一种鱼饲料用中药益生菌发酵液的制备方法与流程

1.本发明属于生物发酵及生态养殖技术领域，具体涉及一种鱼饲料用中药益生菌发酵液的制备方法。


背景技术：

2.由于受到淡水水体天然饵料资源缺乏的限制，淡水鱼产量及商品规格远远不能满足市场日益增长的需求，因此，通过外源性营养的加入解决这一现状就成为必然。目前，普遍采用的方法是施肥和投喂人工饲料。配合饲料是一种根据动物的生长阶段、生理要求、生产用途的营养需要，以饲料营养价值评定的实验和研究为基础，按科学配方把不同来源的饲料，依一定比例均匀混合，并按规定的工艺流程生产以满足各种实际需求的饲料。
3.通过在配合饲料中加入特定益生菌及中药成分以改善肠道营养健康，降低鱼类生长过程中的发病率，提高鱼的成活率已有大量现有技术予以公开。如专利cn110754568a公开了了一种含益生菌的鱼虾饲料，在原鱼粮基础上添加中药当归和嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、酵母菌等益生菌，益生菌含量占10％，制备时先将当归采用所述益生菌发酵，再制备饲料。该发明在原鱼粮基础上添加嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、酵母菌等益生菌抑制病原菌，提高饲料利用率，净化水质，可以显着改善鱼虾营养，促进鱼虾生长，降低发病率。
4.专利cn 112314778 a公开了一种观赏鱼复合益生菌发酵中草药饲料及其制备方法，饲料具体组成成分及重量份数为：鱼粉30-50份、豆粕10-30份、玉米粉5-10份、面粉10-20份、鱼油3-5份、螺旋藻2-3份、啤酒酵母1-2份、混合维生素5-8份、混合矿物质5-8份、磷酸二氢钙2-3份、羧甲基纤维素钠1-2份、红曲粉3-5份、中药组合物3-8份、复合益生菌3-6份。制备方法包括中药组合物的制备、复合益生菌的制备、饲料基质的制备、饲料制备。该发明添加了中药组合物、复合益生菌、混合维生素和混合矿物质，减少鱼肠道有害微生物的数量、提高鱼体内代谢水平、增强鱼体的抗病力，延长鱼的寿命，红曲色素可以使鱼体增色，提高观赏价值。
5.专利cn 102367425 a公开了一种鱼饲料用中药益生菌液体培养基、培养方法及饲料添加剂，其成分包括：红糖、中药组分、磷酸二氢钾、酵母膏和水；其各成分占总的质量比为：红糖，5％～8％；中药组分，2％～3％；磷酸二氢钾，0.2％～0.3％；酵母膏，0.3％～0.5％；余量为水。该发明技术能够大幅提高活性益生菌的菌株活性和在肠道中的定植性能，并且使由其制得的饲料添加剂富含中药成分，还能使中药成分中起到药理作用的活性成分充分发挥，从而提高鱼用微生态饲料添加剂的强体治病性能和促生长性能。
6.上述现有技术均公开了益生菌及中药成分在鱼用饲料中的应用及功效。然而在实际的应用过程中，为满足益生菌用量的要求，益生菌往往需要进行发酵培养，而上述益生菌的发酵培养条件往往需要在厌氧或通入氧气条件下进行，而且对温度敏感，需要提供恒温环境，才能维持良好的发酵效率。以上条件往往需要较大的设备或装置投入以满足生产，极大的增加了生产成本。为此开发一种能够在常规空气条件下进行发酵培养，且对温度敏感度较低，能够适应于10～38℃温度条件变化(如广东地区全年大部分时间温度范围)，且发
酵效率高的培养体系具有显著的改进意义。常规空气条件下进行发酵培养相比厌氧或通入氧气条件下培养的难点还在于天然细菌的竞争生长易造成发酵液变质发臭，通过独特发酵体系及功能成分的添加抑制天然细菌的生长而促进优质益生菌的生长具有显著的意义。
7.另外，现有将中药成分用于鱼饲料主要基于的是其抗病药理活性，用于提高鱼体抗病能力。但中药成分的筛选及用量往往依靠经验，未有充分的实验数据提供相应的指导方向。而且现有技术还有报道直接在鱼饲料中添加中药粉，然而中药粉适口性差，对鱼类进食反而产生不利影响。


技术实现要素：

