IL-10变体分子和治疗炎性疾病和肿瘤的方法与流程

il-10变体分子和治疗炎性疾病和肿瘤的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年3月6日提交的美国临时专利申请号62/814,669、2019年9月12日提交的美国临时专利申请号62/899,504和2020年1月17日提交的美国临时专利申请号62/962,332的优先权，其每个的公开内容通过引用整体并入本文。
3.引言
4.本技术涉及白细胞介素10(il-10)的变体形式，其包含对il-10分子中存在的il-10受体结合区和/或负责结构域间角度的结构域的修饰。通过修饰il-10中这些结构域中的一个或两个，发明人惊奇地发现可以调整或调节所得il-10受体的生物学功能，以引起特定的生物学反应。本技术还涉及半衰期延长的il-10或il-10变体分子，其包含基于非蛋白质的血清延长部分以及基于蛋白质的延长方式。本技术还涉及包含il-10变体分子的融合蛋白。


背景技术：

5.il-10已被描述为细胞因子合成抑制因子，因为其能够抑制(i)单核细胞/巨噬细胞响应于脂多糖分泌的促炎细胞因子，和(ii)白细胞介素2(il-2)的分泌和cd4

t细胞的增殖。当发现il-10的病毒类似物并报告了与人il-10具有相似或相同的功能时，推测这些il-10的病毒类似物通过采用在人基因组中发现的抑制性细胞因子的功能来增强病毒毒力。
6.通过产生发生慢性小肠结肠炎的il-10敲除小鼠，使进一步研究il-10的抑制作用成为可能。从这些小鼠产生的数据清楚地表明，il-10敲除小鼠在整个胃肠道发生严重炎症，主要是通过单核细胞/巨噬细胞和cd4

t细胞分泌的慢性炎性细胞因子，这与最初在体外观察的结果一致。
7.总的来说，这些数据表明il-10在抑制炎症方面发挥了主导作用。特别是，缺乏功能性il-10受体或缺乏产生il-10能力的患者表现出增加的发生炎症相关的胃肠道疾病的倾向。
8.进行了多项临床试验以评估il-10在银屑病、类风湿性关节炎和克罗恩病背景下的抗炎功能。一般而言，发现重组人il-10(rhuil-10)治疗是安全的，但缺乏疗效。特别是，用rhuil-10治疗克罗恩病患者导致反向剂量反应，其中低剂量似乎可以适度抑制炎症，而在高剂量时抑制作用消失。对最终克罗恩研究的严格分析表明，患者服用10和20μg/kg rhuil-10表现出增加的干扰素gamma(ifnγ和新蝶呤(neopterin)的血清浓度。已知干扰素γ加重炎性肠疾病和克罗恩病的发病机制。数据表明，在高剂量下，用il-10治疗诱导ifnγ，这反过来又将加剧炎性疾病。
9.对健康人中il-10作用的进一步分析表明，在暴露于促炎因子脂多糖(lps)之前施用il-10抑制促炎细胞因子的产生。然而，在暴露于lps后施用rhuil-10增强了促炎细胞因子的分泌。由于lps是患有炎性肠疾病(ibd)患者中通常的和外来的肠道细菌的产物，因此这些患者永远不会“不含”lps，因此永远不会处于可以在lps之前应用il-10治疗的状态。因此，这些数据表明克罗恩病和患有其他炎性疾病的患者永远不会看到il-10治疗的治疗益
处。
10.进一步增加的对il-10作用的困惑是，积累的数据表明il-10激活免疫系统以诱导抗肿瘤反应。最初的数据表明il-10激活nk细胞，但进一步的研究揭示il-10治疗以cd8

t细胞和ifnγ依赖性方式抑制肿瘤生长。继续研究揭示，il-10治疗抑制foxp3

cd4

t调节性细胞的增殖，并增强kupffer细胞清除作用，这些功能都表明il-10是一种有效的免疫刺激剂，而不是抑制剂。最后，这些刺激活性在用聚乙二醇化il-10治疗的肿瘤患者的临床研究中得到证实。
11.总的来说，这些数据表明il-10治疗患有自体免疫相关炎症的患者不能引起治疗益处，表明il-10不是一种泛免疫抑制剂。与此相一致，用(peg)il-10治疗癌症患者导致有效且治疗上有用的免疫激活，特别是诱导剂量依赖性血清ifnγ，类似于用il-10治疗的克罗恩病患者，表明il-10是一种有效的免疫刺激剂。
12.那么未解决的就是为什么病毒会获得il-10序列。对爱泼斯坦巴尔病毒(ebv-il10)和巨细胞病毒(cmv-il10)同源物的进一步分析表明，这些病毒具有以两种主要方式改变的天然il-10序列。ebv-il10似乎保留了导致配体受体相互作用的特定角度的类似的同源二聚体相互作用的空间角度，而其对il-10受体的亲和力显著降低。cmv-il10对il-10受体的亲和力增加，而与il-10受体的相互作用的角度显著改变。虽然ebv-il10和cmv-il10序列分别保留了与天然il-10的大约80％和27％的同源性，但每种病毒同源物都具有完全不同的il-10受体亲和力、不同的受体接合角度，每种病毒同源物表现出发挥与天然il-10高度相似的抗炎功能。因此尚不清楚对il-10受体的亲和力和/或受体相互作用的角度如何影响随后的il-10信号的下游传导。
13.各种优选实施方案的概述
14.本技术总体上涉及新型il-10变体分子，其调节il-10受体信号传导。因此，本技术涉及il-10变体分子，其中对il-10分子结构并入修饰，从而产生具有改变的il-10受体结合亲和力和/或改变的il-10结构域间角度的新型il-10变体分子。本发明人惊奇地发现，在影响il-10受体亲和力和/或il-10结构域间角度的关键结构域中修饰il-10，导致产生il-10受体激动剂，其可用于治疗免疫疾病、炎性疾病或病症、以及治疗癌症。此外，还可以通过将变体il-10分子作为融合蛋白的一部分并入(例如各种抗体结构域(fc或可变结构域))而使il-10变体分子具有增加的血清半衰期，而不阻碍il-10单体或il-10变体形成il-10同源二聚体。
15.在某些实施方案中，il-10变体分子是修饰的人il-10。在其他实施方案中，il-10变体分子是修饰的小鼠il-10。在优选的实施方案中，il-10变体分子是修饰的il-10病毒同源物。在更优选的实施方案中，病毒il-10同源物是cmv-il10。在最优选的实施方案中，病毒il-10同源物是ebv-il10。
16.在进一步的实施方案中，il-10变体分子在受体结合区内并入至少一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。在其他实施方案中，il-10变体分子在负责形成il-10的结构域间角度的区中并入至少一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。在一个优选的实施方案中，il-10变体分子包括受体结合结构域中的修饰和/或负责结构域间角度的区中的修饰之一种或两种。在最优选的实施方案中，il-10变体分子在ebv-il10蛋白分子中并入一种或两种修饰。
17.在各种实施方案中，il-10变体分子与野生型il-10相比，具有增强的对il-10受体
或受体复合物的亲和力。在其他实施方案中，il-10变体分子与野生型il-10相比，具有降低的对il-10受体或受体复合物的亲和力。在其他实施方案中，与野生型il-10相比，更优选与ebv-il10相比，il-10变体分子形成更窄或受限的结构域间角度。在另一个实施方案中，与野生型il-10相比，更优选与ebv-il10相比，il-10变体分子形成更宽或松弛的结构域间角度。
