一种用于分离细胞外囊泡的离心管和提取细胞外囊泡的试剂盒的制作方法

1.本公开涉及分离提取技术领域，具体地，涉及一种用于分离细胞外囊泡的离心管和提取细胞外囊泡的试剂盒，其特别适合用于在常温低速条件下从体液或细胞悬液中提取细胞外囊泡的方法。


背景技术：

2.细胞外囊泡(extracellular vesicle，ev)是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡的总称，根据其粒径的大小可以分为不同的亚型，通常所说的外泌体是指粒径小于200nm的evs，又称小细胞外囊泡(sev)，其组成成分主要为蛋白质、核酸、脂质等。它们在分泌细胞和受体细胞的穿梭介导了细胞间的生物分子传递，是不同组织细胞间信息沟通的重要媒介。大量文献表明，外囊泡在体内可促进肿瘤发生，控制转移灶形成和肿瘤免疫反应；在心血管疾病方面，可作为心血管系统传递系统的载体，对心脏重塑、血管形成具有病理作用；在肾病方面，尿液中的外泌体能够反映泌尿系统，从足细胞到肾小管，作为肾脏疾病的潜在生物标志物；在肝脏疾病和神经退行性疾病中也会作为相关疾病蛋白的载体，成为早期诊断的潜在生物标志物。因此对细胞外囊泡的研究在基础研究和临床应用都具有非常巨大的市场应用价值和需求。
3.目前常用的分离提取手段有以下三种。第一种是应用最为广泛的超速离心法，它是根据体液中不同组分的沉降系数不同，利用不同强度离心力使样本中死亡细胞、细胞碎片、细胞器等组分被分离出去，然后获得外囊泡及部分蛋白，用pbs再次重悬清洗离心后即可得到实验所需。该方法的优点就是一次性可以处理大量样本，也是目前公认的提取外囊泡最有效可靠的方法，但是该方法所需时间长(8-10h)，对实验设备要求高，会有杂蛋白的干扰。第二种是试剂盒法，目前最为常用的是由systembiosciences(sbi)研发的exoquick试剂盒，该系列的试剂是基于多聚体形式的exosome提取试剂，形成类似于网状结果，将一定直径的微泡捕获出来，快速有效的提取各种体液样本中的exosomes。该方法操作简单，但是得到的纯度较低。第三种是tio2微球富集法，该方法是通过tio2微球与外囊泡外膜上的磷脂双分子层上含有的磷酸盐基团之间形成双配位键，将外泌体吸附在tio2球体表面，再通过洗脱来富集外泌体。该方法基于共价结合的选择性富集，具有富集效率高、非特异性吸附少，样本处理时间短等优势，这种方法契合外囊泡物理化学性质，简单便利、成本低廉，适用于科研需求。因此，研究具有纯度高、方便高效以及无其他蛋白和细胞器干扰的细胞外囊泡提取方法尤为重要。