8.针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种鱼饲料用中药益生菌发酵液的制备方法。本发明发酵液的制备可在常规空气条件下进行，且能够适应于10～38℃温度条件变化，发酵效率均能维持在较高水平。可以为鱼用配合饲料的制造提供高效、高产的原料来源。
9.本发明的再一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的鱼饲料用中药益生菌发酵液。
10.本发明目的通过以下技术方案实现：
11.一种鱼饲料用中药益生菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
12.(1)将穿心莲、板蓝根、贯众、黄芪、党参、红枣、陈皮、山楂、甘草九味中药及红糖加水煎煮，过滤去药渣，得到煎煮液；
13.(2)将步骤(1)的煎煮液经稀释，然后加热至80～100℃，加入淀粉进行糊化反应，得到悬浮发酵培养液；
14.(3)将枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪链球菌和红螺菌组成的复合菌粉加入到步骤(2)的悬浮发酵培养液中，搅拌混合分散均匀，然后加入氮源和无机盐混匀，在10～38℃温度条件及空气条件下进行悬浮发酵培养，至悬浮发酵培养液表面长满白色至米黄色发酵菌斑，得到所述中药益生菌发酵液。
15.进一步地，步骤(1)中中药成分质量份配比如下：穿心莲10～20份、板蓝根5～15份、贯众5～15份、黄芪10～20份、党参5～15份、红枣5～10份、陈皮10～20份、山楂5～10份、甘草5～15份。
16.进一步地，步骤(1)中中药成分质量百分含量配比为：穿心莲、板蓝根和贯众占比30％～40％，黄芪、党参和红枣占比30％～40％，陈皮、山楂和甘草占比20％～40％。经本发明试验研究发现，在本发明的发酵体系中，穿心莲、板蓝根和贯众占比过高，发酵培养液表面难以生长出益生菌菌丝(斑)；穿心莲、板蓝根和贯众占比过低，环境中的天然细菌竞争性生长，发酵液变质发臭，无法生长出益生菌菌丝(斑)。黄芪、党参和红枣占比过低，益生菌菌丝(斑)生长缓慢，发酵效率低。陈皮、山楂和甘草的占比，对所得发酵液制备的鱼饲料的饵料系数具有较大影响。
17.进一步地，步骤(1)中红糖的加入量为中药成分总质量的0.5～2倍。
18.进一步地，步骤(2)中所述稀释标准为：最终稀释液质量为步骤(1)中中药成分总质量的150～600倍。
19.进一步地，步骤(2)中所述淀粉加入的质量浓度为0.5％～4％。淀粉加入量过低，
悬浮稳定效果较差，发酵效率降低；淀粉加入量过高，发酵液粘度过大，影响益生菌对氮源和无机盐等成分的吸收利用，同样会使发酵效率降低。且淀粉的加入及糊化反应后，可以在悬浮发酵培养液表面形成一层隔离的皮膜，提供一定的厌氧及阻隔环境中天然细菌的作用，可以为本发明特定的混合益生菌提供良好的前期生长保护环境。在不加入淀粉的情况下，益生菌发酵缓慢，而发酵时间过长，天然细菌发生竞争性生长，发酵液变质发臭，无法生长出益生菌发酵菌斑。
20.进一步地，步骤(3)中所述枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪链球菌和红螺菌组成的复合菌粉中枯草芽孢杆菌:酵母菌:粪链球菌:红螺菌的质量比为1～2:1～2:1～2:1～2。本发明采用的四种复合菌具有良好的协同作用，缺失其中任一种菌种所得发酵液制备的鱼饲料饵料系数均有一定程度的降低。
21.进一步地，步骤(3)中所述复合菌粉的加入质量为悬浮发酵培养液质量的0.5％～4％。
22.进一步地，步骤(3)中所述氮源选自尿素、蛋白胨、鱼粉中的至少一种；所述无机盐选自磷酸氢二铵、磷酸二氢钾中的至少一种。上述氮源及无机盐来源广泛，成本低。
23.一种鱼饲料用中药益生菌发酵液，通过上述方法制备得到。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
