，得到毛细管型干细胞3d培养用明胶与氨基多糖共聚载体。
7.优选地，利用三偏磷酸钠在碱性条件下进行多羟基物质的交联，交联后的载体可以用磷酸酯酶温和水解。
8.优选地，使用纳米碳酸钙做致孔剂，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例范围1：0.2-2，优选地，s2中纳米碳酸钙有效增强毛细管的机械强度，拉制的毛细管直径为0.1-2mm。
9.优选地，s2中胶液中可以使用更多的含羟基的人体干细胞巢内组份，如：明胶、氨基多糖等，更有利于提升干细胞3d培养载体的性能。
10.优选地，毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体是小段的毛细管束，由长的毛细管束经过冷冻切割、稀酸溶解纳米碳酸钙形成微孔管道、清洗、低温干燥、辐照灭菌等后处理过程制备。
11.优选地，毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体是大量的磷酸酯键交联形成，可以通过磷酸酯酶水解磷酸酯键并将明胶与氨基多糖共聚载体裂解。
12.优选地，多孔载体是仿真人体干细胞3d培养环境设计，不仅满足msc类干细胞3d培养制备，也适用hsc类干细胞3d培养制备。
13.有益效果：本发明提供一种干细胞3d培养用毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体及其制备方法，其实质以对干细胞友好的碳酸钙材料为致孔剂，利用稀酸就可以把碳酸钙溶解除去，整个干细胞3d培养用胶原载体制造过程中不使用化学致孔溶剂，有效避免利用挥发法去除致孔用有机溶剂造成的干细胞3d培养载体内有机溶剂残留问题。同时，毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体可以通过胶原蛋白酶和磷酸酯酶裂解，有效避免培养后载体中干细胞释放中对干细胞的损伤。
14.下面结合实施例对本发明作进一步说明。本发明中涉及到研发团队已经申报专利的相关技术、方法与设备，在实施例中仅重点说明相关专利技术或方法或设备在干细胞3d细胞制备过程中的主要用途，不再具体描述已申报专利的具体细节。
15.实施例1（1）进行毛细管型干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将明胶、氨基聚糖与三偏磷酸钠按比例制备混合胶液，再将纳米碳酸钙充分分散在胶液中；具体比例为（明胶：硫酸软骨素：透明质酸：三偏磷酸钠=9：1：1：5），在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到胶液中，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例为1：0.5；s2 将胶液拉制成薄壁毛细管，直径为1mm，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s3将胶液制成厚壁管并将多根毛细管包裹形成毛细管束，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s4 将完成交联固定后的毛细管束冷冻并切割制成小段，长度10mm；s5将小段的毛细管束置于稀酸溶液中，利用ph6稀盐酸使碳酸钙溶解并形成毛细管束
(99.78%)、cd 105(99.87%); cd14 (0.18%)、cd19 (0.03%)、cd31 (0.05%)、cd34 (0.07%)、cd45 (0.09%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
22.实施例3（1）进行毛细管型干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将明胶、氨基聚糖与三偏磷酸钠按比例制备混合胶液，再将纳米碳酸钙充分分散在胶液中；具体比例为（明胶：硫酸软骨素：透明质酸：三偏磷酸钠=9：1：1：9），在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到胶液中，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例为1：0.2；s2 将胶液拉制成薄壁毛细管，直径为0.1mm，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s3将胶液制成厚壁管并将多根毛细管包裹形成毛细管束，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s4 将完成交联固定后的毛细管束冷冻并切割制成小段，长度10mm；s5将小段的毛细管束置于稀酸溶液中，利用ph6稀盐酸使碳酸钙溶解并形成毛细管束中管壁的微孔管道；s6 将小段的毛细管束充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存，得到毛细管型干细胞3d培养用明胶与氨基多糖共聚载体。
23.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行msc干细胞3d培养s7利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s8将毛细管型干细胞3d培养用胶原载体与msc干细胞种子混合，按每百万个msc用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行msc干细胞3d培养增殖。
24.s9对获得的msc干细胞进行相应的检测并保存。获得msc按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd29(97.57%)、cd 44(97.78%)、cd73 (99.87%)、cd90 (99.78%)、cd 105(99.86%); cd14 (0.15%)、cd19 (0.07%)、cd31 (0.07%)、cd34 (0.04%)、cd45 (0.08%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
25.实施例4（1）进行毛细管型干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将明胶、氨基聚糖与三偏磷酸钠按比例制备混合胶液，再将纳米碳酸钙充分分散在胶液中；具体比例为（明胶：硫酸软骨素：透明质酸：三偏磷酸钠=9：1：1：5），在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到胶液中，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例为1：0.5；s2 将胶液拉制成薄壁毛细管，直径为1mm，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s3将胶液制成厚壁管并将多根毛细管包裹形成毛细管束，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s4 将完成交联固定后的毛细管束冷冻并切割制成小段，长度10mm；s5将小段的毛细管束置于稀酸溶液中，利用ph6稀盐酸使碳酸钙溶解并形成毛细管束