18.在又一些实施方案中，ebv il-10变体分子在位于ebv il-10的螺旋a、ab环和/或螺旋f的受体结合区(“位点1”)内并入至少一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。在某些实施方案中，对受体结合结构域区的修饰增加或增强对il-10受体或受体复合物的亲和力。在某些其他实施方案中，对受体结合区的修饰减少或降低对il-10受体或受体复合物的亲和力。
19.在进一步的实施方案中，ebv il-10变体分子在负责结构域间角度形成的ebv il-10区内并入至少一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。在优选的实施方案中，修饰可以发生在ebv il-10的de环中。在de环中的修饰导致ebv il-10变体分子，其具有受限的结构域间角度或松弛的结构域间角度。
20.在其他方面，il-10变体分子是嵌合分子或融合分子。在一个实施方案中，嵌合蛋白或融合蛋白包含来自不同蛋白质的一个或多个结构域，或在单个蛋白质内包含突变，产生另一蛋白质的特征。在一个优选的实施方案中，嵌合蛋白或融合蛋白包含第一部分，所述第一部分包含与另一分子融合的如本文所述的il-10变体分子，所述另一分子包括但不限于白蛋白、酶、糖基转移酶、半乳糖基转移酶、igg铰链区(例如fc区)、一个或多个抗体的一个或多个可变结构域(例如但不限于可变重链或可变轻链)、细胞因子(例如il-6、il-4、il-1、il-2、il-3、il-5、il-7、il-8、il-9、il-12、il-15、gm-csf、g-csf、干扰素-α、-β、-γ、tgf-β和肿瘤坏死因子-α、-β)、标记物、药剂、化疗剂、放射性同位素和半衰期延长剂(例如羟乙基淀粉(hesylation)、聚唾液酸、heparosan聚合物、弹性蛋白样多肽和透明质酸)。在另一个实施方案中，il-10变体分子与一个或多个抗体重链或轻链可变区融合。融合蛋白可包含一个或多个接头，其共价连接融合蛋白的不同部分。融合蛋白可以与相同类型的另一融合蛋白形成非共价结合的复合物。这种融合蛋白允许il-10的单体或变体il-10分子的单体结合在一起形成il-10或变体il-10的功能性同源二聚体。
21.在其他实施方案中，变体il-10分子是工程化融合蛋白的一部分。融合蛋白包含至少一个il-10或il-10变体分子的单体，其在融合蛋白的第一末端与接头或间隔物缀合，其中一个或多个间隔物用于连接融合蛋白的各个部分，然后与在另一末端缀合的至少一个其他分子缀合，其中所述分子选自至少一种细胞因子或其单体、治疗剂、标记物、血清半衰期延长分子或蛋白质(例如但不限于受体、配体或抗体的各个部分)。在一个优选的实施方案中，融合蛋白包含il-10的单体或il-10变体分子的单体，其通过接头或间隔物与至少一个重链和/或轻链可变区缀合。在最优选的实施方案中，融合蛋白包含ebv il-10的单体或ebv il-10变体分子的单体，其通过接头或间隔物与至少一个重链和/或轻链区缀合。在最优选的实施方案中，ebv il-10或其ebv il-10变体分子的单体与一个重链可变区和一个轻链可变区缀合，其中单体一起形成二聚体复合物。ebv il-10的单体或ebv il-10变体分子的单体可缀合至重链或轻链可变区的氨基末端或羧基末端。
22.在某些实施方案中，将治疗量的本技术的il-10变体分子、其融合蛋白或嵌合蛋白
施用于患有炎性疾病或病症的受试者，所述炎性疾病或病症例如但不限于炎性肠疾病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎(nash)和非酒精性脂肪性肝病(nafld)。在另一个实施方案中，将治疗量的本技术的il-10变体分子、其融合蛋白或嵌合蛋白施用于患有癌症的受试者。还设想治疗患有多于一种病理病症的受试者。在更优选的实施方案中，il-10变体分子是ebv-il10变体、其融合蛋白或嵌合蛋白。在又一个实施方案中，il-10变体分子、其融合蛋白或嵌合蛋白用于组合治疗。例如，il-10变体分子、其融合蛋白或嵌合蛋白可以与其他疗法或治疗组合施用于受试者。在其他实施方案中，将治疗量的本技术的il-10变体分子、其融合蛋白或嵌合蛋白施用于患有基于脂质的疾病的受试者，所述基于脂质的疾病例如但不限于升高的胆固醇水平。
23.在各种实施方案中，本技术的il-10变体分子或其融合蛋白作为分离和纯化的蛋白质递送。递送可以是皮下推注的形式或多次显微注射到真皮和皮下组织的形式。在又一个实施方案中，il-10变体分子可以作为核酸载体递送，所述核酸载体包含编码il-10变体、其融合蛋白或嵌合蛋白的序列。核酸载体可以是质粒或携带病毒载体的病毒颗粒。在一个实施方案中，il-10变体分子可以通过本领域技术人员公知的遗传医学技术递送给受试者。
24.在其他实施方案中，il-10变体分子也可以作为组合疗法方案的一部分施用。在一个实施方案中，il-10变体分子可以例如与双特异性t细胞接合剂(bites)组合施用，bites是目前可用于治疗癌症、ibd、克罗恩病、nafld、nash和自体免疫性疾病的免疫疗法。
25.在另一个实施方案中，核酸载体是腺相关病毒(aav)载体，其具有一个或多个aav反向末端重复(itr)序列元件和控制元件，用于指导编码il-10变体分子的序列在靶细胞中的表达，其中aav载体可以作为质粒(“裸”dna)或包装在aav颗粒中施用。在另一个实施方案中，核酸载体是痘苗病毒载体。可以使用源自不同毒株的多种痘苗病毒载体，以引入本技术的变体il-10分子，例如wr毒株(atcc vr-119)、wyeth毒株(atcc vr-325)、lederle-chorioallantoic毒株(atcc vr-325)、cl毒株(atcc vr-117)等；所有这些毒株均可从美国典型培养物保藏中心(manassas,va)获得。
26.在另一个实施方案中，本文描述的任何il-10变体分子，包括但不限于聚乙二醇化的il-10变体分子，可以通过本文描述的或本领域公知的任何方法递送给受试者。
27.鉴于本文的公开内容，本领域技术人员将容易想到本技术主旨的这些和其他实施方案。
附图说明
28.图1显示了单体il-10分子的带状示意图(josephson等人,immunity,15,第35-46页)。以红色突出显示的部分表示位点i受体接触界面，绿色表示位点ii受体接触界面。
29.图2a-2c通过检查在供体1中il-1β(图2a)和tnfα(图2b)细胞因子的产生和通过检查ifnγ(图2c)的产生对t-细胞的刺激，比较了il-10和ebv il-10激活单核细胞/巨噬细胞(mθ)的能力。
30.图3a-3c通过检查在供体1中il-1β(图3a)和tnfα(图3b)细胞因子的产生和通过检查ifnγ(图3c)的产生对t-细胞的刺激，比较了il-10和ebv il-10激活单核细胞/巨噬细胞(mθ)的能力。