技术实现要素：

4.本公开的目的是一种用于分离细胞外囊泡的离心管和提取细胞外囊泡的试剂盒。使用该离心管提取细胞外囊泡不仅操作简单、对实验设备要求低，而且所得外囊泡的收率和纯度均较高。
5.为了实现上述目的，本公开第一方面提供一种用于分离细胞外囊泡的离心管，所述离心管包括具有管腔的管体，所述管体内设置有筛板，所述筛板将所述管腔分隔为上管腔和下管腔，所述上管腔容纳有二氧化钛微球；
6.所述下管腔包括自上而下设置的第一下管腔和第二下管腔，所述第一下管腔的上开口被所述筛板封闭，所述第一下管腔的下开口延伸进入所述第二下管腔，所述第二下管腔的侧壁可拆卸地连接在所述离心管上。
7.可选地，所述离心管外径为7.5-11mm，内径为6-10mm，高为28-35mm。
8.优选地，所述离心管外径为9mm，内径为7.1-7.3mm，高为31mm。
9.可选地，所述管腔的总容积为0.6-0.8ml；所述上管腔和所述下管腔的体积比为3-4：1。
10.可选地，所述筛板用于阻拦二氧化钛微球，所述筛板距离离心管底部的距离为13-15mm。
11.可选地，所述筛板的孔径为1-4μm。
12.可选地，所述二氧化钛微球的尺寸为4.5-10μm。
13.优选地，所述二氧化钛微球的尺寸为5μm。
14.可选地，所述离心管还包括螺旋上盖，所述螺旋上盖与所述管体之间具有可拆卸的螺旋连接。
15.可选地，所述离心管外部还设置有套管，所述上管腔的侧壁的上边缘设置有向外延伸的限位件，所述限位件用于将所述离心管卡在所述套管上。
16.本公开第二方面提供一种提取细胞外囊泡的试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述的离心管和容纳所述离心管的载体盒。
17.可选地，所述载体盒还容纳有活化试剂瓶、洗涤试剂瓶和洗脱试剂瓶。
18.使用本公开的离心管提取细胞外囊泡操作简单、对实验设备要求低，所得外囊泡的收率和纯度均较高。
19.本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
20.附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
21.图1是不含套管的分离细胞外囊泡的离心管示意图。
22.图2是分离细胞外囊泡的离心管示意图。
23.图3是血清中外囊泡电镜结果，电镜下可见典型茶托样的外囊泡颗粒。
24.图4是血清中外囊泡粒径-浓度分布图；结果显示exosome diameter(nm):131.0，符合外囊泡粒径尺寸(＜200nm)。
25.图5是二氧化钛辅助提取囊泡原理示意图。
26.附图标记说明
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螺旋上盖
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管体
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上管腔
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筛板
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下管腔
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第一下管腔
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第二下管腔
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限位件
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套管
具体实施方式
[0036]
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
[0037]
参考图1、图2和图4，本公开第一方面提供一种用于分离细胞外囊泡的离心管，所述离心管包括具有管腔的管体2，所述管体内设置有筛板4，所述筛板4将所述管腔分隔为上管腔3和下管腔5，所述上管腔3容纳有二氧化钛微球；
[0038]
所述下管腔5包括自上而下设置的第一下管腔6和第二下管腔7，所述第一下管腔6的上开口被所述筛板4封闭，所述第一下管腔6的下开口延伸进入所述第二下管腔7，所述第二下管腔7的侧壁可拆卸地连接在所述离心管上。
[0039]
在使用时，所述上管腔容纳的二氧化钛微球与样品中的细胞外囊泡结合，使得细胞外囊泡不能通过筛板，而其余物质可以经过所述筛板进入所述下管腔并被弃去，再使用洗脱液进行洗脱时，细胞外囊泡从二氧化钛微球上脱离下来，进入所述下管腔，由此得到分离后的细胞外囊泡。
[0040]
可选地，所述离心管外径为7.5-11mm，内径为6-10mm，高为28-35mm。
[0041]
优选地，所述离心管外径为9mm，内径为7.1-7.3mm，高为31mm。
[0042]
可选地，所述管腔的总容积为0.6-0.8ml；所述上管腔3和所述下管腔5的体积比为3-4：1。