25.(1)本发明通过科学的方法验证了民间益生菌发酵液秘方中各组分及含量对益生菌发酵液的影响，并进一步通过实地养殖实验建立发酵液与制备的鱼饲料饵料系数之间的关系。为大规模工业化生产提供了良好的理论指导，有利于维持生产质量的稳定。
26.(2)本发明选用特定的复合菌配合特定的发酵体系，发酵液的制备可在常规空气条件下进行，且能够适应于10～38℃温度条件变化，发酵效率均能维持在较高水平。为鱼用配合饲料的制造提供高效、高产的原料来源。
27.(3)本发明充分利用了中药成分与益生菌发酵的协同作用，所得发酵液能够显著降低鱼饲料的饵料系数。
28.(4)本发明通过在发酵液中加入淀粉并进行糊化反应，可以形成悬浮发酵培养液，显著提高发酵效率。并可以在悬浮发酵培养液表面形成一层隔离的皮膜，提供一定的厌氧及阻隔环境中天然细菌的作用，为混合益生菌提供良好的前期生长保护环境，显著提高发酵效果。
附图说明
29.图1为本发明实施例中实验组1#发酵液表面长满发酵菌斑的中药益生菌发酵液照片图；
30.图2为本发明实施例中实验组3#发酵液表面未生长发酵菌斑的中药益生菌发酵液照片图。
具体实施方式
31.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
32.实施例1
33.本实施例的一种鱼饲料用中药益生菌发酵液的制备方法，具体制备步骤如下：
34.(1)按质量份计，将穿心莲15份、板蓝根10份、贯众10份、黄芪15份、党参10份、红枣10份、陈皮10份、山楂10份、甘草10份九味中药及100份红糖加水1k份煎煮，过滤去药渣，得到煎煮液。
35.(2)将步骤(1)的煎煮液加水稀释至50k份，然后加热至80～90℃，加入1k份淀粉进行糊化反应，得到悬浮发酵培养液。
36.(3)将枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪链球菌和红螺菌按质量比为1:1:1:1组成的复合菌粉1k份加入到步骤(2)的悬浮发酵培养液中，搅拌混合分散均匀，然后加入适量尿素、鱼粉和磷酸二氢钾混匀，在常温条件(广东某地区夏季昼夜温度19～32℃)及空气条件下(带盖塑料桶，非密封，简单防雨及防蚊虫)进行悬浮发酵培养至14天，悬浮发酵培养液表面长满白色至米黄色发酵菌斑，得到所述中药益生菌发酵液。所得中药益生菌发酵液表面长满发酵菌斑的照片图如图1所示。
37.为探究中药组成及含量配比对发酵的影响，设定如下表1所示的质量份中药配方组成。记录发酵情况(发酵时间最长记录至30天)及测定发酵液中活菌数量(发酵培养14天后未变质发臭培养液中活菌数)。结果如下表2所示。
38.表1.中药配方组成
39.实验组1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#11#12#13#穿心莲150151501515151515151515板蓝根100101010010101010101010贯众100101010100101010101010黄芪151501515151501515151515党参101001010101010010101010红枣101001010101010100101010陈皮101010010101010101001010山楂101010010101010101010010甘草101010010101010101010100
40.表2.发酵情况及活菌数量
[0041][0042][0043]
通过表1和表2结果中实验组1#～4#的对比结果可见，缺失穿心莲、板蓝根和贯众成分之后的实验组2#，发酵液很快变质发臭，无法生长出益生菌菌斑。说明天然空气环境下，天然细菌的竞争性生长占据优势，而本发明加入穿心莲、板蓝根和贯众成分的发酵液有利于维持本发明益生菌的生长优势。缺失黄芪、党参和红枣成分之后的实验组3#，益生菌难以生长，发酵14天活菌数量相比实验组1#显著降低，发酵30天仍未生长出发酵菌斑(其发酵液照片图如图2所示)。说明本发明黄芪、党参和红枣中药成分有利于促进益生菌生长的作用。缺失陈皮、山楂和甘草成分之后的实验组4#，对益生菌生长的影响不大。
[0044]