31.图4a-4b显示通过il-10或ebv il-10刺激后从t细胞诱导的ifnγ的量。
32.图5a-5c显示了5kda单聚乙二醇化和二聚乙二醇化的ebv-il-10的n-末端对mc/9细胞增殖的作用(图5a)，单核细胞/巨噬细胞(mθ)响应于lps的tnfα分泌(图5b)和t细胞响应于t细胞受体刺激的ifnγ分泌(图5c)。
33.图6a-6e显示了各种il-10变体分子和包含ebv-il-10的融合蛋白的具体氨基酸序列。
34.图7显示了融合蛋白的示意图，该融合蛋白包含与接头或间隔物(在这种情况下为scfv)缀合的il-10或il-10变体分子。该代表性示例显示了用于n-末端和c-末端缀合的il-10或il-10变体分子。
35.图8a-8c是各种il-10变体的示意图，例如在ebv il-10中制备的变体。图8a(dv05)是il-10变体，其在seq id no.3的氨基酸第31位包含单个点突变(v31l v31l)。图8b(dv06)是il-10变体，其在seq id no.3的氨基酸第75位包含单个点突变(a75i a75i)。图8c(dv07)是il-10变体，其在seq id no.3的氨基酸第31位和第75位包含两个点突变(v31l和a75i)。
36.图8d分析了单核细胞/巨噬细胞对各种形式的il-10的反应，包括野生型人il-10、ebv-il-10、dv05、dv06和dv07。所有形式(包括il-10变体
‑‑‑
dv05、dv06、dv0)都抑制响应于lps的tnfα分泌反应。
37.图8e分析了t细胞对各种形式的il-10的反应
‑‑‑
野生型人il-10、ebv il-10、dv05、dv06和dv07
‑‑‑
并非所有形式都诱导ifn-γ。
38.图9a-9f是il-10融合蛋白/免疫缀合物/双抗体构建体的各种构型的示意图。图9(a)-(c)代表融合蛋白复合物(即双抗体)，其中每个融合蛋白包含从两个不同的抗体获得的vh和vl区，其通过羧基末端接头或氨基末端接头与il-10单体(也可以被il-10变体分子取代)连接，其中(a)单个突变——例如氨基酸第31位——影响il-10受体结合；(b)单个突变——例如氨基酸第75位——影响il-10受体结合，和(c)两个突变——例如氨基酸第31位和第75位——影响il-10受体结合。图9(d)-(f)代表融合蛋白复合物(即微型抗体)，其中每个融合蛋白包含从一个抗体获得的单个vh和vl区，其通过羧基末端接头或氨基末端接头与il-10单体(也可以被il-10变体分子取代)连接，其中(d)单个突变——例如氨基酸第31位——影响il-10受体结合；(e)单个突变——例如氨基酸第75位——影响il-10受体结合，和(f)两个突变——例如氨基酸第31位和第75位——影响il-10受体结合。
39.图10a-10f是il-10融合蛋白/免疫缀合物/双抗体构建体的各种构型的示意图。图10(a)-(c)代表单个融合蛋白(即微型抗体)，其中il-10的单体(也可以被il-10变体分子取代)各自通过羧基末端接头或氨基末端接头与来自相同抗体的vh或vl连接，并且所述vh和vl连接在一起。il-10的单体包含(a)单个突变——例如氨基酸第31位——影响il-10受体结合；(b)单个突变——例如氨基酸第75位——影响il-10受体结合,和(c)两个突变——例如氨基酸第31位和第75位——影响il-10受体结合。图10(d)-(f)代表单个融合蛋白，其中il-10的单体(也可以被il-10变体分子取代)连接在一起，并且每个il-10单体进一步通过羧基末端接头或氨基末端接头与从一种抗体获得的单个vh或vl区连接。il-10单体包含(d)单个突变——例如氨基酸第31位——影响il-10受体结合；(e)单个突变——例如氨基酸第75位——影响il-10受体结合,和(f)两个突变——例如氨基酸第31位和第75位——影响il-10受体结合。
40.图11显示了使用包含dv07突变的双抗体(diabody)体内降低肿瘤体积。在第3天以
单剂量施用制剂缓冲液(1x磷酸盐缓冲盐水；“对照”)和dv07双抗体(一种融合蛋白复合物，其包含成熟蛋白的ebv il-10变体(具有v31l v31l和a75i a75i)和来自抗cd3α和抗egfr的可变结构域，这些vh/vl对均不与小鼠靶标结合)。对于dv07双抗体，测试了1mg/kg和0.4mg/kg的剂量浓度。
41.图12显示了针对已发表的il-10变体(菱形)、野生型il-10(圆圈)和称为dhivdebo:dv07的dv07双抗体的替代形式(菱形；融合蛋白复合物，包含具有v31l和a75i突变的ebv il-10变体以及来自抗hiv和抗埃博拉病毒的可变结构域(这些vh/vl对均不与小鼠蛋白结合)，其中双抗体具有图9(c)示意性代表的结构))的体外t细胞反应。
42.图13a比较了使用不同形式的双抗体形式的具有v31l和a75i突变的ebv il-10变体分子，将lps暴露于单核细胞/巨噬细胞所诱导的tnfα的抑制。“wt”代表人il-10；“ebv”是ebv il-10；“dcd3degfr:dv05”是双抗体，其包含与包含v31l突变的ebv il-10变体连接的来自抗cd3抗体和抗egfr抗体的vh和vl区；“dcd3degfr:dv07”双抗体，其包含与包含v31l和a75i突变的ebv il-10变体连接的来自抗cd3抗体和抗egfr抗体的vh和vl区；“dhivdebo:dv07”是双抗体，其包含与包含v31l和a75i突变的ebv il-10变体连接的来自抗hiv抗体和抗埃博拉抗体的vh和vl区。
43.图13b在反应测定法中比较了使用人il-10(“wt”)ebv il-10(“ebv”)与包含具有v31l和a75i突变的ebv il-10变体分子和来自不同抗体的vh和vl区的各种双抗体形式，在t细胞中的ifnγ分泌。dhivdegfr:dv07形式是具有v31l和a75i取代的ebv il-10变体双抗体，包含来自抗hiv和抗egfr的可变区。dhivdebo:dv07形式是具有v31l和a75i突变的ebv il-10变体双抗体，包含来自抗hiv和抗埃博拉的可变区。
44.图14a-14b在从两个供体分离的单核细胞/巨噬细胞(图14a)和t细胞(图14b)上比较了两种形式的ebv il-10变体双抗体：dh:dv07和dhde:dv07。dhdv07形式是具有v31l和a75i取代的ebv il-10变体双抗体，包含来自抗hiv和抗egfr的可变区。dhde:dv07形式是具有v31l和a75i取代的ebv il-10变体双抗体，包含来自抗hiv和抗埃博拉的可变区。图14a使用人il-10(“wt”)、dh:dv07和dhde:dv07在分离的单核细胞/巨噬细胞中比较了lps诱导的tnfα抑制。图14b比较了响应于人il-10(“wt”)、ebv il-10、dh:dv07和dhde:dv07，在分离的t细胞中ifnγ的分泌。