[0043]
根据本公开，使用如上所述尺寸的离心管提取细胞外囊泡，使用方法简单，损耗低，更有利于细胞外囊泡的提取。
[0044]
可选地，所述筛板4用于阻拦二氧化钛微球，所述筛板4距离离心管底部的距离为13-15mm。
[0045]
根据本公开，所述筛板能够阻拦二氧化钛微球，提高了使用所述离心管提取的细胞外囊泡的纯度；所述筛板距离离心管底部具有如上所述高度的距离，有利于弃去液的流出，更便于经过洗脱的细胞外囊泡进入下管腔。
[0046]
可选地，所述筛板4的孔径为1-4μm。
[0047]
可选地，所述二氧化钛微球的尺寸为4.5-10μm。
[0048]
优选地，所述二氧化钛微球的尺寸为5μm。
[0049]
根据本公开，所述细胞外囊泡的囊泡膜的磷脂层中含有磷酸根基团，所述二氧化钛微球能够与磷酸根之间形成双配位键，从而特异性的与细胞外囊泡结合。
[0050]
可选地，所述离心管还包括螺旋上盖1，所述螺旋上盖1与所述管体2之间具有可拆卸的螺旋连接。
[0051]
可选地，所述离心管外部还设置有套管9，所述上管腔2的侧壁的上边缘设置有向
外延伸的限位件8，所述限位件8用于将所述离心管卡在所述套管9上。
[0052]
根据本公开，所述离心管在离心过程中需要稍微旋松螺旋上盖1，方便液体流出。
[0053]
本公开第二方面提供一种提取细胞外囊泡的试剂盒，所述试剂盒含有第一部分所述的离心管和容纳所述离心管的载体盒。
[0054]
可选地，所述载体盒还容纳有活化试剂瓶、洗涤试剂瓶和洗脱试剂瓶。
[0055]
根据本公开，所述二氧化钛(tio2)微球在活化试剂瓶中经过wash buffer活化，根据本公开，二氧化钛微球活化是将称取二氧化钛微球于离心管中，用预冷的wash buffer(简称“wb”)悬浮二氧化钛微球，短暂旋涡之后5000g离心1min，弃掉活化液，更换新的冷wb，重复该操作2-3次。
[0056]
根据本公开，所述孵育是将预处理后的样本添加至装有活化后二氧化钛微球的离心管中，涡旋均匀，在4℃条件下，孵育5min；所述纯化是在洗涤试剂瓶中用预冷的wb反复吹打孵育后的二氧化钛微球，该步骤重复2-3次；所述洗脱是在洗脱试剂瓶中加入elution buffer(简称“eb”)，在4℃孵育10min，然后1000g离心1min，收集流出液，得到外囊泡悬液，于-80℃保存。
[0057]
根据本公开，所述样本的前处理要在低温环境下高速离心后或者浓缩后高速离心一定时间去除杂质或细胞碎屑；所述高速离心的离心速度大于10000g，所述一定时间的处理时间大于10min。
[0058]
根据本公开，所述活化后的二氧化钛微球与预处理后的样本进行混合时，样本应与二氧化钛微球充分混合，即将二氧化钛微球重悬，且所处环境为4℃，孵育5min。
[0059]
根据本公开，所述使用预冷的wb，目的是将二氧化钛微球表面没有完全吸附、吸附不牢固的杂蛋白清洗掉。
[0060]
根据本公开，所述二氧化钛微球所需量与样本体积比为40-60μg:1μl，其中wb体积可以为200-500μl；洗脱过程中所述eb体积可以为20-50μl。
[0061]
根据本公开，所述离心管提取的细胞外囊泡具有纯度高、方便高效以及无其他蛋白和细胞器干扰的特点。
[0062]
实施例1
[0063]
借助一种tio2微球特异性富集细胞外囊泡的方法，包括以下步骤：
[0064]
所需样本50μl血清(人)
[0065]
1)tio2活化：称取2.5mg tio2微球(径粒：5μm)于离心柱中，用200μl预冷的wb悬浮tio2微球，短暂涡旋之后5000g离心1min，弃掉活化液，更换新的冷wb，重复该操作3次；
[0066]
2)样本前处理：移取60μl未处理血清于新的离心管中，20000g，4℃离心10min；
[0067]
3)tio2加入样本中孵育：用移液枪吸取预处理后的50μl血清(注意不要吸到沉淀)添加至装有活化后tio2微球的离心柱中，涡旋均匀，在4℃条件下，孵育5min；
[0068]
4)纯化：吸取500μl预冷的wb于离心柱中，用移液枪反复吹打步骤3之后的tio2微球，并在500g离心30s，弃掉流出液。该步骤重复3次；
[0069]
5)洗脱：加入eb在4℃孵育10min，然后1000g离心1min，收集流出液，此为外囊泡悬液，于-80℃保存。
[0070]
测试实施例1
[0071]
对实施例得到的外囊泡悬液进行测试，得到如图2和图3的结果。图2是血清中外囊
泡电镜结果，电镜下可见典型茶托样的外囊泡颗粒。图3是血清中外囊泡粒径-浓度分布图；结果显示exosome diameter(nm):131.0，符合外囊泡粒径尺寸(＜200nm)。
[0072]
根据图2和图3可以看出，使用该离心管提取细胞外囊泡操作简单、对实验设备要求低，所得外囊泡的收率和纯度均较高。
[0073]
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0074]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0075]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。