通过缺失单一组分的实验组5#～13#的结果可以进一步证明，缺失穿心莲、板蓝根和贯众中任一组分和整体比例降低的情况下，均无法有效生长出益生菌发酵菌斑。缺失黄芪、党参和红枣中任一组分和整体比例降低的情况下，益生菌发酵效率均显著降低。缺失陈皮、山楂和甘草中任一组分和整体比例降低的情况下，对益生菌生长的影响不大。
[0045]
应用效果测试：
[0046]
将以上各实验组的中药益生菌发酵液进行饲料制备并测试饲料的饲喂效果。
[0047]
(1)饲料制备方法为：将所得中药益生菌发酵液直接以喷雾混合的方式与大头鱼配合饲料混匀，低温干燥制粒，得到益生菌饲料。中药益生菌发酵液的用量为大头鱼配合饲
料质量的80％。大头鱼配合饲料组成为螺旋藻粉、南极磷虾粉、发酵豆粕、小麦面粉、花生麸、玉米蛋白粉、鱼油、大豆磷脂油、氯化胆碱、维生素、矿物质，经挤压膨化制备的缓沉饲料。
[0048]
(2)饲喂效果测试方法为：在广东某人工养殖测试基地用人工围栏分隔14块面积大小相等、水体环境相同的养殖区域。每个养殖区域放养100尾大头鱼幼苗，大头鱼幼苗平均规格为80～85g，试验周期180天。分别用以上实验组所得中药益生菌发酵液(发酵液未变质发臭的实验组，均以发酵14天的发酵液为准)制备的益生菌饲料及未加入中药益生菌发酵液的对照组进行饲养。投喂餐数每天3次，投饵率为3.5％。
[0049]
(3)饲喂效果评价：通过饵料系数评价饲料的饲喂效果。饵料系数(％)＝180天投喂饲料总量/大头鱼净增重量*100％。测试效果如下表3所示。
[0050]
表3.饵料系数评价结果
[0051]
实验组1#3#4#8#9#饵料系数1.281.851.731.631.59实验组10#11#12#13#对照组饵料系数1.571.491.501.471.89
[0052]
通过表3中实验组1#与3#及8#～10#的对比结果可以看出，发酵益生菌活菌浓度是饵料系数降低的主要因素。实验组3#缺少黄芪、党参和红枣成分后，发酵液培养至30天表面仍未生长发酵菌斑，发酵14天活菌数量相比实验组1#显著降低，导致其饵料系数显著升高。与对照组相比，未有明显的降低饵料系数的效果。实验组8#～10#由于黄芪、党参和红枣中单一组分的缺失，发酵效率均有一定程度的降低，并最终体现为饵料系数相比实验组1#显著升高。
[0053]
通过实验组4#和11#～13#的结果可以看出，缺失陈皮、山楂和甘草中任一组分和所有组分的情况下，饵料系数相比实验组1#均明显升高，且缺失所有组分的情况下升高更为显著，但升高程度相比缺少黄芪、党参和红枣成分后的情况稍有改善。而通过表2记载的实验结果表明，缺失陈皮、山楂和甘草中任一组分和所有组分的情况下，对益生菌生长的影响不大。这说明除了发酵益生菌活菌浓度是饵料系数降低的主要因素之外，还有陈皮、山楂和甘草所带来的另外的因素对降低饵料系数具有重要的作用。推测其原因在于缺少陈皮、山楂和甘草成分之后，影响发酵液制备饲料的适口性，导致饲养时鱼类进食量低，饲料的营养功能不能得到完全发挥。
[0054]
实施例2
[0055]
本实施例的一种鱼饲料用中药益生菌发酵液的制备方法，具体制备步骤如下：
[0056]
(1)按质量份计，将穿心莲15份、板蓝根10份、贯众10份、黄芪15份、党参10份、红枣10份、陈皮10份、山楂10份、甘草10份九味中药及100份红糖加水1k份煎煮，过滤去药渣，得到煎煮液。
[0057]
(2)将步骤(1)的煎煮液加水稀释至50k份，然后加热至80～90℃，分别加入如表4中不同量淀粉进行糊化反应，得到悬浮发酵培养液。
[0058]
(3)将枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪链球菌和红螺菌按质量比为1:1:1:1组成的复合菌粉1k份加入到步骤(2)的悬浮发酵培养液中，搅拌混合分散均匀，然后加入适量尿素、鱼粉和磷酸二氢钾混匀，在常温条件(广东某地区夏季温度19～32℃)及空气条件下(带盖塑