45.图15在mc/9肥大细胞上直接比较各种形式的ebv-10变体双抗体形式。该测定法比较了人il-10、ebv il-10、d:dv05(具有v31l突变的ebv il-10，其包含来自抗cd3α和抗egfr的可变区)、d:dv06(具有a75i突变的ebvil-10，其包含来自抗cd3α和抗egfr的可变区)、具有v31l和a75i突变的d:dv07，其包含来自抗cd3α和抗egfr的可变区)、和dhivdebo:dv07(具有v31l和a75i取代的ebv il-10变体双抗体，其包含来自抗hiv和抗埃博拉的可变区)。
46.图16a-16c是体内肿瘤研究的结果，使用了d:dv07(具有v31l和a75i突变，包含来自抗cd3α和抗egfr的可变区)。在施用给药制剂缓冲液(“对照”)、0.4mg/kg每周3次(q3w)、0.2mg/kg每周3次(q3w)、0.2mg/kg隔两天(qd)、0.1mg/kg隔两天(qd)后，评估体内肿瘤体积。
47.图17a-17b是大分子量(大)和小分子量(小)的两种il-10变体融合蛋白形式的体内研究结果，分别对应于图9c和9f的示意图。il-10变体包含v31l和a75i突变。这些结果测试了没有靶向能力的il-10融合蛋白对减小肿瘤大小的影响。融合蛋白的vh和vl区是非靶
向序列，来自抗hiv和抗埃博拉(大)或抗埃博拉(小)。图17a是非靶向小形式的给药研究，其中给药5天，间隔两天，与聚乙二醇化il-10(每天0.75mg/kg)比较。图17b是非靶向小(1mg/kg、0.5mg/kg、0.25mg/kg)和大(0.2mg/kg)形式的给药研究，其中每周给药三次，与聚乙二醇化重组人il-10(每天0.75mg/kg)比较。
48.图18a-18c是大和小两种il-10变体融合蛋白形式的体内研究结果，分别对应于图9c和9f的示意图。这些结果测试了具有靶向能力的il-10融合蛋白对减小肿瘤大小的影响。il-10变体包含v31l和a75i突变。在大形式中，融合蛋白的一组vh和vl区来自抗egfr抗体，而另一组vh和vl来自抗埃博拉抗体。小形式包括仅来自抗egfr抗体的vh和vl。图18a是每日给药靶向il-10融合蛋白大形式(0.25mg/kg)、小形式(0.25mg/kg)和非靶向il-10融合蛋白小形式(0.25mg/kg)与聚乙二醇化重组人il-10(0.75mg/kg)相比的研究结果。图18b是每周三次给药大形式靶向il-10融合蛋白(每天1mg/kg、0.25mg/kg和0.25mg/kg)与大形式非靶向il-10融合蛋白(dhde：dv07，0.2mg/kg)和聚乙二醇化il-10(每天0.75mg/kg)的研究结果。图18c是每周三次给药小形式靶向il-10融合蛋白(1mg/kg、0.25mg/kg)与小形式非靶向il-10融合蛋白(debo:dv07，1mg/kg)和聚乙二醇化il-10(每天0.75mg/kg)的研究结果。
49.图19a-19b是使用双抗体的体内胆固醇研究的结果，所述双抗体具有包含v31l突变的ebv il-10变体，包含来自抗cd3α和抗egfr的可变区。
50.图20a-20b是两种il-10变体融合蛋白在巨噬细胞和t细胞上的体外比较研究的结果。该测定法检查了两种形式的dv06融合蛋白与人il-10相比的体外有效性。图20a是单核细胞/巨噬细胞测定法，其使用dhivdebo:dv06(seq id no：26和27)和dmadcamdebo:dv06(seq id no:41和42)。图20b是如通过ifnγ测量的t细胞反应测定法，其中使用dhivdebo:dv06(seq id no:26和27)和dmadcamdebo:dv06(seq id no:41和42)。
51.图21a-21d是ebv il-10氨基酸序列。图21a是ebv il-10。图21b是包含v31l取代的dv05。图21c是包含a75i取代的dv06。图21d是包含v31l和a75i取代的dv07。
52.各种优选实施方案的详细描述
53.在详细描述各种实施方案应用之前，应当理解，该应用不限于特定的制剂或工艺参数，因此当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述各种实施方案的目的，并不旨在进行限制。
54.尽管在各种所述实施方案的实践中可以使用与本文所述的那些相似或等同的多种方法和材料，但本文描述了优选的材料和方法。
55.除非另有说明，本文所述的实施方案采用本领域技术人员熟知的分子生物学、生物化学、药理学、化学和免疫学的常规方法和技术。许多用于设计和制造il-10变体的通用技术，包括但不限于il-10的人、cmv和/或ebv形式，以及用于测试il-10变体的测定法，都是众所周知的方法，并且在本领域中容易获得并详细描述了。参见，例如sambrook等人,molecular cloning:alaboratory manual(第2版,1989)；methods in enzymology(s.colowick和n.kaplan编辑,academic press,inc.)；handbook of experimental immunology,第i-iv卷(d.m.weir和c.c.blackwell编辑,blackwell scientific publications)；a.l.lehninger,biochemistry(worth publishers,inc.,current addition)。基于n-末端醛的聚乙二醇化化学也是本领域公知的。
56.以下术语将用于描述本文讨论的各种实施例，并且旨在如下所示定义。
57.如本文在描述各种实施方案中所使用，单数形式一(a)、一种(an)和该(the)包括复数指代，除非上下文另外明确指出。
58.术语“大约”是指与指定数字或数字范围之间偏差0.0001-5％。在一个实施方案中，术语“大约”是指与指定数字或数字范围之间偏差1-10％。在一个实施方案中，术语“大约”是指与指定数字或数字范围偏差高达25％。在更具体的实施方案中，术语“大约”是指与野生型序列相比，在核苷酸序列同源性或氨基酸序列同源性方面有1-25％的差异。
59.术语“白细胞介素-10”或“il-10”是指包含两个亚基非共价连接形成同源二聚体的蛋白质，其中il-10是两个六螺旋束(螺旋a-f)的插入二聚体。如本文所用，除非另有说明，否则“白细胞介素-10”和“il-10”可以指人il-10(“hil-10”；genbank登录号np_000563；或美国专利号6,217,857)蛋白(seq id no:1)或核酸(seq id no:2)；小鼠il-10(“mil-10”；genbank登录号:m37897；或美国专利号6,217,857)蛋白(seq id no:7)或核酸(seq id no:8)；或病毒il-10(“vil-10”)。病毒il-10同源物可来自ebv或cmv(分别为genbank登录号nc_007605和dq367962)。术语ebv-il10是指il-10蛋白的ebv同源物(seq id no:3)或核酸(seq id no:4)。术语cmv-il10是指il-10蛋白的cmv同源物(seq id no:5)或核酸(seq id no:6)。如本文所用，术语单体il-10是指当非共价连接时形成il-10或变体il-10的同源二聚体的il-10或变体il-10的各亚基。术语“野生型”、“wt”和“天然”在本文中可互换使用，指通常在自然界中发现的所讨论特定il-10的来源物种的蛋白序列(例如il-10、cmv-il10或ebv-il10)。例如，术语“野生型”或“天然”ebv-il10因此对应于自然界中最常发现的氨基酸序列。
