对试样中的病毒抗原进行测定的方法、抗体组及试剂盒与流程

对试样中的病毒抗原进行测定的方法、抗体组及试剂盒
【技术领域】
1.本发明涉及使用捕获抗体及检测抗体而对试样中的病毒抗原进行测定的方法。本发明涉及用于由免疫学测定法测定试样中的病毒抗原的抗体组。本发明涉及含捕获抗体及检测抗体的试剂盒。


背景技术：

2.为了研究试样中存在指定的病毒与否，知晓测定试样中的病毒抗原。例如，在非专利文献1及2中记载了，用于由使用捕获抗体及检测抗体的酶联免疫吸附法(elisa法)测定试样中的sars-cov-2的核蛋白质的试剂盒。
3.【现有技术文献】
4.【非专利文献】
5.【非专利文献1】sars-cov-2(2019-ncov)nucleoprotein/np elisa kit(货号：kit40588)的处理说明书,sino biological公司
6.【非专利文献2】sars-cov-2np antigen elisa kit(deia2020)的处理说明书,creative diagnostics公司
7.【发明的概要】
8.【发明要解决的课题】
9.本发明旨在提供可对试样中的sars-cov-2的核蛋白质进行测定的新的抗体组和使用该抗体组的测定方法及试剂盒。
10.【用于解决课题的手段】
11.本发明提供病毒抗原的测定方法，其为使用捕获抗体及检测抗体而对试样中的病毒抗原进行测定的方法，其包括形成含捕获抗体和病毒抗原和检测抗体的夹心免疫复合体的工序，捕获抗体包括含有含seq id no:1的氨基酸序列的cdr1、含seq id no:2的氨基酸序列的cdr2及含seq id no:3的氨基酸序列的cdr3的重链可变区域，含有含seq id no:4的氨基酸序列的cdr1、含seq id no:5的氨基酸序列的cdr2及含seq id no:6的氨基酸序列的cdr3的轻链可变区域，检测抗体包括含有含seq id no:7的氨基酸序列的cdr1、含seq id no:8的氨基酸序列的cdr2及含seq id no:9的氨基酸序列的cdr3的重链可变区域，含有含seq id no:10的氨基酸序列的cdr1、含seq id no:11的氨基酸序列的cdr2及含seq id no:12的氨基酸序列的cdr3的轻链可变区域。
12.本发明提供病毒抗原测定用抗体组，其为用于由免疫学测定法测定试样中的病毒抗原的抗体组，抗体组含在免疫学测定法中形成病毒抗原和夹心免疫复合体的捕获抗体及检测抗体，捕获抗体包括含有含seq id no:1的氨基酸序列的cdr1、含seq id no:2的氨基酸序列的cdr2及含seq id no:3的氨基酸序列的cdr3的重链可变区域，含有含seq id no:4的氨基酸序列的cdr1、含seq id no:5的氨基酸序列的cdr2及含seq id no:6的氨基酸序列的cdr3的轻链可变区域，检测抗体包括含有含seq id no:7的氨基酸序列的cdr1、含seq id no:8的氨基酸序列的cdr2及含seq id no:9的氨基酸序列的cdr3的重链可变区域，含有含
seq id no:10的氨基酸序列的cdr1、含seq id no:11的氨基酸序列的cdr2及含seq id no:12的氨基酸序列的cdr3的轻链可变区域的。
13.本发明提供含上述的捕获抗体及检测抗体的试剂盒。
14.【发明的效果】
15.根据本发明，提供可测定试样中的sars-cov-2的核蛋白质的新的抗体组和使用该抗体组的测定方法及试剂盒。
16.【附图的简单的说明】
17.【图1a】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
18.【图1b】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
19.【图1c】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
20.【图2a】是将在提取试剂中含病毒抗原的试样由本实施方式的测定方法测定，对于抗原浓度而对发光强度的平均值进行标绘的坐标图。
21.【图2b】是将在稀释用缓冲液中含病毒抗原的试样由本实施方式的测定方法测定，对于抗原浓度而对发光强度的平均值进行标绘的坐标图。
22.【图3】是将从sars-cov-2感染患者采集的受试体由本实施方式的测定方法及pcr法测定，对用各方法得到的测定值进行标绘的坐标图。
【具体实施方式】
23.在对本实施方式的病毒抗原进行测定的方法(以下，也称为“测定方法”)中，由使用含指定的cdr的捕获抗体及检测抗体的免疫学测定法在体外测定试样中的病毒抗原。在本实施方式中，捕获抗体是指与受试物质特异性地结合的抗体，用于通过自身固定于固相而在固相上捕获受试物质的抗体。检测抗体是指与受试物质特异性地结合的抗体，用于通过自身被标记物质标记而提供能检测的信号的抗体。检测抗体通常不固定于固相，但有标记物质本身是粒子等的固相的情况。
24.免疫学测定法只要是包括形成夹心免疫复合体的工序，就不特别限定。夹心免疫复合体是指含捕获抗体和受试物质和检测抗体的复合体，捕获抗体和检测抗体处于与该受试物质上的互相不同的部位结合的状态的复合体。作为这样的免疫学测定法，可举出例如夹心elisa法、免疫色谱法等。在它们之中，也特别优选夹心elisa法。作为夹心elisa法，也可使用特开平1-254868号公报中记载的免疫复合体转移法。
25.在本说明书中“对病毒抗原进行测定”的用语包含取得病毒抗原的测定值，及，确定试样中的病毒抗原的量或浓度的值。病毒抗原的测定值可为反映试样中的病毒抗原的量或浓度的值。其中，“反映量或浓度的值”是指依据后述的标记物质的种类的值，例如，可举出发光强度的测定值、荧光强度的测定值、放射线强度的测定值、光学密度的测定值等。试样中的病毒抗原的量或浓度的值可例如，基于病毒抗原的测定值及校准物的测定值而确定。校准物是指对照试样的一种，以已知浓度含受试物质或与其相对应的标准物质的受试物质的定量用试样。
26.在本说明书中“抗体”的用语包含全长的抗体及其片段。抗体的类可为igg、iga、igm、igd及ige之任一者，优选为igg。igg的亚类不特别限定，也可为igg1、igg2、igg3及igg4之任一者。作为抗体的片段，可举出例如还原型igg(rigg)、fab、fab'、f(ab')2、fv、单链抗