中管壁的微孔管道；s6 将小段的毛细管束充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存，得到毛细管型干细胞3d培养用明胶与氨基多糖共聚载体。
26.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行hsc类干细胞3d培养s7利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s8将毛细管型干细胞3d培养用胶原载体与hsc干细胞种子混合，按每百万个hsc用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行hsc干细胞3d培养增殖。
27.s9 对获得的hsc干细胞进行相应的检测并保存。获得hsc按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd3
cd8
、cd3-cd（56 16）
、cd3
cd56
超过95%，抗原表征达到国内与国际标准要求。
28.本发明的一种干细胞3d培养用毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体及其制备方法，包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案全部进行描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术领域
1.本发明涉及干细胞培养领域，尤其是涉及一种干细胞3d培养用毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体及其制备方法 。
背景技术：
2.干细胞种类很多，已经在疾病治疗、医美、抗衰、药物筛选等众多领域大量应用。干细胞培养已经成为整个干细胞产业链发展的制约瓶颈，干细胞培养器已经成为干细胞培养领域的开发热点。按干细胞培养装置的特点，分为2d培养与3d培养两大类。2d培养主要通过增大皿进行，批量换液、扩散法供气。3d培养主要在立体容器中完成，可以自主调控培养液的组成，可以主动向培养液供气，对培养过程的调控手段更丰富，3d培养技术逐渐成为干细胞产业链的主流。
3.干细胞3d培养载体是影响干细胞3d培养产业链发展的重要因素，有众多厂家进行干细胞3d培养载体研究开发，但多数厂家在制造干细胞3d培养载体尤其是多孔微载体时都是采用有机溶剂，包括苯，作为致孔剂，对培养的干细胞有潜在的危害，迫切需要探索对干细胞友好的致孔剂。
4.同时，传统的干细胞培养都采用胰酶消化干细胞，从而使干细胞从不溶的载体上解离下来；这样分离干细胞的方法对干细胞损伤极大，更好的方式是专一性裂解培养载体从而释放干细胞，最大限度地减少对干细胞的操作。干细胞产业急需要能够在不伤害干细胞条件下裂解的、多孔的、适宜于干细胞生存与系列的新型干细胞3d培养载体。
技术实现要素：
5.针对上述不足，本发明提供一种干细胞3d培养用毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体及其制备方法，其实质以对干细胞友好的碳酸钙材料为致孔剂，利用稀酸就可以把碳酸钙溶解除去，整个干细胞3d培养用胶原载体制造过程中不使用有机溶剂，有效避免利用挥发法去除致孔用有机溶剂造成的干细胞3d培养载体内有机溶剂残留问题。同时，可以利用胶原蛋白酶和完成多孔载体的温和裂解，有效减少裂解载体释放干细胞时对干细胞的损伤。
6.本发明提供一种干细胞3d培养用毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体及其制备方法，具体如下：s1 将明胶、氨基聚糖与三偏磷酸钠按比例制备混合胶液，再将纳米碳酸钙充分分散在胶液中；s2 将胶液拉制成薄壁毛细管，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s3将胶液制成厚壁管并将多根毛细管包裹形成毛细管束，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s4 将完成交联固定后的毛细管束冷冻并切割制成小段；
s5将小段的毛细管束置于稀酸溶液中，利用稀酸使碳酸钙溶解并形成毛细管束中管壁的微孔管道；s6 将小段的毛细管束充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存，得到毛细管型干细胞3d培养用明胶与氨基多糖共聚载体。
7.优选地，利用三偏磷酸钠在碱性条件下进行多羟基物质的交联，交联后的载体可以用磷酸酯酶温和水解。
8.优选地，使用纳米碳酸钙做致孔剂，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例范围1：0.2-2，优选地，s2中纳米碳酸钙有效增强毛细管的机械强度，拉制的毛细管直径为0.1-2mm。
9.优选地，s2中胶液中可以使用更多的含羟基的人体干细胞巢内组份，如：明胶、氨基多糖等，更有利于提升干细胞3d培养载体的性能。
10.优选地，毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体是小段的毛细管束，由长的毛细管束经过冷冻切割、稀酸溶解纳米碳酸钙形成微孔管道、清洗、低温干燥、辐照灭菌等后处理过程制备。
11.优选地，毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体是大量的磷酸酯键交联形成，可以通过磷酸酯酶水解磷酸酯键并将明胶与氨基多糖共聚载体裂解。
12.优选地，多孔载体是仿真人体干细胞3d培养环境设计，不仅满足msc类干细胞3d培养制备，也适用hsc类干细胞3d培养制备。
13.有益效果：本发明提供一种干细胞3d培养用毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体及其制备方法，其实质以对干细胞友好的碳酸钙材料为致孔剂，利用稀酸就可以把碳酸钙溶解除去，整个干细胞3d培养用胶原载体制造过程中不使用化学致孔溶剂，有效避免利用挥发法去除致孔用有机溶剂造成的干细胞3d培养载体内有机溶剂残留问题。同时，毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体可以通过胶原蛋白酶和磷酸酯酶裂解，有效避免培养后载体中干细胞释放中对干细胞的损伤。