60.术语“衍生”、“来源”、“衍生自”或“来源自”在本文中用于鉴定分子的原始来源，例如il-10分子的病毒形式，但并不意味着限制制备、制造、制造或生产分子的方法。这将包括以下方法，例如但不限于化学或重组方法。
61.术语“衍生物”旨在包括感兴趣的参考分子或其类似物的任何合适的修饰，例如硫酸化、乙酰化、糖基化、磷酸化、聚合物缀合(例如与聚乙二醇)、hesylation或其他外源部分的添加，只要保留参考分子或变体的所需生物活性(例如，抗炎和/或无t细胞刺激)。
62.术语“变体”、“类似物”和“突变蛋白”是指参考分子的生物活性衍生物，其保留了所需的活性，例如抗炎活性。通常，在涉及多肽时术语“变体”、“变体”、“类似物”和“突变蛋白”是指具有天然多肽序列和结构的一种或多种化合物，相对于天然分子其具有一个或多个氨基酸添加、取代(本质上是保守的)和/或缺失。因此，术语“il-10变体”、“变体il-10”、“il-10变体分子”及其语法变形和复数形式都旨在是指与野生型il-10在序列同一性或同源性方面相差1-25％的il-10氨基酸(或核酸)序列的等同术语。因此，例如，ebv il-10变体分子是一种与野生型ebv il-10相比不同之处在于具有一个或多个氨基酸(或编码该氨基酸的核苷酸序列)添加、取代和/或缺失的分子。因此，在一种形式中，ebv il-10变体是一种与seq id no.:3的野生型序列相比不同之处在于具有约1％至25％序列同源性差异的分子，相当于约1-42个氨基酸差异。
63.术语“融合蛋白”是指两种或更多种蛋白质或多肽的组合或缀合，这产生通常不是天然存在的新的蛋白质排列。融合蛋白由两种或更多种蛋白质或多肽共价连接产生。构成融合蛋白的两种或更多种蛋白质可以从氨基末端到羧基末端以任何构型排列。因此，例如，一种蛋白质的羧基末端可以与另一种蛋白质的羧基末端或氨基末端共价连接。示例性融合
蛋白可以包括将单体il-10或单体变体il-10分子与一个或多个抗体可变结构域组合。融合蛋白还可以形成二聚体或与其他相同类型的融合蛋白结合，从而形成融合蛋白复合物。与未复合的融合蛋白相比，融合蛋白的复合在某些情况下激活或增加融合蛋白的功能。例如，具有一个或多个抗体可变结构域的单体il-10或单体变体il-10分子可能具有有限的或降低的与il-10受体结合的能力；然而，当融合蛋白复合时，单体形式的il-10或变体il-10分子变成同源二聚体，可变结构域结合成功能性双抗体。
[0064]“功能变体”是il-10变体分子，其包括不破坏参考分子生物活性的修饰(例如，添加、取代和/或缺失)。这些变体可以与如下定义的参考分子“同源”。一般而言，此类类似物的氨基酸序列将与参考序列具有高度的序列同源性，例如当两个序列比对时，氨基酸序列同源性超过50％，通常超过60％-70％，甚至更特别地超过80％-85％或更多，例如至少90％-95％或更多。通常，类似物将包括相同数量的氨基酸，但将包括取代。功能变体将保留与天然分子相比增强的、减弱的或基本相同的生物活性。具体地，术语“变体”il-10分子可与术语“工程化的”il-10分子或il-10变体分子或il-10变体互换，是指il-10分子或蛋白质，其包括对il-10受体结合结构域和/或负责在il-10分子或蛋白质中形成结构域间角度或同源二聚体间角度的区域进行的一个或两个修饰。变体il-10“融合蛋白”或“双抗体”或“融合”通常是指形成融合蛋白(或融合蛋白复合物)，其包含变体il-10(单体形式或同源二聚体形式)和至少一种其他蛋白质。如本文所用，变体il-10“或其融合蛋白”在本说明书中通篇用于描述此类变体il-10融合蛋白。
[0065]“类似物”可包括本质上保守的取代。例如，保守取代可包括同类取代，例如但不限于(1)天冬氨酸和谷氨酸之间的酸性取代；(2)赖氨酸、精氨酸或组氨酸中任一种之间的碱性取代；(3)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸中的任一种之间的非极性取代；(4)甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸中的任何一种之间的不带电荷的极性取代。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被归类为芳香族氨基酸。也可以分别用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸；或者用结构相关的氨基酸进行类似氨基酸的保守取代，只要需要的特定生物活性是完整的。例如，感兴趣的多肽可以包括多达约1-10个保守或非保守氨基酸取代，或甚至多达约15-25个保守或非保守氨基酸取代，或1-50之间的任何整数，只要分子所需的功能保持完整。本领域技术人员可以容易地确定本领域公知的能够耐受变化的感兴趣分子的区域。
[0066]“突变蛋白”还包括具有一个或多个氨基酸样分子的多肽，所述氨基酸样分子包括但不限于：仅包含氨基和/或亚氨基分子的化合物、包含一个或多个氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸等)的多肽、具有取代键的多肽，以及本领域已知的其他修饰，天然存在的和非天然存在的(例如，合成的)、环化的、分支的分子等。优选地，类似物或突变蛋白将保留与天然分子相比增强的、减弱的或基本相同的生物活性。制备多肽类似物和突变蛋白质的方法是本领域众所周知的。
[0067]
术语“同源物”、“同源性”、“同源的”或“基本上同源的”是指至少两个多核苷酸序列或至少两个多肽序列之间的同一性百分比。当序列在定义的分子长度上表现出至少约50％，优选至少约75％，更优选至少约80％-85％，优选至少约90％，最优选至少约95％-98％的序列同一性时，序列彼此是同源的。
[0068]
术语“序列同一性”是指精确的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的对应关系。序列同一性的范围可以从100％序列同一性到50％序列同一性。可以使用多种方法来确定百分比序列同一性，包括但不限于通过比对序列、计数两个比对序列之间的精确匹配数、除以参考序列的长度、然后将结果乘以100，来直接比较两个分子间的序列信息(参考序列和与参考序列相比具有未知百分比同一性的序列)。可以使用容易获得的计算机程序来帮助确定百分比同一性。
[0069]
术语“片段”旨在包括全长氨基酸或多核苷酸序列和/或结构的部分分子。多肽的片段可以包括，例如天然多肽的c-末端缺失、n-末端缺失和/或内部缺失。特定蛋白质的活性或功能片段通常包括全长分子的至少约5-10个连续氨基酸残基，优选全长分子的至少约15-25个连续氨基酸残基，最优选全长分子的至少约20-50个或更多个连续氨基酸残基，或5个氨基酸与全长序列之间的任何整数，只要所讨论的片段保留生物活性，例如抗炎活性。当涉及抗体时，抗体片段是指包含完整抗体的抗原结合位点或可变区(重链和/或轻链区)的完整抗体的一部分。这些抗体片段可包括，例如，fab、fab'、fab'-sh、(fab')2、fv片段、双抗体、单链fv(scfv)、具有一个轻链可变结构域的单链多肽、具有轻链可变结构域或重链可变结构域的三个cdr的片段。
