一种含缩硫酮键的双羧基交联单体及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及药物制剂技术领域，具体涉及一种含缩硫酮键的双羧基交联单体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤因其复杂的发病机制使其治疗困难，严重威胁人类健康。光动力疗法(photodynamic therapy，pdt)是用光敏药物和激光活化治疗肿瘤疾病的一种新方法，已逐渐被应用于肿瘤的临床治疗。
3.与常规治疗手段相比，光动力疗法在抗肿瘤治疗方面具有以下明显优势：1)组织选择性好；2)非侵入性，可避免手术切除治疗给患者带来的痛苦；3)抗瘤谱广；4)体内安全性良好；5)无耐药现象，因此几乎不涉及现有抗肿瘤药物的多药耐药通路，可避免耐药现象的发生。
4.然而，传统光敏药物于肿瘤部位的蓄积少，若要发挥足够光动力作用需给予较大剂量光敏药物，另外，光敏药物多具有较大的共轭结构，经光照后易发生结构堆积，导致光敏剂猝灭，从而失去光动力作用，则每次光动力治疗前均需重新给药。
5.在恶性肿瘤局部治疗体系中，微球作为缓控释给药系统成员之一应用广泛，其中，微球的可降解性质尤为重要。由于ros敏感型药物传递系统是利用特殊ros环境实现所载药物在肿瘤部位的局部释放，从而提高药物疗效，减少药物毒副作用，而缩硫酮键(thioketal,tk)作为一种ros敏感键，可在ros的作用下发生断裂而被用于该类递药系统的构建。
6.虽然目前已有部分文献报道了基于缩硫酮键设计的ros敏感型药物载体，然而：
7.1)这些药物载体多为生物不可降解材料，如金纳米粒、上转换纳米粒等，体内积蓄安全性为一大问题，而且无机纳米粒作为载药主体，载药量低且难以控制；
8.2)缩硫酮键对于不同ros的敏感程度，以及内源性ros是否能引起此键的断裂或均需作进一步了解。
9.因此，设计一种降解可行性和生物安全性好以及载药量适宜，对ros响应性高，可持续发挥光动力作用的递药系统显得尤为重要。


技术实现要素：

10.本发明目的在于为克服现有的技术缺陷，提供一种含缩硫酮键的双羧基交联单体及其制备方法和应用。
11.为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
12.第一方面，提供了一种含缩硫酮键的双羧基交联单体，所述双羧基交联单体的结构式如下所示：
[0013][0014]
本发明提供的双羧基交联单体在光动力治疗中的生物安全性好，载药量适宜，对ros的响应性高，光敏剂可通过光动力作用产生ros使缩硫酮键断裂，在活性氧条件下的降解可行性好。
[0015]
第二方面，提供了一种如第一方面所述的含缩硫酮键的双羧基交联单体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0016]
(1)将巯基丙酸溶解于无水丙酮中，得到溶液a；
[0017]
(2)将对甲苯磺酸一水合物溶于无水丙酮中，得到溶液b；
[0018]
(3)在惰性气体保护下，将溶液b滴入溶液a中，在室温搅拌8～24小时，待反应结束得到反应液；
[0019]
(4)反应液通过分离纯化操作，得到双羧基交联单体。
[0020]
进一步地，步骤(1)中，所述巯基丙酸与对甲苯磺酸一水合物的摩尔比为5：1。
[0021]
进一步地，步骤(3)中，所述惰性气体为氮气。
[0022]
进一步地，步骤(4)中，所述分离纯化操作为：反应液旋转蒸发除去无水丙酮，加入乙酸乙酯复溶得到有机相，有机相依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，过滤并收集滤液，滤液浓缩后通过硅胶柱层析纯化，洗脱液体系为石油醚/乙酸乙酯，收集目标组分，干燥即得双羧基交联单体。
[0023]
第三方面，提供了一种如第一方面所述的含缩硫酮键的双羧基交联单体在制备载ppix的ros敏感降解交联微球中的应用，所述交联微球可维持光敏剂在肿瘤组织中的有效剂量并减少光敏剂的副作用。