体(scfv)、双抗体、三体抗体等。调制这些抗体片段的方法本身是公知的。抗体可为单克隆抗体及多克隆抗体之任一者，优选为单克隆抗体。抗体也可为来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、马、骆驼、羊驼、鸡等之任一者的动物的抗体。优选为抗体是小鼠的单克隆抗体。
27.在本实施方式中，捕获抗体及检测抗体互相相同或不同，可为全长的抗体，也可为抗体片段。在捕获抗体及检测抗体的两方是抗体片段时，片段的种类可在捕获抗体和检测抗体之间相同，也可不同。捕获抗体及检测抗体均优选为单克隆抗体。
28.在本实施方式中，捕获抗体包括含有含seq id no:1的氨基酸序列的cdr1、含seq id no:2的氨基酸序列的cdr2及含seq id no:3的氨基酸序列的cdr3的重链可变区域。另外，捕获抗体包括含有含seq id no:4的氨基酸序列的cdr1、含seq id no:5的氨基酸序列的cdr2及含seq id no:6的氨基酸序列的cdr3的轻链可变区域。接下来，显示捕获抗体的各cdr的氨基酸序列。在下文中，cdrh1、cdrh2及cdrh3各自表示重链的cdr1、cdr2及cdr3。cdrl1、cdrl2及cdrl3各自表示轻链的cdr1、cdr2及cdr3。各cdr的氨基酸序列是基于kabat法的序列。在本说明书中“基于kabat法”是指cdr及可变区域的氨基酸残基的编号根据由kabat等的编号－方案(参照kabat e.a.等,sequences of proteins of immunological interest,5th ed.public health service,national institutes of health,bethesda,md(1991),nih publication no.91-3242)。
29.[捕获抗体的cdr的氨基酸序列]
[0030]
·
cdrh1：tsgtgvs(seq id no:1)
[0031]
·
cdrh2：hiywdddkry npslks(seq id no:2)
[0032]
·
cdrh3：snygydldy(seq id no:3)
[0033]
·
cdrl1：kasqnvgtnv v(seq id no:4)
[0034]
·
cdrl2：sasyrys(seq id no:5)
[0035]
·
cdrl3：qqynnyplt(seq id no:6)
[0036]
在本实施方式中，检测抗体包括含有含seq id no:7的氨基酸序列的cdr1、含seq id no:8的氨基酸序列的cdr2及含seq id no:9的氨基酸序列的cdr3的重链可变区域。另外，检测抗体包括含有含seq id no:10的氨基酸序列的cdr1、含seq id no:11的氨基酸序列的cdr2及含seq id no:12的氨基酸序列的cdr3的轻链可变区域。接下来，显示检测抗体的各cdr的氨基酸序列。各cdr的氨基酸序列是基于kabat法的序列。
[0037]
[检测抗体的cdr的氨基酸序列]
[0038]
·
cdrh1：dyymy(seq id no:7)
[0039]
·
cdrh2：tisdggsyty ypdsvkg(seq id no:8)
[0040]
·
cdrh3：aadyggyfdy(seq id no:9)
[0041]
·
cdrl1：sasqgisn(seq id no:10)
[0042]
·
cdrl2：ytsslhs(seq id no:11)
[0043]
·
cdrl3：qqysklpyt(seq id no:12)
[0044]
含各自含seq id no:1～6的氨基酸序列的6个cdr的捕获抗体和含各自含seq id no:7～12的氨基酸序列的6个cdr的检测抗体与相同的病毒抗原特异性地结合，识别的表位互相不同。因此，在捕获抗体及检测抗体与病毒抗原结合时，形成了夹心免疫复合体。
[0045]
在一实施方式中，捕获抗体也可为含各自含seq id no:1～6的氨基酸序列的6个
cdr的人源化抗体。另外，检测抗体也可为含各自含seq id no:7～12的氨基酸序列的6个cdr的人源化抗体。人源化抗体是指由公知的cdr移植法，向人抗体基因移植非人来源的抗体的cdr的基因序列而得到的抗体。
[0046]
捕获抗体也可作为含各自含seq id no:1～3的氨基酸序列的cdrh1、cdrh2及cdrh3的重链可变区域，含有含seq id no:13的氨基酸序列的重链可变区域。另外，捕获抗体也可作为含各自含seq id no:4～6的氨基酸序列的cdrl1、cdrl2及cdrl3的轻链可变区域，含有含seq id no:14的氨基酸序列的轻链可变区域。接下来，显示seq id no:13及14所表示的可变区域的氨基酸序列。加下划线部表示cdr。这些可变区域的氨基酸序列是基于kabat法的序列。
[0047]
[捕获抗体的可变区域的氨基酸序列]
[0048]
·
重链可变区域
[0049]
qvtlkesgpg ilqpsqtlsl tcsfsgfsls tsgtgvswir qpsgkglewl ahiywdddkr ynpslksrlt vskdtsgnqv flkitsvdta dtatyycars nygydldywg qgttltvss(seq id no:13)
[0050]
·
轻链可变区域
[0051]
divmtqsqkf mstsvgdrvs vtckasqnvg tnvvwyqqkp gqspkaliys asyrysgvpd rftgsgsgtd ftltisnvqs edlaeyfcqq ynnypltfgs gtkleikra(seq id no:14)
[0052]
检测抗体也可作为含各自含seq id no:7～9的氨基酸序列的cdrh1、cdrh2及cdrh3的重链可变区域，含含seq id no:15的氨基酸序列的重链可变区域。另外，检测抗体也可作为含各自含seq id no:10～12的氨基酸序列的cdrl1、cdrl2及cdrl3的轻链可变区域，含含seq id no:16的氨基酸序列的轻链可变区域。接下来，显示seq id no:15及16所表示的可变区域的氨基酸序列。加下划线部表示cdr。这些可变区域的氨基酸序列是基于kabat法的序列。
[0053]
[检测抗体的可变区域的氨基酸序列]
[0054]
·
重链可变区域
[0055]