[0070]
术语“基本上纯化的”通常是指物质的分离，使得该物质占其所在样品的大部分百分比。基本上纯化的组分占样品的50％，优选80％-85％，更优选90-95％。同样，当提及多肽或多核苷酸时，术语“分离的”是指所指分子与自然界中发现该分子的整个生物体是分开的和离散的，或者存在于基本上不存在同类型的其他生物大分子的情况下。
[0071]
术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，是指脊椎动物，优选哺乳动物。哺乳动物包括但不限于鼠、啮齿动物、猿猴、人、农场动物、运动动物和某些宠物。
[0072]
术语“施用”包括允许应用的活性成分发挥其预期功能的施用途径。
[0073]
当涉及，例如施用本文所述的ebv-il-10变体或其融合蛋白时，“治疗有效量”是指足够量的ebv-il-10变体或其融合蛋白以促进某些生物活性。这些生物活性可能包括，例如，抑制髓样细胞功能、增强kupffer细胞活性和/或缺乏对cd8

t细胞的作用或增强cd8

t细胞活性以及阻断肥大细胞上调fc受体或防止脱颗粒。因此，“有效量”将改善或预防医学病症的症状或体征。有效量还指足以允许或促进诊断的量。
[0074]
术语“治疗”或“治疗”是指减少疾病或病症影响的方法。治疗也可以指减少疾病或病症本身的根本原因而不仅仅是症状的方法。治疗可以是自然水平的任何降低，并且可以是但不限于疾病、病症或疾病或病症的症状的完全消失。
[0075]“化疗”剂是可用于治疗癌症的化合物。化疗剂的示例包括烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺(cytoxan
tm
)；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，例如苯并多巴、碳醌、美托多巴和乌多巴等；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥(chiorambucil)、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素c、卡里奇霉素、卡柔比星(carabicin)、洋
红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素d、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、去氧阿霉素、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、培弗来霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢物，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-fu；雄激素，例如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝曲布辛(bestrabucil)；比生群；伊达曲仙(edatraxate)；德弗法明(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；伊弗尼辛(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星；足叶草酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2
”‑
三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；瓜西托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(ara-c)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类，例如紫杉醇(bristol-myers squibb oncology,princeton,n.j.)和多西他赛(taxotere
tm
,rhone-poulenc rorer,antony,france)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；疏嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；硫酸长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素c；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；roche,switzerland；伊班膦酸钠；cpt11；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；视黄酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨；以及以上任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那莫昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮和托瑞米芬(fareston)；以及抗雄激素剂，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及以上任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0076]
本技术中使用的术语“缀合物”、“缀合的”、“缀合”或“缀合”是指分子的两个或更多个部分连接在一起。连接通过共价键(例如肽键)发生。
[0077]
il-10变体蛋白
[0078]
本技术的il-10变体分子包括对任何形式的il-10的修饰。对il-10分子的这些修饰包括在涉及il-10受体结合的区域和/或结构域中和/或涉及在il-10分子中赋予结构域间或同源二聚体间角度的那些区域和/或结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代。可用于构建本技术的变体il-10分子的示例性il-10序列包括但不限于来自epstein-barr病毒(“ebv”；参见,例如moore等人,science(1990)248:1230-1234；hsu等人,science(1990)250:830-832；suzuki等人,j.exp.med.(1995)182:477-486)、巨细胞病毒(“cmv”；参见，例如lockridge等人,virol.(2000)268:272-280；kotenko等人,proc.natl.acad.sci.usa(2000)97:1695-1700)、和马疱疹病毒(参见，例如rode等人,virus genes(1993)7:111-116)、orf病毒(参见，例如imlach等人,j.gen.virol.(2002)83:
1049-1058和fleming等人,virus genes(2000)21:85-95)的同源物。其他代表性il-10序列包括ncbi登录号nm010548、af307012、m37897、m84340(小鼠序列)；u38200(马)；u39569、af060520(猫序列)；u00799(牛)；u11421、z29362(绵羊序列)；l26031、l26029(猕猴序列)；af294758(猴子)；u33843(犬)；af088887、af068058(兔序列)；af012909、af120030(土拨鼠序列)；af026277(负鼠)；af097510(豚鼠)；u11767(鹿)；l37781(沙鼠)；ab107649(美洲驼和骆驼)中描述的序列。
[0079]
在一个实施方案中，本文所述的il-10变体分子是通过修饰人(seq id no.:1)、cmv(seq id no.:5)、ebv(seq id no.:3)il-10序列、或小鼠(seq id no:7)的野生型蛋白获得的。各种il-10变体分子的代表性示例在seq id no.9-23中提供。
[0080]
相对于野生型il-10的修饰包括在负责(i)il-10受体结合和/或(ii)形成il-10分子的结构域间或同源二聚体间角度的区域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代。
[0081]
变体il-10分子：il-10受体结合区域
[0082]
负责受体结合的区域包括位于直接参与或负责il-10与il-10受体1(il10r1)和/或il-10受体2(il 10r2)结合的区域内的任何氨基酸部分。这些区域可以包括，例如本领域先前讨论和描绘的il-10分子的不连续部分(参见，例如，yoon 2005；josephson 2001)。例如，在本技术中可预期对任何区域的修饰，例如但不于，负责形成与il-10结合il-10受体相关的接触点和裂缝的螺旋a、螺旋f和ab环。在一个优选的实施方案中，对受体结合结构域的修饰(例如，添加、缺失和/或取代)包括seq id no.3的氨基酸31和/或75。在一个特别优选的实施方案中，修饰包括将seq id no.3中第31位的缬氨酸取代为亮氨酸(v31l，本文称为“dv05”)、将seq id no.3中第75位的丙氨酸取代为异亮氨酸(a75i，本文称为“dv06”)、或包括seq id no.3中的v31l和a75i取代(本文称为“dv07”)。在一个方面，dv05是seq id no：55，dv06是seq id no:57，dv07是seq id no：59。
[0083]
在一个实施方案中，对受体结合结构域的修饰包括josephson等人(immunity，2001，15，第35-46页，图1)讨论的任何一个或多个位点ia和/或位点ib界面接触点。在本技术的一个实施方案中，位点ia界面接触点包括位于螺旋f的弯曲处和ab环中的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，位点ib界面接触点包括位于螺旋a的n-末端和螺旋f的c-末端的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，位于il-10上负责受体结合的任何一个或多个氨基酸包括螺旋a内的1-10个氨基酸和ab环内的1-7个氨基酸中的任何一个或多个。在另一个实施方案中，受体结合区可以包括以下氨基酸或以其为中心的1-10个氨基酸的一个或多个修饰，其中氨基酸是glu-142、lys-138、asp-144、gln-38、ser-141、asp-44、gln-42、gln-38、arg-27、glu-151、arg-24、pro-20、ile-158或其任何组合。
[0084]
在一个方面，对受体结合结构域的修饰包括josephson等人(immunity，2001，15，第35-46页，图1)讨论的任何一个或多个位点iia和/或位点iib界面接触点。在本技术的一个实施方案中，位点iia界面接触点包括位于de环中的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，受体结合区可以包括以下氨基酸或以其为中心的1-10个氨基酸的一个或多个修饰，其中氨基酸是ser-11、thr-13、asn-18、arg-104、arg-107或其任何组合。在一个实施方案中，变体il-10分子将包含1-100个(或其中的任何整数)影响受体结合结构域的氨基酸添加、缺失和/或取代，其中此类添加、缺失和/或取代增加或降低变体il-10分子与il-10受体的结合亲和力。
[0085]
变体il-10分子：结构域间角度的修饰
[0086]
负责形成il-10分子的结构域间(或同源二聚体间，可互换使用)角度的区域包括位于直接参与或负责形成il-10同源二聚体特定结构域间角度的区域内的任何氨基酸部分。当il-10的两个单体单元以反向平行方式交织时，野生型il-10形成“l-形”二聚体。据报道，所得的人il-10和ebv-il10的结构域间角度分别约为89度和97度。为了调整il-10受体的信号传导，在一个实施方案中，本技术寻求修饰负责在每个单体内形成l-形二聚体的de环内、螺旋d或螺旋e的部分的氨基酸，其负责形成结构域间角度。在另一个实施方案中，负责结构域间角度的区域包括位于il-10蛋白的螺旋d和螺旋e之间的约12个氨基酸的接头区域。与人il-10或ebv-il 10相比，通过添加、缺失或取代进行的修饰导致il-10结构域间角度的受限或松弛。当修饰单体il-10分子，导致同源二聚化时il-10结构域间角度受限/紧密/闭合或松弛/松散/开放时，修饰的il-10分子将产生变体il-10分子，该分子具有改变的结构域间角度，与其同源受体(il-10受体)接合并调节该同源受体。在另一个实施方案中，取代包括在位于ebv-il10的d螺旋和e螺旋之间和/或位于c螺旋和d螺旋之间的氨基酸区段内引入脯氨酸。
[0087]
因此，在一个实施方案中，当与野生型il-10比较时，变体il-10分子将包含一个或多个添加、缺失和/或取代，其表现出改变的分子间角度或改变的结构域间角度。改变的分子间角度或改变的结构域间角度可以与相同或不同的变体il-10分子二聚化以产生变体il-10分子，与野生型il-10分子比较时，所述变体il-10分子以不同的接合角度与il-10受体接合。变体il-10分子的不同接合角度导致能够调节或“调整”il-10受体的信号传导，以激活或抑制炎症和/或免疫反应。在一个优选的实施方案中，变体il-10分子是ebv-il10。在另一个优选的实施方案中，变体il-10分子使用ebv-il10分子作为修饰的基础。在又一个实施方案中，变体il-10分子是杂合分子，其从其他il-10分子(例如但不限于人il-10、小鼠il-10和/或cmv-il10)取得部分和结构域。