[0024]
进一步地，所述交联微球的制备方法，包括以下步骤：
[0025]
(1)将双羧基交联单体、三羟甲基丙烷-三[3-(2-甲基吖丙啶基)丙酸酯](sc-100)、原卟啉、二羧基聚乙二醇混合，分散溶解后搅拌均匀，得到混合物；
[0026]
(2)往混合物中表面活性剂，经高剪切分散乳化机均质得到乳液；
[0027]
(3)在20-30℃下交联1.5-3h，加入乙醇破乳，洗涤除去表面活性剂，得到交联微球。
[0028]
进一步地，步骤(1)中，所述双羧基交联单体、三羟甲基丙烷-三[3-(2-甲基吖丙啶基)丙酸酯](sc-100)、原卟啉和二羧基聚乙二醇的质量比为100：50：1：150。
[0029]
进一步地，步骤(2)中，所述表面活性剂的hlb值大于8；所述表面活性剂为泊洛沙姆188、吐温-80、十二烷基硫酸钠、labrasol、lafrafac lipophile wl 1349、lafrafic m 1944cs中的一种。
[0030]
作为优选的技术方案，所述表面活性剂为吐温-80。
[0031]
进一步地，步骤(3)中，所述交联温度为25℃，反应时间为2h。
[0032]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0033]
本发明通过构建含缩硫酮键的双羧基交联单体，并以此为基础制得载ppix的ros敏感降解交联微球，该交联微球能够长时间维持光敏剂在肿瘤组织的有效剂量，可进行持续多次的光动力治疗，并能极大减少其全身副作用。利用光敏剂可在外源光照的作用下产
生ros这一特点，可将其作为提高肿瘤微环境ros水平的手段以实现ros敏感型递药系统在肿瘤微环境中的响应性。此外，作为一种局部治疗手段，利用局部给药制剂手段可有效降低光敏剂在体非特异性分布，一方面可增加光敏剂在肿瘤部位的富集，另一方面能提高安全性和耐受性、减少全身毒性和增强pdt抗肿瘤效果。
[0034]
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0035]
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
[0036]
图1为实施例1的双羧基交联单体的核磁共振氢谱图；
[0037]
图2为实施例1的双羧基交联单体的核磁共振碳谱图；
[0038]
图3为实施例1的双羧基交联单体的质谱图；
[0039]
图4为实施例2的ppix@clmp的粒子形态图；
[0040]
图5为实施例2的ppix@clmp、sc-100与双羧基交联单体的红外光谱图；
[0041]
图6为实施例4中ppix光触发后对双羧基交联单体作用的核磁共振氢谱图；
[0042]
图7为实施例5中dpbf测定ppix@clmp的活性氧产生效果图；
[0043]
图8为实施例6中pix@clmp多次光照后对dpbf的降解曲线图；
[0044]
图9为实施例7中ppix@clmp光照后的形态变化图；
[0045]
图10为实施例8中ppix@clmp浸提液的细胞毒性试验结果示意图；
[0046]
图11为实施例8中ppix@clmp光照后浸提液的细胞毒性试验结果示意图；
[0047]
图12为实施例9中ppix@clmp的光动力杀伤效果试验的结果示意图；
[0048]
其中：
[0049]
图9中，每格子中左边为光照组，右边为避光组；
[0050]
图10中，左侧为mcf-7细胞；右侧为3t3细胞；
[0051]
图11中，左侧为mcf-7细胞；右侧为3t3细胞；
[0052]
图12中，左侧为mcf-7细胞；右侧为4t1细胞。
具体实施方式
[0053]