evqlvesggg lvkpggslkl scaasgftfs dyymywvrqt pekrlewvat isdggsytyy pdsvkgrfti srdnaknnly lqmsslksdd takyycaraa dyggyfdywg qgttltvss(seq id no:15)
[0056]
·
轻链可变区域
[0057]
diqltqttss lsaslgdrvt iscsasqgis nylnwyqqkp dgtvklliyy tsslhsgvps rfsgsgsgtd ysltisnlep ediatyycqq ysklpytfgg gtkleikra(seq id no:16)
[0058]
在一实施方式中，捕获抗体也可为包括含seq id no:13的氨基酸序列的重链可变区域和含seq id no:14的氨基酸序列的轻链可变区域的嵌合抗体。另外，检测抗体也可为包括含seq id no:15的氨基酸序列的重链可变区域和含seq id no:16的氨基酸序列的轻链可变区域的嵌合抗体。嵌合抗体是指来源于某种(species)的抗体的可变区域和与其异种来源的抗体的恒定区连接的抗体。
[0059]
在本实施方式中，捕获抗体及检测抗体也可以不使与病毒抗原结合的活性减少的方式改变氨基酸序列。作为这样的氨基酸序列的改变，可举出氨基酸残基的取代、缺失、附加及/或插入。改变各抗体的氨基酸序列的部位可为重链或轻链的恒定区，也可为可变区
域。在改变可变区域时优选改变框架区域(fr)。fr是指存在于抗体的轻链可变区域及重链可变区域的各自的，cdr以外的区域。fr发挥连接3个cdr的支架的作用，cdr的结构稳定性贡献。抗体的氨基酸序列的改变可通过由dna重组技术及其他分子生物学技术等的公知的方法，向抗体基因导入变异来进行。
[0060]
改变的氨基酸残基的数是通常10残基以下，优选5残基以下，更优选为3残基以下。作为抗体的氨基酸序列的改变，优选保守的取代。保守的取代是指将某氨基酸残基取代为具有与该残基的侧链具有化学上同样的性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸序列的保存的取代本身是在现有技术领域中公知的。或者，也可由美国专利申请公开第2018/0179298号说明书中记载的控制对于含改变抗体的fr3的氨基酸残基的抗体的抗原的亲和性的方法改变抗体的氨基酸序列。另外，也可由美国专利申请公开第2019/0040119号说明书中记载的包括使抗体的可变区域的第80氨基酸残基及恒定区的第171氨基酸残基成为半胱氨酸的提升抗体的热稳定性的方法改变抗体的氨基酸序列。
[0061]
在本实施方式中，捕获抗体也可预先固定于固相。捕获抗体固定于固相的实施方式不特别限定。例如，可使捕获抗体和固相直接键合，也可使捕获抗体和固相经别的物质间接结合。作为直接的结合，可举出例如，物理的吸附等。作为间接的结合，可举出例如，将与抗体特异性地结合的分子固定化于固相上，经该分子和抗体的结合而将抗体固定于固相上。作为与抗体特异性地结合的分子，可举出蛋白a或g、特异性地识别抗体的抗体(第二抗体)等。另外，也可使用介于抗体和固相之间的物质的组合而将捕获抗体固定于固相上。作为这样的物质的组合，可举出生物素类和亲和素类、半抗原和抗半抗原抗体等的组合。生物素类含生物素、以及脱硫生物素及氧基生物素等的生物素类似物。亲和素类含亲和素、以及链霉亲和素及tamavidin(注册商标)等的亲和素类似物。作为半抗原和抗半抗原抗体的组合，可举出具有2,4-二硝基苯基(dnp)基的化合物和抗dnp抗体的组合。例如，通过使用预先用生物素类(或者具有dnp基的化合物)修饰的捕获抗体和预先结合亲和素类(或者抗dnp抗体)的固相，可经生物素类和亲和素类的结合(或者dnp基和抗dnp抗体的结合)而将捕获抗体固定于固相上。
[0062]
固相的原料不特别限定，可选自例如有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等。作为有机高分子化合物，可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为无机化合物，可举出磁性体(氧化铁、氧化铬及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子，可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可将这些中的2种以上组合使用。固相的形状不特别限定，可举出例如粒子、膜、微平板、微管、试管等。在它们之中，也优选粒子及微平板。作为粒子，特别优选磁性粒子。
[0063]
在本实施方式中，检测抗体也可预先被标记物质标记。标记物质不特别限定，可举出例如，其本身发生信号的物质(以下，也称为“信号发生物质”)、及，催化其他物质的反应而发生信号的物质。作为信号发生物质，可举出荧光物质、放射性同位素、显色物质等。作为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质，可举出例如酶。作为荧光物质，可举出异硫氰酸荧光素(fitc)、若丹明、alexa fluor(注册商标)等的荧光染料、gfp等的荧光蛋白质等。作为放射性同位素，可举出
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i、
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p等。作为显色物质，可举出金纳米胶体等的金属胶体。作为酶，可举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶、荧光素酶等。优选的标记物质是酶，特别优选碱性磷酸酶。
[0064]
在本实施方式中，作为标记物质，也可使用标记第二抗体。标记第二抗体是指被上述的标记物质标记的抗体，特异性地识别检测抗体的抗体。通过标记第二抗体与检测抗体结合，该检测抗体间接被标记物质标记。
[0065]