料桶，非密封，简单防雨及防蚊虫)进行悬浮发酵培养，至悬浮发酵培养液表面长满白色至米黄色发酵菌斑，得到所述中药益生菌发酵液。
[0059]
记录不同淀粉加入量的发酵情况(发酵时间最长记录至30天)及测定发酵液中活菌数量(发酵培养14天后未变质发臭培养液中活菌数)。并设定对比例1(直接在稀释液中加入1k份淀粉混匀，无加热糊化过程)。结果如下表4所示。
[0060]
表4.不同淀粉加入量发酵情况及活菌数量
[0061][0062]
通过表4结果可以看出，本发明淀粉加入量及糊化反应步骤对益生菌发酵效率具有显著影响。淀粉加入量过低或过高，均会使发酵效率降低。说明合适含量的淀粉经糊化反应后可得到适合菌粉发酵的悬浮发酵体系，可以提高发酵效率。在不加入淀粉或加入合适含量的淀粉但未糊化反应的情况下，经30天发酵培养均未生长发酵菌斑，且发酵液轻微变质发臭。其原因可能在于淀粉的加入及糊化反应后，可以在悬浮发酵培养液表面形成一层隔离的皮膜，提供一定的厌氧及阻隔环境中天然细菌的作用，可以为本发明特定的混合益生菌提供良好的前期生长保护环境。在未有皮膜隔离及保护的情况下，益生菌发酵缓慢，而发酵时间过长，天然细菌发生竞争性生长，发酵液变质发臭，无法生长出益生菌发酵菌斑。
[0063]
实施例3
[0064]
本实施例的一种鱼饲料用中药益生菌发酵液的制备方法，具体制备步骤如下：
[0065]
(1)按质量份计，将穿心莲15份、板蓝根10份、贯众10份、黄芪15份、党参10份、红枣10份、陈皮10份、山楂10份、甘草10份九味中药及100份红糖加水1k份煎煮，过滤去药渣，得到煎煮液。
[0066]
(2)将步骤(1)的煎煮液加水稀释至50k份，然后加热至80～90℃，加入1k份淀粉进行糊化反应，得到悬浮发酵培养液。
[0067]
(3)将枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪链球菌和红螺菌按表5的质量比组成的复合菌粉1k份加入到步骤(2)的悬浮发酵培养液中，搅拌混合分散均匀，然后加入适量尿素、鱼粉和磷酸二氢钾混匀，在常温条件(广东某地区夏季温度19～32℃)及空气条件下(带盖塑料桶，非密封，简单防雨及防蚊虫)进行悬浮发酵培养，经14天左右培养后悬浮发酵培养液表面均长满白色至米黄色发酵菌斑，得到所述中药益生菌发酵液。
[0068]
按照实施例1的方法制备饲料并测试饲喂效果，计算相应饵料系数结果如下表5所示。
[0069]
表5
[0070][0071][0072]
由表5结果可见，本发明采用的四种复合菌具有良好的协同作用，缺失其中任一种菌种所得发酵液制备的鱼饲料饵料系数相比实验组1#均有一定程度的降低。
[0073]
实施例4
[0074]
本实施例的一种鱼饲料用中药益生菌发酵液的制备方法，具体制备步骤如下：
[0075]
(1)按质量份计，将穿心莲15份、板蓝根10份、贯众10份、黄芪15份、党参10份、红枣10份、陈皮10份、山楂10份、甘草10份九味中药及100份红糖加水1k份煎煮，过滤去药渣，得到煎煮液。
[0076]
(2)将步骤(1)的煎煮液加水稀释至50k份，然后加热至80～90℃，加入1k份淀粉进行糊化反应，得到悬浮发酵培养液。
[0077]
(3)将枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪链球菌和红螺菌按质量比为1:1:1:1组成的复合菌粉1k份加入到步骤(2)的悬浮发酵培养液中，搅拌混合分散均匀，然后加入适量尿素、鱼粉和磷酸二氢钾混匀，在常温条件(广东某地区春季昼夜温度10～20℃)及空气条件下(带盖塑料桶，非密封，简单防雨及防蚊虫)进行悬浮发酵培养，经观测发酵培养20天后，悬浮发酵培养液表面长满白色至米黄色发酵菌斑，得到所述中药益生菌发酵液。
[0078]
通过以上实施例可以看出，本发明发酵体系及发酵益生菌能够适应于10～38℃温度条件变化，发酵效率均能维持在较高水平。
[0079]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。