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面将结合附图以及具体实施例对本发明作进一步介绍和说明；需要说明的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系未给予附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本使用信心和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等描述，是用于区分不同的部件等，不代表先后顺序，也不限定“第一”和“第二”是不同的类型。
[0054]
对于本领域的技术人员来说，通过阅读本说明书的公开内容，本发明的特征、有益效果和优点将变得显而易见。
[0055]
本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由
…
组成”和“基本上由
…
组成”。
[0056]
实施例1
[0057]
含缩硫酮键的双羧基交联单体的制备，其结构式如下所示：
[0058][0059]
上述双羧基交联单体采用以下步骤制备：
[0060]
(1)将巯基丙酸(10mol)溶解于2.5l无水丙酮中，得到溶液a；
[0061]
(2)将对甲苯磺酸一水合物(2mol)溶于5l无水丙酮中，得到溶液b；
[0062]
(3)氮气保护下，将溶液b逐滴滴入溶液a中，之后继续氮气保护下于室温搅拌8～24小时，待反应结束后得到反应液。
[0063]
(4)反应液通过旋转蒸发除去溶剂无水丙酮，加入乙酸乙酯复溶，有机相依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水萃取3次，收集有机层，加入无水硫酸钠干燥。过滤除去硫酸钠固体，收集滤液浓缩，加入硅胶粉(200-300目)拌样，通过硅胶柱层析进一步纯化，洗脱液体系为石油醚/乙酸乙酯(4/1)，得到白色固体的双羧基交联单体，收率为90％。
[0064]
双羧基交联单体的核磁共振氢谱见图1，核磁共振碳谱见图2，质谱见图3。
[0065]
双羧基交联单体的结构表征数据如下：
[0066]
核磁共振氢谱：1h nmr(400mhz，chloroform-d)δ2.92(t，j＝7.4hz，4h)，2.70(t，j＝7.4hz，4h)，1.63(d，j＝0.0hz，6h)。
[0067]
核磁共振碳谱：
13
c nmr(101mhz，chloroform-d)δ178.91，56.53，33.32，30.73，24.84。
[0068]
质谱ms：m/z＝251.1[m-h]

[0069]
实施例2
[0070]
载ppix的ros敏感降解交联微球(ppix@clmp)的制备
[0071]
将100g双羧基交联单体，50g三羟甲基丙烷-三[3-(2-甲基吖丙啶基)丙酸酯](sc-100)、1g原卟啉、150g二羧基聚乙二醇2000，混合于烧杯中，经高速分散机使充分溶解后，加入一定30g吐温-80，经高剪切分散乳化机均质10min，，得到乳液，在25℃下交联2h后，加入大量乙醇破乳，经多次洗涤除去表面活性剂，得到红棕色固体的ppix@clmp粒子。
[0072]
实施例3
[0073]
载ppix的ros敏感降解交联微球(ppix@clmp)的制备
[0074]
将150g t双羧基交联单体，50g三羟甲基丙烷-三[3-(2-甲基吖丙啶基)丙酸酯](sc-100)、1g原卟啉、150g二羧基聚乙二醇2000，混合于烧杯中，经高速分散机使充分溶解后，加入60g吐温-80，经高剪切分散乳化机均质10min，，得到乳液，在25℃下交联2h后，加入大量乙醇破乳，经多次洗涤除去吐温-80，得到红棕色固体的ppix@clmp粒子。
[0075]
以实施例2制备得到的ppix@clmp为实验对象，在显微镜下观察该粒子形态以及进行红外谱图确认交联与否，显微镜下形态见图4，红外图谱见图5。
[0076]
根据图4可得，该微球粒子呈均匀球形，无明显团聚，分散性和均一性较好，通过激光粒度分析仪测定最终粒子的粒径约为3.3μm，pdi为0.107。