捕获抗体及检测抗体可由dna重组技术及其他分子生物学技术等的公知的方法，例如如下制作。首先，从产生任意的小鼠抗体的杂交瘤提取rna。杂交瘤可由kohler g.及milstein c.,nature,vol.256,pp.495-497,1975等中记载的公知的方法得到。使用提取的rna，由逆转录反应及race(rapid amplification of cdna ends)法合成编码该抗体的重链及轻链的各自的多核苷酸。在这些多核苷酸中，通过将编码cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2及cdrl3的各碱基序列由pcr法取代为编码seq id no:1～6或seq id no:7～12的氨基酸序列的碱基序列，可得到编码捕获抗体或检测抗体的重链及轻链的各自的多核苷酸。或者，在编码任意的小鼠抗体的重链的多核苷酸中，也可将编码可变区域的碱基序列取代为编码seq id no:13或15的氨基酸序列的碱基序列，将编码该抗体的轻链的多核苷酸中的编码可变区域的区域的碱基序列取代为编码seq id no:14或16的氨基酸序列的碱基序列。将得到的多核苷酸整合到公知的表达用载体。编码重链的多核苷酸及编码轻链的多核苷酸可以可各自独立表达的方式整合到1个表达载体，也可个别地整合到2个表达载体。由此，取得含编码捕获抗体或检测抗体的重链及轻链的多核苷酸的表达载体。表达载体的种类不特别限定，可为哺乳动物细胞用表达载体，也可为大肠杆菌用表达载体。通过向适当的宿主细胞(例如，哺乳动物细胞或大肠杆菌)转化或转染得到的表达载体，可得到捕获抗体或检测抗体。另外，也可利用编码seq id no:1～6及seq id no:7～12的氨基酸序列的碱基序列，由公知的cdr移植法(参照例如，jones p.t.等,nature,vol.321,pp.522-525,1986、co m.s.等,proc.natl.acad.sci.usa,vol.93,pp.7843-7848,1996等)制作作为人源化抗体的捕获抗体及检测抗体。
[0066]
在本实施方式中，病毒抗原只要是与上述的捕获抗体及检测抗体结合而形成了夹心免疫复合体，就不特别限定。作为这样的病毒抗原，可举出例如sars-cov的核蛋白质、sars-cov-2的核蛋白质等。核蛋白质(以下，也称为“n蛋白质”)是与病毒的核酸一同存在的蛋白质，也称为核衣壳蛋白质。
[0067]
在捕获抗体及/或检测抗体不与病毒抗原特异性地结合，实质上不形成夹心免疫复合体时，其病毒抗原不是本实施方式的测定方法中的受试物质。在一实施方式中，捕获抗体及检测抗体与sars-cov或sars-cov-2的n蛋白质形成夹心免疫复合体，与mers-cov的n蛋白质、以及，hcov-nl63、hcov-229e及hcov-oc43的病毒抗原(例如，含n蛋白质的病毒溶解物)实质上不形成夹心免疫复合体。
[0068]
在本实施方式中，在试样中，不仅含病毒抗原或含该病毒抗原的病毒的试样，也包含疑似有含病毒抗原或含该病毒抗原的病毒的试样。作为这样的试样，适宜地使用生物体试样。生物体试样是指从生物体采集的试样。作为生物体试样，可举出鼻咽头拭液、唾液、鼻汁、咳痰、全血、血浆、血清、支气管肺泡清洗液、脑脊髓液、淋巴液等。生物体试样之外可使用排泄物、排水、河川水、海水、土壤等。作为排泄物，可举出例如尿、大便等。
[0069]
在本实施方式中，试样优选为液状。液状的试样不限于溶液，含悬浮液、溶胶等。在试样不是液状时，例如，也可向试样添加适合的水性介质而使成为液状。这样的水性介质只要是不妨碍后述的测定，就不特别限定，可举出例如水、生理盐水、缓冲液等。缓冲液只要是
在中性附近的ph(例如6以上8以下的ph)具有缓冲作用，就不特别限定。这样的缓冲液可举出例如aces、hepes、mes、pipes等的good的缓冲液、三乙醇胺盐酸缓冲液、tris盐酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(pbs)、tris缓冲生理盐水(tbs)等。在液状的试样中含不溶性的混杂物时，也可由例如离心分离、过滤等的公知的手段从该试样除去混杂物。根据需要，也可将液状的试样用上述的水性介质稀释。
[0070]
在试样包括含上述的病毒抗原的病毒时，也可为了从该病毒游离病毒抗原，将提取试剂添加到试样中。提取试剂是指用于溶解试样中的病毒而提取n蛋白质等的病毒抗原的试剂。作为这样的试剂，可举出例如，含表面活性剂的缓冲液等。表面活性剂只要是不妨碍后述的测定，就不特别限定，可举出例如np-40、tween(注册商标)-20、triton(注册商标)x-100等。也可使用市售的提取试剂。提取试剂也可含鳌合剂。作为鳌合剂，可举出例如乙二胺四醋酸(edta)的钠盐或钾盐等。
[0071]
在本实施方式的测定方法中，首先形成含捕获抗体和病毒抗原和检测抗体的夹心免疫复合体。夹心免疫复合体可通过将可含病毒抗原的试样和捕获抗体和检测抗体混合来形成。在优选的实施方式中，在固相上形成含捕获抗体和病毒抗原和检测抗体的夹心免疫复合体。例如，通过将可含病毒抗原的试样和捕获抗体和检测抗体混合而形成夹心免疫复合体之后，使含该复合体的溶液与可固定捕获抗体的固相接触，可使该复合体在固相上形成。或者，也可使用预先固定于固相的捕获抗体。即，通过将固定于固相的捕获抗体和可含受试物质的试样和检测抗体混合，可使上述的复合体在固相上形成。
[0072]
本实施方式的测定方法包括检测在固相上形成的夹心免疫复合体的工序。通过将固相上的夹心免疫复合体用现有技术中公知的方法检测，可对病毒抗原进行测定。例如，在检测抗体被标记物质标记时，通过检测由该标记物质发生的信号，可对病毒抗原进行测定。在使用针对检测抗体的标记第二抗体时，通过检测由与检测抗体结合的标记第二抗体的标记物质发生的信号，可对病毒抗原进行测定。在本实施方式中，优选使用预先被标记物质标记的检测抗体。
[0073]
在本说明书中“检测信号”含定性检测信号的有无，对信号强度进行定量，及半定量检测信号的强度。半定量的检测是指将信号的强度如“信号不发生”、“弱”、“中”、“强”等一样阶段性地表示。在本实施方式中，优选定量或半定量检测信号的强度。
[0074]
检测信号的方法本身是在现有技术中公知的。在本实施方式中，适宜选择对应于来源于上述的标记物质的信号的种类的测定方法即可。例如，在标记物质是酶时，可通过使用分光光度计等的公知的装置测定通过使对于该酶的底物反应而发生的光、色等的信号来进行。
[0075]
