一种精确鉴定草麻黄的方法与流程

技术特征：
1.一种草麻黄matk基因引物对，其特征在于，正向引物核苷酸序列为ctatgttatagatccgaatc，反向引物核苷酸序列为caacttttccatcgaagag。2.一种利用rbcl matk组合条形码鉴定草麻黄的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)准备草麻黄植物干或者湿的样品；2)采用常规方法提取草麻黄植物的基因组dna；3)采用rbl通用引物atgtcaccacaaacagaaac和tcgcatgtacctgcagtagc，pcr扩增叶绿体基因rbl目的序列；采用25μl pcr体系：2
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santaq pcr master mix 12.5μl,浓度为10μmol/l的引物各1μl,浓度为100ng/μl的模板dna 2μl,ddh2o 8.5μl；扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性50s,55℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸10min；4)采用正向引物ctatgttatagatccgaatc和反向引物caacttttccatcgaagag，pcr扩增叶绿体基因matk目的序列；采用25μl pcr体系：2
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santaq pcr master mix 12.5μl,浓度为10μmol/l的引物各0.5μl,浓度为100ng/μl的模板dna 2μl,ddh2o 8.5μl；扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s,52℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；5)采用常规方法进行琼脂糖凝胶电泳，确认pcr扩增产物；6)采用sanger方法双向测序；7)采用cexpress软件拼接序列，并利用bioedit及mega 5.1软件将麻黄属近缘物种进行多序列比对，分析得到稳定的种间遗传变异位点；以kimura-2-parameter模型计算它们的种内种间遗传距离，进行“barcoding gap”分析；随后以邻接法构建系统发育树，利用bootstrap1000次重复检验各分支的支持率，并选择保留50％含有空位的列，以相关类群即与麻黄目同一买麻藤亚纲(gnetidae)下买麻藤属(gnetum linn)下模式种-显轴买麻藤gnetum gnemon为outgroup，综合分析以鉴别草麻黄与同属近缘物种。3.如权利要求1所述的草麻黄matk基因引物对在鉴定草麻黄中的应用。

技术总结
本发明提供了一种精确鉴定草麻黄的方法。具体是利用设计、筛选获得的引物，扩增并采用Sanger测序方法获得叶绿体基因rbcL及matK目的序列，通过与GenBank数据库比对，并计算遗传距离结合系统发育及特征核苷酸位点分析，区分草麻黄与其他物种的方法。步骤为：提取草麻黄植物基因组DNA，利用PCR技术，采用给定引物及程序扩增，并采用Sanger测序获得叶绿体基因rbcL和matK的目的序列，采用CExpress、Bioedit及MEGA 5.1等软件将草麻黄与麻黄属近缘物种进行多序列比对，分析得到稳定的种间遗传变异位点，并以K2P模型计算它们的种内种间遗传距离，以邻接法构建系统发育树，综合分析以鉴别草麻黄与同属近缘物种。该方法具有稳定、高效、精确的特点，是从分子水平鉴定草麻黄植物和药材的良好方法。材的良好方法。


技术研发人员：崔晋龙 蒋珊
受保护的技术使用者：山西大学
技术研发日：2021.11.26
技术公布日：2022/2/18