[0077]
由图5可知，双羧基交联单体与sc-100之间主要发生引起c-n键断裂，使氮丙啶环
开环，得到酯键以及仲胺，因此由ir图谱结果可知，ppix@clmp与sc-100相比，氮丙啶环上的c-n的伸缩振动峰变弱，出现了n-h的伸缩振动峰以及弯曲振动峰，说明交联反应后生成了仲胺的n-h。与双羧基交联单体相比，ppix@clmp中的c＝o出现蓝移，表明酯键的生成。因此说明ppix@clmp的制备中，双羧基交联单体与sc-100确实以共价键形式交联，且反应较完全。
[0078]
实验例4
[0079]
双羧基交联单体在活性氧条件下的降解可行性
[0080]
精密称定0.025g实施例1制备的双羧基交联单体和0.001g原卟啉，溶于3ml氘代氯仿中，给予波长为671nm，强度为0.5w/cm2的激光光照，分别在0、5、10、20、30min时各取0.5ml溶液于核磁管中，测定样品的核磁共振氢谱，图谱见图6。
[0081]
由图6可得，随着光照时间的延长，可观察到δ1.62峰逐渐变低，而δ2.05从无到峰高逐渐变高。δ1.62为双羧基交联单体中两个甲基的峰，而δ2.05为丙酮上两个甲基的峰，此处双羧基交联单体的断裂是由于光敏剂ppix在671nm光照条件下发生光动力作用，产生了大量ros，而ros的强氧化性导致缩硫酮键的断裂，生成丙酮和巯基丙酸；双羧基交联单体在ros条件下的断裂反应式如下所示：
[0082][0083]
因此在图6中可观察到缩硫酮键上两个甲基峰的降低，而丙酮中甲基的峰由原本不存在到越来越高，说明了缩硫酮键在ros作用下的断裂可行性。
[0084]
实验例5
[0085]
ppix@clmp的活性氧产生效果
[0086]
ppix@clmp的活性氧产生能力是交联微球降解的基本条件，以1,3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)为活性氧捕获剂，通过紫外分光光度法测定体系中剩余的dpbf量来评价载ppix@clmp的活性氧产生能力。
[0087]
精密称定0.032g dpbf溶解于20ml乙醇中，得1.6mg/ml的dpbf乙醇溶液备用；分别取实施例2制备的0.005g ppix@clmp与1ml dpbf乙醇溶液孵育，经光照0、0.5、1、1.5、3、5、10、15min后测定各样品在417nm处的吸光度，计算dpbf的相对剩余量a
t
/a0，a0与a
t
分别为零时刻与光照t时间后所测得dpbf的吸光度值，测试结果如图7所示。
[0088]
根据图7的测试结果可得，ppix@clmp组在0.5w/cm2和0.25w/cm2光照3min后，体系中的dpbf几乎都能降至0；避光组，或者dpbf探针自身光照几乎不发生变化，说明ppix@clmp即使较低强度的671nm波长激光光照下都能表现较强的活性氧产生能力。
[0089]
实验例6
[0090]
ppix@clmp重复光照的活性氧产生能力
[0091]
精密称定0.032g dpbf溶解于20ml乙醇中，得1.6mg/ml的dpbf乙醇溶液备用；分别取实施例2制备的ppix@clmp 0.005g与dpbf乙醇溶液1ml孵育，经光照0、1、3、5min后离心除去上清液再加入1ml dpbf乙醇溶液，重复光照、取样、除溶剂、重加dpbf乙醇溶液的步骤1、5、10、15、20、25、30次，最后测定各样品在417nm处的吸光度，计算dpbf的相对剩余量a
t
/a0，a0与a
t
分别为零时刻与光照t时间后所测得dpbf的吸光度值，测试结果如图8所示。
[0092]
根据图8的测试结果可得，ppix@clmp与dpbf溶液孵育后，第1次光照时，5min内
dpbf从100％的量逐渐降到接近零，速度较快，即使到第30次，仍具有相似的降解曲线，即可以持续保持较强的活性氧产生能力，由光照产生的光敏剂自身淬灭作用不大，为ppix@clmp在体内的持续多次治疗提供依据。