酶的底物可对应于该酶的种类而从公知的底物适宜选择。例如，在作为酶而使用碱性磷酸酶时，作为底物，可举出cdp-star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)、cspd(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)等的化学发光底物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(bcip)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸2钠、p-硝基苯基磷酸等的显色底物。在作为酶而使用过氧化物酶时，作为底物，可举出luminor及其衍生物等的化学发光底物、2,2'-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸铵)(abts)、1,2-亚苯基二胺(opd)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)等的显色底物。
[0076]
在标记物质是放射性同位素时，可使用闪烁计数器等的公知的装置测定作为信号的放射线。在标记物质是荧光物质时，可使用荧光酶标仪等的公知的装置测定作为信号的荧光。再者，激发波长及荧光波长可对应于使用的荧光物质的种类而适宜确定。
[0077]
信号的检测结果可用作试样中的病毒抗原的测定结果。例如，在对信号的强度进行定量时可以信号强度的测定值本身或从该测定值取得的值作为病毒抗原的测定值使用。作为从信号强度的测定值取得的值，可举出例如，从该测定值减去阴性对照的测定值或背景的值的值等。阴性对照可适宜选择，可举出例如，不含病毒抗原的缓冲液等。
[0078]
在本实施方式中，也可将信号强度的测定值适用于校准曲线，确定试样中的病毒抗原的量或浓度的值。校准曲线可从多个校准物的测定值制成。校准物的测定值与试样同样地，将校准物由本实施方式的测定方法测定而得到。校准曲线可通过在x轴取校准物中的病毒抗原的浓度，y轴取测定值(例如信号强度)的xy平面，对多个校准物的测定值进行标绘，由最小二乘法等的公知的方法得到直线或曲线来制成。在本实施方式中，校准物可通过例如，向不含病毒抗原的缓冲液以任意的浓度添加重组型病毒抗原调制。作为不含病毒抗原的校准物，也可使用不含病毒抗原的缓冲液本身。
[0079]
本实施方式的测定方法也可由市售的全自动免疫测定装置进行。全自动免疫测定装置是指当使用者设置试样而输入测定开始的指示时，自动进行测定试样的调制及其免疫测定而输出受试物质的测定结果的装置。作为这样的全自动免疫测定装置，可举出例如hiscl(注册商标)-5000或hiscl-800等的hiscl系列(sysmex株式会社)或hi-1000(sysmex株式会社)。hiscl系列的装置由作为固相使用磁性粒子的夹心elisa法进行测定。
[0080]
在本实施方式中，也可在夹心免疫复合体的形成和该复合体的检测之间进行除去未形成复合体的未反应的游离成分的b/f(bound/free)分离。未反应的游离成分是指不构成夹心免疫复合体的成分。例如，可举出未与病毒抗原结合的剩余的捕获抗体及检测抗体等。b/f分离的手段不特别限定，当固相是粒子时，可通过由离心分离回收仅捕获复合体的固相来进行b/f分离。当固相是微平板或微管等的容器时，可通过除去含未反应的游离成分的液来进行b/f分离。另外，在固相是磁性粒子时，可通过在用磁铁磁约束磁性粒子的状态下由管嘴吸除含未反应的游离成分的液来进行b/f分离，在自动化的观点上优选的。除去未反应的游离成分之后，也可将捕获复合体的固相用pbs等的适合的水性介质清洗。
[0081]
进一步的的实施方式是用于由免疫学测定法测定试样中的病毒抗原的抗体组(以下，也称为“抗体组”)。在本说明书中“抗体组”的用语是指至少含在免疫学测定法中使用的捕获抗体及检测抗体的多个抗体的组合。免疫学测定法的详细与对于本实施方式的测定方法而所述的相同。本实施方式的抗体组含在免疫学测定法中与病毒抗原形成夹心免疫复合体的捕获抗体及检测抗体。本实施方式的抗体组中所含的捕获抗体及检测抗体的详细与对于本实施方式的测定方法而所述的相同。本实施方式的抗体组适宜地在上述的本实施方式的测定方法中使用。
[0082]
进一步的的实施方式是含捕获抗体及检测抗体的试剂盒(以下，也称为“试剂盒”)。本实施方式的试剂盒用于由免疫学测定法测定试样中的病毒抗原。本实施方式的试剂盒含1个以上的试剂。免疫学测定法、捕获抗体及检测抗体的详细与对于本实施方式的测定方法而所述的相同。
[0083]
在一实施方式中，试剂盒包括含捕获抗体的试剂和含检测抗体的试剂。含抗体的
试剂的形态不特别限定，可为固体(例如粉末、结晶、冷冻干燥品等)，也可为液体(例如溶液、悬浮液、乳浊液等)。在含抗体的试剂是液体时，溶剂只要是可溶解抗体而保存，就不特别限定。作为溶剂，可举出例如水、生理盐水、pbs、tbs、good的缓冲液等。作为good的缓冲液，可举出例如mes、bis-tris、ada、pipes、bis-tris-丙烷、aces、mops、mopso、bes、tes、hepes、hepps、tricine、tris、bicine、taps等。
[0084]
含抗体的试剂也可含公知的添加物。作为添加物，可举出例如牛血清白蛋白(bsa)等蛋白质稳定化剂、叠氮化钠等的防腐剂、氯化钠等的无机盐类等。
[0085]
在一实施方式中，试剂盒也可包括含捕获抗体的试剂、含检测抗体的试剂和固相。或者，捕获抗体也可预先固定于固相。固相的详细与对于本实施方式的测定方法而所述的相同。优选的固相是磁性粒子或微平板。
[0086]
检测抗体也可预先被标记物质标记。或者，试剂盒也可包括含捕获抗体的试剂、含检测抗体的试剂和含标记第二抗体的试剂。标记物质及标记第二抗体的详细与对于本实施方式的测定方法而所述的相同。优选的标记物质是酶。作为酶，可举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶、荧光素酶等。优选的酶是碱性磷酸酶。在检测抗体被酶标记时，或者在试剂盒含酶标记第二抗体时，试剂盒也可还含对于酶的底物。基质的详细与对于本实施方式的测定方法而所述的相同。
[0087]
本实施方式的试剂盒也可将收容各试剂的容器捆包到箱中而提供于使用者。在箱中，也可同装附带文书。在附带文书中也可记载了试剂盒的构成、各试剂的组成、使用方法、保存方法等。
[0088]
本实施方式的试剂盒的一例示于图1a。在图1a中，11表示试剂盒，12表示收容含捕获抗体的试剂的第1容器，13表示收容含检测抗体的试剂的第2容器，14表示捆包箱，15表示附带文书。在此例中，捕获抗体也可固定于固相(例如磁性粒子)。另外，检测抗体也可被标记物质标记。
[0089]