14.下面结合实施例对本发明作进一步说明。本发明中涉及到研发团队已经申报专利的相关技术、方法与设备，在实施例中仅重点说明相关专利技术或方法或设备在干细胞3d细胞制备过程中的主要用途，不再具体描述已申报专利的具体细节。
15.实施例1（1）进行毛细管型干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将明胶、氨基聚糖与三偏磷酸钠按比例制备混合胶液，再将纳米碳酸钙充分分散在胶液中；具体比例为（明胶：硫酸软骨素：透明质酸：三偏磷酸钠=9：1：1：5），在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到胶液中，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例为1：0.5；s2 将胶液拉制成薄壁毛细管，直径为1mm，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s3将胶液制成厚壁管并将多根毛细管包裹形成毛细管束，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s4 将完成交联固定后的毛细管束冷冻并切割制成小段，长度10mm；s5将小段的毛细管束置于稀酸溶液中，利用ph6稀盐酸使碳酸钙溶解并形成毛细管束
(99.78%)、cd 105(99.87%); cd14 (0.18%)、cd19 (0.03%)、cd31 (0.05%)、cd34 (0.07%)、cd45 (0.09%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
22.实施例3（1）进行毛细管型干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将明胶、氨基聚糖与三偏磷酸钠按比例制备混合胶液，再将纳米碳酸钙充分分散在胶液中；具体比例为（明胶：硫酸软骨素：透明质酸：三偏磷酸钠=9：1：1：9），在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到胶液中，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例为1：0.2；s2 将胶液拉制成薄壁毛细管，直径为0.1mm，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s3将胶液制成厚壁管并将多根毛细管包裹形成毛细管束，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s4 将完成交联固定后的毛细管束冷冻并切割制成小段，长度10mm；s5将小段的毛细管束置于稀酸溶液中，利用ph6稀盐酸使碳酸钙溶解并形成毛细管束中管壁的微孔管道；s6 将小段的毛细管束充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存，得到毛细管型干细胞3d培养用明胶与氨基多糖共聚载体。
23.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行msc干细胞3d培养s7利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s8将毛细管型干细胞3d培养用胶原载体与msc干细胞种子混合，按每百万个msc用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行msc干细胞3d培养增殖。
24.s9对获得的msc干细胞进行相应的检测并保存。获得msc按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd29(97.57%)、cd 44(97.78%)、cd73 (99.87%)、cd90 (99.78%)、cd 105(99.86%); cd14 (0.15%)、cd19 (0.07%)、cd31 (0.07%)、cd34 (0.04%)、cd45 (0.08%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
25.实施例4（1）进行毛细管型干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将明胶、氨基聚糖与三偏磷酸钠按比例制备混合胶液，再将纳米碳酸钙充分分散在胶液中；具体比例为（明胶：硫酸软骨素：透明质酸：三偏磷酸钠=9：1：1：5），在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到胶液中，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例为1：0.5；s2 将胶液拉制成薄壁毛细管，直径为1mm，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s3将胶液制成厚壁管并将多根毛细管包裹形成毛细管束，利用碳酸钠溶液激活三偏磷酸钠进行交联与固定；s4 将完成交联固定后的毛细管束冷冻并切割制成小段，长度10mm；s5将小段的毛细管束置于稀酸溶液中，利用ph6稀盐酸使碳酸钙溶解并形成毛细管束
中管壁的微孔管道；s6 将小段的毛细管束充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存，得到毛细管型干细胞3d培养用明胶与氨基多糖共聚载体。
26.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行hsc类干细胞3d培养s7利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s8将毛细管型干细胞3d培养用胶原载体与hsc干细胞种子混合，按每百万个hsc用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行hsc干细胞3d培养增殖。
27.s9 对获得的hsc干细胞进行相应的检测并保存。获得hsc按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd3
cd8
、cd3-cd（56 16）
、cd3
cd56
超过95%，抗原表征达到国内与国际标准要求。
28.本发明的一种干细胞3d培养用毛细管型明胶与氨基多糖共聚载体及其制备方法，包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案全部进行描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
再多了解一些
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