[0093]
实验例7
[0094]
ppix@clmp的光照降解行为
[0095]
精密称取0.002g实施例2制备的ppix@clmp置于200μl 50％乙醇水溶液中，每次光照10min，每次光照之间间隔30min，分别在0、20、40、60、80、100、120min后观察ppix@clmp的形态变化，其形态变化见图9，图9中，每个图片左边为光照组，右边为避光组。
[0096]
根据图9的形态变化图可得，可见随着光照时间的延长，光照组的ppix@clmp由悬浮液逐渐变澄清，而避光组的无此现象，表明所制备的含缩硫酮键的ppix@clmp具有nir触发降解的功能。
[0097]
实验例8
[0098]
ppix@clmp的体外安全性
[0099]
通过mtt法考察ppix@clmp浸提液以及光照后浸提液的细胞毒性，以确定ppix@clmp的体外安全性。
[0100]
ppix@clmp浸提液获取：取实施例2制备的ppix@clmp，往其中加入1ml dmem或1640培养基，置培养箱中浸提12、24、36、48、60、72h，得到不同时间点的浸提液。
[0101]
ppix@clmp光照后浸提液获取：取实施例2制备的ppix@clmp，往其中加入1ml dmem或1640培养基，经激光波长为671nm，激光强度为0.5w/cm2的光照5、10、20、40、60、80、100、120min后，置培养箱中浸提24h，得到光照不同时间点后的浸提液。
[0102]
细胞毒性试验：
[0103]
收集对数生长期的细胞，接种于96孔板中，于培养箱中培养，待细胞贴壁后分别给予不同浸提液。
[0104]
继续于培养箱中孵育4h，移除培养液，加入dmso，避光条件下于摇床中震荡10min(60rpm)，后将生成的甲臜结晶溶解，用酶标仪测定490nm波长下各孔od值，以不加细胞的系列孔作为调零组，以不加粒子或浸提液的系列孔为对照组，按照以下公式计算细胞的相对存活率。
[0105][0106]
ppix@clmp浸提液、ppix@clmp光照后浸提液对mcf-7和3t3的细胞毒性测试结果如图10和11所示，图10和11中，左侧为mcf-7细胞；右侧为3t3细胞。
[0107]
由图10和11可得，在各细胞的培养基中分别浸提12、24、36、48、60、72h后，细胞存活率与对照组相当，均大于90％，说明ppix@clmp对细胞具有较好的安全性，同时ppix@clmp光照后所产生的裂解物对细胞无明显杀伤作用，具有较好的安全性。
[0108]
实验例9
[0109]
ppix@clmp的光动力杀伤作用
[0110]
将实施例2制备的ppix@clmp于mcf-7细胞或4t1细胞孵育，给药后即用激光波长为671nm，激光强度为0.5w/cm2近红外光分别光照0、0.5、1、1.5、3、5min，光照后的细胞继续于培养箱中培养48h。
[0111]
按实验例8中细胞毒性试验方法和公式计算细胞相对存活率，结果见图12，图12中，左侧为mcf-7细胞；右侧为4t1细胞。
[0112]
由图12可得，对于mcf-7细胞，光照5min后两种细胞具有较强的杀伤作用，细胞存活率都能降到50％以下，其中对于mcf7细胞，光照1min便有抑制率可达50％的效果，而4t1细胞则需要3min或者5min；随着光照时间的延长，细胞存活率逐步降低，且光照20min后，两种细胞抑制率均可达90％以上；仅仅给予nir组，细胞存活率达90％以上，说明该波长强度下的nir对细胞无明显毒性作用；至于避光组，可见避光条件放置下，细胞无明显杀伤作用，说明所制备的ppix@clmp在避光条件下安全性良好，而在近红外光的触发下产生ros发挥较强的pdt作用，最终可对多种肿瘤细胞进行杀伤，可用于抗肿瘤的光动力治疗。
[0113]
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。