进一步的的实施方式的试剂盒的一例示于图1b。在图1b中，21表示试剂盒，22表示收容含捕获抗体的试剂的第1容器，23表示收容含检测抗体的试剂的第2容器，24表示捆包箱，25表示附带文书，26表示作为固相的微平板。在此例中，检测抗体也可被标记物质标记。
[0090]
进一步的的实施方式的试剂盒的一例示于图1c。在图1c中，31表示试剂盒，32表示收容含捕获抗体的试剂的第1容器，33表示收容含被酶标记的检测抗体的试剂的第2容器，34表示收容含对于酶的底物的试剂的第3容器，35表示捆包箱，36表示附带文书。在此例中，捕获抗体也可固定于固相(例如磁性粒子)。
[0091]
本实施方式的试剂盒也可还含校准物。校准物也可例如，具备不含病毒抗原的缓冲液(阴性对照)和以已知浓度含重组型病毒抗原的缓冲液。
[0092]
接下来，将本发明由实施例详细地说明，但本发明不限定于这些实施例。
[0093]
【实施例】
[0094]
【制造例：与sars-cov的n蛋白质特异性地结合的抗体的制作】
[0095]
(1)抗原的制作
[0096]
使用sars-cov的基因组rna序列(genbank的登录编号：ay274119)，由fujimoto k.等,2008,j.clin.microbiol.,vol.46,p.302-310中记载的方法合成编码sars-cov的n蛋白质的全长cdna。将得到的cdna整合到编码pqe30载体(qiagen公司)的his标签(6个组氨酸残
基)的序列的下游而得到sars-covnp表达载体。使用得到的表达载体，由常规方法，使his标签附权重组型n蛋白质在大肠杆菌表达。由常规方法，溶解大肠杆菌而取得可溶性级分，将重组型n蛋白质用his-trap hp柱(qiagen公司)纯化。
[0097]
(2)杂交瘤的制作及筛选
[0098]
用制作的重组型n蛋白质及完全弗氏佐剂的混合物免疫balb/c小鼠(7周龄、雌)，由kohler g.及milstein c.,nature,vol.256,pp.495-497,1975中记载的方法制作产生针对sars-cov的n蛋白质的抗体的杂交瘤。对于得到的杂交瘤，将产生对抗原显示反应性的抗体的株由elisa法选择。将选择的杂交瘤由有限稀释法克隆，还选择稳定产生抗体的株。由此，得到产生与sars-cov的n蛋白质特异性地结合的抗体的2种杂交瘤。以下，这些杂交瘤也称为“克隆1”及“克隆2”。
[0099]
(3)单克隆抗体的纯化
[0100]
将取得的各杂交瘤的培养上清(100ml)用0.22μm滤器一过滤而除去不溶物。使过滤的培养上清通过填充1ml的蛋白g-sepharose 4b(ge healthcare公司)的柱，向柱吸附抗体。从柱除去非特异吸附分之后，通过将柱置于酸性条件而使单克隆抗体游离。将回收的单克隆抗体用100倍量的磷酸缓冲生理盐水(pbs)透析而纯化。以下，从克隆1的杂交瘤的培养上精纯化的单克隆抗体也称为“第1抗体”，从克隆2的杂交瘤的培养上精纯化的单克隆抗体也称为“第2抗体”。
[0101]
(4)抗体的氨基酸序列的解析
[0102]
从取得的各杂交瘤提取总rna，由5'-race法合成编码含重链及轻链的可变区域的部位的cdna。将得到的cdna整合到质粒载体，将编码各抗体的重链及轻链的可变区域的碱基序列由测序解析。从取得的碱基序列预测氨基酸序列，取得基于kabat法的各抗体的重链及轻链的可变区域的氨基酸序列。另外，取得各cdr的氨基酸序列。
[0103]
第1抗体的重链及轻链的可变区域的氨基酸序列如下所述。
[0104]
·
重链可变区域
[0105]
qvtlkesgpg ilqpsqtlsl tcsfsgfsls tsgtgvswir qpsgkglewl ahiywdddkr ynpslksrlt vskdtsgnqv flkitsvdta dtatyycars nygydldywg qgttltvss(seq id no:13)
[0106]
·
轻链可变区域
[0107]
divmtqsqkf mstsvgdrvs vtckasqnvg tnvvwyqqkp gqspkaliys asyrysgvpd rftgsgsgtd ftltisnvqs edlaeyfcqq ynnypltfgs gtkleikra(seq id no:14)
[0108]
第1抗体的轻链及重链的cdr1、cdr2及cdr3的氨基酸序列如下所述。这些cdr的氨基酸序列是基于kabat法的序列。
[0109]
·
cdrh1：tsgtgvs(seq id no:1)
[0110]
·
cdrh2：hiywdddkry npslks(seq id no:2)
[0111]
·
cdrh3：snygydldy(seq id no:3)
[0112]
·
cdrl1：kasqnvgtnv v(seq id no:4)
[0113]
·
cdrl2：sasyrys(seq id no:5)
[0114]
·
cdrl3：qqynnyplt(seq id no:6)
[0115]
第2抗体的重链及轻链的可变区域的氨基酸序列如下所述。
[0116]
·
重链可变区域
[0117]
evqlvesggg lvkpggslkl scaasgftfs dyymywvrqt pekrlewvat isdggsytyy pdsvkgrfti srdnaknnly lqmsslksdd takyycaraa dyggyfdywg qgttltvss(seq id no:15)
[0118]
·
轻链可变区域
[0119]
diqltqttss lsaslgdrvt iscsasqgis nylnwyqqkp dgtvklliyy tsslhsgvps rfsgsgsgtd ysltisnlep ediatyycqq ysklpytfgg gtkleikra(seq id no:16)
[0120]
第2抗体的轻链及重链的cdr1、cdr2及cdr3的氨基酸序列如下所述。这些cdr的氨基酸序列是基于kabat法的序列。
[0121]
·
cdrh1：dyymy(seq id no:7)
[0122]
·
cdrh2：tisdggsyty ypdsvkg(seq id no:8)
[0123]
·
cdrh3：aadyggyfdy(seq id no:9)
[0124]
·
cdrl1：sasqgisn(seq id no:10)
[0125]
·
cdrl2：ytsslhs(seq id no:11)
[0126]
·
cdrl3：qqysklpyt(seq id no:12)
[0127]
【实施例1：sars-cov-2的n蛋白质的免疫学测定】
[0128]
使用制造例中得到的第1抗体及第2抗体而调制用于全自动免疫测定装置的试剂，由这些试剂测定sars-cov-2的n蛋白质。
[0129]
(1)抗原溶液的调制
[0130]
作为病毒抗原，使用作为sars-cov-2的重组型n蛋白质的sars-cov-2核衣壳-his重组蛋白(sino biological公司)。将此抗原用提取试剂或稀释用缓冲液稀释而调制以100pg/ml、1,000pg/ml或10,000pg/ml的浓度含病毒抗原的抗原溶液。提取试剂的组成是0.3％np-40(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚)、15mm edta
·
2na、60mm naoh、6mm aces(n-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸)、0.22m nacl及15mm nan3，ph是7.0。稀释用缓冲液的组成是80mm三乙醇胺盐酸盐、1％bsa及0.1％nan3，ph是7.5。
[0131]
(2)试剂的调制
[0132]
r1试剂(含捕获抗体的试剂)是将第1抗体或第2抗体用生物素由惯用的方法标记而溶解于r1试剂用缓冲液(100mm hepes、150mm nacl、25mm edta
·
2na、2.5％酪蛋白na、1％bsa、0.09％nan3、0.015％消泡剂si、ph7.5)而调制。r1试剂中的各抗体的浓度是1μg/ml。作为r2试剂(固相)，使用含链霉亲和素固定化磁性粒子的hiscl r2试剂(sysmex株式会社)。r3试剂(含检测抗体的试剂)是将第1抗体或第2抗体用碱性磷酸酶(alp)由惯用的方法标记而溶解于r3试剂用缓冲液(100mm mes、150mm nacl、1mm mgcl2、0.1mm zncl2、1％bsa、50mg/l清除剂alp、0.09％nan3、0.015％消泡剂si、ph6.5)而调制。r3试剂中的各抗体的浓度是400ng/ml。作为r4试剂(测定用缓冲液)，使用hiscl r4试剂(sysmex株式会社)。作为r5试剂(底物溶液)，使用含cdp-star(注册商标)的hiscl r5试剂(sysmex株式会社)。作为磁性粒子的清洗液，使用hiscl清洗液(sysmex株式会社)。
[0133]
(3)测定
[0134]
使用上述的r1～r5试剂，由全自动免疫测定装置hiscl-800(sysmex株式会社)进行测定。首先，作为捕获抗体，使用第1抗体，作为检测抗体，使用第2抗体而进行测定。具体
性的操作如以下。向含第1抗体的r1试剂(60μl)加抗原溶液(10μl)而混合之后，加r2试剂(30μl)而混合。对得到的混合液中的磁性粒子进行集磁而除上清，加hiscl清洗液(300μl)而清洗磁性粒子。除上清，向磁性粒子添加含第2抗体的r3试剂(60μl)而混合。对得到的混合液中的磁性粒子进行集磁而除上清，加hiscl清洗液(300μl)而清洗磁性粒子。除上清，向磁性粒子添加r4试剂(50μl)及r5试剂(100μl)，充分混合而对化学发光强度进行测定。接下来，作为捕获抗体，使用第2抗体，作为检测抗体，使用第1抗体而进行测定。此测定除了代替含第1抗体的r1试剂而使用含第2抗体的r1试剂，代替含第2抗体的r3试剂而使用含第1抗体的r3试剂以外，与上述同样地进行。另外，为了对背景进行测定，除了代替抗原溶液而使用不含抗原的提取试剂或稀释用缓冲液以外，与上述同样地进行测定。从各抗原溶液的测定值及背景算出测定的sn比。
[0135]
(4)结果
[0136]
各测定的sn比示于表1。表中，“测定1”是指作为捕获抗体，使用第1抗体，作为检测抗体，使用第2抗体的测定，“测定2”是指作为捕获抗体，使用第2抗体，作为检测抗体，使用第1抗体的测定。“抗原溶液a”是指使用稀释用缓冲液调制的抗原溶液，“抗原溶液b”是指使用提取试剂调制的抗原溶液。
[0137]
【表1】
[0138][0139]
如从表1得知，测定1的sn比显著地高于测定2的sn比。因此，第1抗体表示适宜于免疫学测定中的捕获抗体，第2抗体表示适宜于免疫学测定中的检测抗体。即，表示可由作为捕获抗体而使用第1抗体，作为检测抗体而使用第2抗体的夹心elisa法良好地测定试样中的sars-cov-2的n蛋白质。另外，在测定1中，抗原溶液a及b之任一者的sn比均高，从而表明表面活性剂不特别影响测定。
[0140]
【实施例2：与sars-cov、sars-cov-2及mers-cov的n蛋白质的反应性】
[0141]
探讨可由以第1抗体及第2抗体各自作为捕获抗体及检测抗体使用的免疫学测定测定sars-cov及meas-cov的n蛋白质与否。为了比较，还测定sars-cov-2的n蛋白质。
[0142]
(1)抗原溶液的调制
[0143]
作为病毒抗原，使用制造例中制作的sars-cov的重组型n蛋白质、与实施例1相同的市售的sars-cov-2的重组型n蛋白质、及mers-cov的重组型n蛋白质。再者，mers-cov的重组型n蛋白质使用公知的蚕表达系而由常规方法制作。将这些重组型n蛋白质用实施例1的稀释用缓冲液稀释而调制以100pg/ml的浓度含各病毒抗原的抗原溶液。
[0144]
(2)测定
[0145]
试剂使用实施例1中调制的含第1抗体的r1试剂及含第2抗体的r3试剂、以及hiscl r2试剂、hiscl r4试剂及hiscl r5试剂(均sysmex株式会社)。使用这些试剂，由hiscl-800(sysmex株式会社)与实施例1同样地测定各抗原溶液。另外，除了作为背景，代替抗原溶液而使用不含抗原的稀释用缓冲液以外，与上述同样地进行测定。各测定的发光强度(hiscl计数值)示于表2。
[0146]
【表2】
[0147]
sars-cov-2sars-covmers-cov背景40,94631,7091,7111,648
[0148]
(3)结果
[0149]
如从表2得知，对sars-cov-2及sars-cov的n蛋白质进行测定之时的发光强度与背景相比显著地高。一方面，对mers-cov的n蛋白质进行测定之时的发光强度是与背景同程度。这些提示，第1抗体及第2抗体与sars-cov-2及sars-cov的n蛋白质形成夹心免疫复合体，不与mers-cov的n蛋白质形成夹心免疫复合体。
[0150]
【实施例3：与hcov-oc43、hcov-nl63及hcov-229的病毒抗原的反应性】
[0151]
探讨可由以第1抗体及第2抗体各自作为捕获抗体及检测抗体使用的免疫学测定测定hcov-oc43、hcov-nl63及hcov-229的病毒抗原与否。
[0152]
(1)抗原溶液的调制
[0153]
作为病毒抗原，使用作为hcov-oc43、hcov-nl63及hcov-229e的灭活溶液的冠状病毒株：oc43裂解物(1mg)、冠状病毒株：nl63裂解物(1mg)及冠状病毒株：229e裂解物(1mg)(均自zeptometrix公司)。这些灭活溶液将纯化的病毒用含表面活性剂的溶液溶解，由加热灭活而调制，含1mg蛋白质。将这些灭活溶液用实施例1的稀释用缓冲液稀释而调制以10ng/ml、100ng/ml或1,000ng/ml的浓度含蛋白质的抗原溶液。
[0154]
(2)测定
[0155]
使用与实施例2相同的r1～r5试剂，由hiscl-800(sysmex株式会社)与实施例1同样地测定各抗原溶液。另外，除了作为背景，代替抗原溶液而使用不含抗原的稀释用缓冲液以外，与上述同样地进行测定。各测定的发光强度(hiscl计数值)示于表3。
[0156]
【表3】
[0157][0158]
(3)结果
[0159]
如从表3得知，对hcov-oc43、hcov-nl63及hcov-229e的灭活溶液中所含的蛋白质进行测定之时的发光强度是与背景同程度。因此提示，第1抗体及第2抗体不与hcov-oc43、hcov-nl63及hcov-229e的病毒抗原形成夹心免疫复合体。
[0160]
【实施例4：检测界限的探讨】
[0161]
使用以低浓度含sars-cov-2的n蛋白质的抗原溶液探讨以第1抗体及第2抗体各自作为捕获抗体及检测抗体使用的免疫学测定的检测界限。
[0162]
(1)抗原溶液的调制
[0163]
作为病毒抗原，使用sars-cov-2核衣壳-his重组蛋白(sino biological公司)。将此抗原添加到校准物稀释用缓冲液或实施例1的提取试剂中而调制以1pg/ml、2pg/ml、3pg/ml、4pg/ml、5pg/ml、或者10pg/ml的浓度含病毒抗原的抗原溶液。抗原溶液对于各浓度，各10个调制(n＝10)。校准物稀释用缓冲液是指不含表面活性剂，用于对校准曲线制成用的标准物质溶液进行稀释的缓冲液。校准物稀释用缓冲液的组成是80mm三乙醇胺盐酸盐、1％bsa及0.1％nan3，ph是7.5。
[0164]
(2)测定
[0165]
使用与实施例2相同的r1～r5试剂，由hiscl-800(sysmex株式会社)与实施例1同样地测定各抗原溶液。另外，除了作为背景，代替抗原溶液而使用不含抗原的校准物稀释用缓冲液或提取试剂以外，与上述同样地进行测定。对于各抗原溶液的发光强度(hiscl计数值)的平均值(av)、标准偏差(sd)及变动系数(cv)示于表4。表中，“抗原溶液c”是指使用校准物稀释用缓冲液调制的抗原溶液，“抗原溶液d”是指使用提取试剂调制的抗原溶液。另外，相对于抗原浓度而对发光强度的平均值进行标绘的坐标图示于图2a及b。
[0166]
【表4】
[0167][0168]
(3)结果
[0169]
如从图2a及b得知，即使是以10pg/ml以下的低浓度含sars-cov-2的n蛋白质的试样，检测到对应于抗原浓度的信号。从表4可知，对于使用校准物稀释用缓冲液调制的抗原溶液，检测界限(lod)是1pg/ml以上，对于使用提取试剂调制的抗原溶液，lod是2pg/ml以上。
[0170]
【实施例5：免疫学测定和pcr法的相关】
[0171]
将含sars-cov-2的市售的生物体试样用本实施方式的测定方法及pcr法测定，对用各方法得到的测定值进行比较，探讨在本实施方式的测定方法和pcr法之间确认到相关与否。
[0172]
(1)生物体试样的预处理
[0173]
从cantor bioconnect公司购入sars-cov-2感染患者的鼻咽头拭液(36受试体)。将各受试体(500μl)和实施例1的提取试剂(500μl)混合而调制抗原溶液。得到的抗原溶液在免疫学测定中使用。另外，使用qiaamp病毒rna小型试剂盒(qiagen公司)，从上述的各受试体提取rna。得到的rna溶液在由pcr法的测定中使用。
[0174]
(2)免疫学测定
[0175]
使用与实施例2相同的r1～r5试剂，由hiscl-800(sysmex株式会社)与实施例1同样地测定抗原溶液。另外，除了作为背景，代替抗原溶液而使用不含抗原的校准物稀释用缓冲液以外，与上述同样地进行测定。
[0176]
(3)由pcr法的测定
[0177]
由pcr法的测定根据由国立感染症研究所制成的“病原体检测手册2019-ncov ver.2.9.1”(令和2(2020)年3月19日)中记载的“由使用taqman探针的实时one-step rt-pcr法的2019-ncov的检测”的程序进行。作为实时rt-pcr试剂，使用quantitect(注册商标)probe rt-pcr kit(qiagen公司)。扩增反应使用附带在所述试剂盒的手册中记载的条件而
进行。在实时rt-pcr中使用的引物组及探针的序列如下所述。以下，“fam”表示荧光染料(荧光素亚磷酰胺)，“bhq”表示黑洞猝灭剂。
[0178]
正向引物：5'-cacattggca cccgcaatc-3'(seq id no:17)
[0179]
反向引物：5'-gaggaacgag aagaggcttg-3'(seq id no:18)
[0180]
探针：5'-fam-acttcctcaa ggaacaacat tgcca-bhq-3'(seq id no:19)
[0181]
(4)结果
[0182]
在x轴取发光强度(hiscl计数值)，y轴取病毒rna浓度(拷贝/μl)的xy平面，对由对各受试体的本实施方式的测定方法及pcr法的测定值进行标绘。得到的坐标图示于图3。如从图3得知提示，在本实施方式的测定方法和pcr法之间确认到相关。
[0183]
【符号的说明】
[0184]
11、21、31：试剂盒
[0185]
12、22、32：第1容器
[0186]
13、23、33：第2容器
[0187]
34：第3容器
[0188]
14、24、35：捆包箱
[0189]
15、25、36：附带文书