[0088]
在另一个优选的实施方案中，变体il-10分子产生松弛的结构域间角度，其将抑制炎性细胞(髓系细胞)反应，并且不驱动淋巴细胞(如t细胞)的激活。当与受体结合结构域的修饰相结合时，优选当与导致受体亲和力降低或不变的修饰相结合时，具有松弛的结构域间角度的变体il-10分子将有效抑制髓样细胞(单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞，kupffer细胞)响应促炎刺激的细胞因子分泌。变体il-10分子的这种构型可用于，例如治疗炎性疾病，例如但不限于ibd、克罗恩病、牛皮癣、类风湿性关节炎、nafld和nash。
[0089]
在另一个优选的实施方案中，变体il-10分子产生受限的结构域间角度，将增强免疫细胞例如t细胞的激活。当与受体结合结构域的修饰相结合时，优选当与导致更高的受体亲和力的修饰相结合时，具有受限的结构域间角度的变体il-10分子将有效增强例如cd8

t细胞、nk细胞和kupffer细胞清除。变体il-10分子的这种构型可用于例如治疗多种实体癌和血液癌，包括转移癌。
[0090]
负责形成结构域间角度的区域可以是位于il-10分子内的连续或不连续的部分。在一个实施方案中，il-10变体分子的结构域间角度将具有1-25度的度数变化，在另一个优选的实施方案中，度数变化为1-10度，在更优选的实施方案中，度数变化为1-5度，在最优选的实施方案中，度数变化小于5度。在一个实施方案中，变体il-10分子将包含影响结构域间
角度的1-100个(或其中的任何整数个)氨基酸添加、缺失和/或取代。
[0091]
在本技术的一个实施方案中，基于计算机建模的帮助，预测对il-10受体结合和/或结构域间角度责任最大的一个或多个区域，来设计和创建变体il-10分子。基于计算机的建模将有助于提供更快和更有效的方法来预测这些区域，对其进行修饰将最有益于受体结合结构域和/或结构域间角度。
[0092]
在另一个实施方案中，本技术的分子包括变体il-10分子的衍生物。这些可能包括对变体分子的修饰，以包括增加变体分子的大小、半衰期和生物利用度的实体。
[0093]
变体il-10分子：peg修饰
[0094]
在一个实施方案中，变体il-10分子可包括添加聚乙二醇(peg)。聚乙二醇化的il-10变体包括连接至少一个peg分子。不受任何特定理论的束缚，peg与il-10变体的连接可防止蛋白质水解、降低免疫原性、促进il-10变体在受体上的不稳定以维持其对髓样细胞的抑制作用并防止t细胞的激活。
[0095]
在其最常见的形式中，peg是线性或分支的聚醚，以羟基终止，其具有一般结构：
[0096]
ho—(ch2ch2o)n—ch2ch2—oh
[0097]
将peg与本技术的变体il-10分子偶联的方法遵循本领域中已经建立的那些技术/方案。例如，缀合或偶联peg需要通过制备在一个或两个末端具有官能团的peg的衍生物来激活peg。最常见的peg缀合蛋白的途径是用适合与赖氨酸和n-末端氨基酸基团反应的官能团激活peg。特别是，参与peg与多肽偶联的最常见反应基团是赖氨酸的α或ε氨基。
[0098]
聚乙二醇化接头与变体il-10分子的反应导致peg部分主要在以下位点连接：蛋白质n-末端的α氨基、赖氨酸残基侧链上的ε氨基和组氨酸残基侧链上的咪唑基团。在一些实施方案中，因为变体il-10分子是具有单个α和多个ε氨基和咪唑基团的重组蛋白，根据接头化学可以产生大量位置异构体。
[0099]
两种广泛使用的第一代激活单甲氧基peg(mpeg)是琥珀酰亚胺碳酸酯peg(sc-peg；参见，例如zalipsky,等人(1992)biotechnol.appl.biochem15:100-114；和miron and wilcheck(1993)bioconjug.chem.4:568-569)和苯并三唑碳酸酯peg(btc-peg；参见，例如dolence,等人，美国专利号5,650,234)，其优先与赖氨酸残基反应形成氨基甲酸酯键，但也已知与组氨酸和酪氨酸残基反应。已表明，与ifnα上组氨酸残基的连接是水解不稳定的咪唑氨基甲酸酯键(参见，例如，lee和mcnemar，美国专利号5,985,263，其通过引用整体并入)。
[0100]
已经设计了第二代聚乙二醇化技术，以避免这些不稳定的键以及在残基反应性中缺乏选择性。peg-醛接头的使用通过还原胺化作用靶向多肽和/或蛋白质亚基的n-末端上的单个位点。可以使用不同类型的接头和ph对il-10进行聚乙二醇化，以获得各种形式的聚乙二醇化分子(参见，例如，美国专利号5,252,714、美国专利号5,643,575、美国专利号5,919,455、美国专利号5,932,462、美国专利号5,985,263、美国专利号7,052,686,其通过引用整体并入)。
[0101]
il-10模拟分子
[0102]
在另一个实施方案中，本技术包括反映il-10变体分子的生物学功能的模拟分子。这些模拟物包括但不限于肽、小分子、修饰的激素和抗体，其具有的结构和/或功能与变体il-10分子所产生的结构和/或功能相同或基本相同。il-10模拟分子可以构成基础用于修
饰，以重复或反映il-10变体分子，所述il-10模拟分子包括在us20080139478、us20120238505和/或us20150218222中描述的那些模拟分子，所有这些文献都通过引用整体并入。
[0103]
il-10杂合分子和il-10融合蛋白
[0104]
在另一个实施方案中，本技术包括作为杂合分子的il-10变体分子，其由从人il-10、ebv-il10和/或cmv-il10获得的部分组成。例如，人il-10、ebv-il10和/或cmv-il10各自中的不同结构域可以组合在一起以产生杂合分子，使得该组合采用受体结合结构域和/或负责il-10中的结构域间角度的结构域的全部或部分。
[0105]
在另一个实施方案中，变体il-10分子是工程化的融合蛋白的一部分。接头或间隔物可以是随机氨基酸序列(例如，ssggggs(seq id no.:30,ggggsggggsggggs(seq id no.:31)或ssggggsggggsggggs(seq id no.54))，抗体的恒定区、scfv或双抗体。恒定区可源自但不限于iggl、igg2、igg3、igg4、iga、igm、igd或ige。接头或间隔物可以优选是恒定重链(ch)区1、ch2或ch3。在更优选的实施方案中，间隔物的接头是seq id no：30和/或31的随机氨基酸序列。在另一方面，接头或间隔物还可包含至少两个链间二硫键。
[0106]
融合蛋白还可包含至少一个il-10或il-10变体分子的单体，其缀合在融合蛋白的n-末端、c-末端或两端。在另一个实施方案中，包含il-10或il-10变体的融合蛋白还可以包含至少一个细胞因子，其缀合在与il-10或变体il-10相对的末端，并且包括il-2、il-7、il-15、il-26、il-27、il-28、il-29、il-10、il-10变体分子、ifn-α、tgf-β、碱性-fgf、egf、pdgf、il-4、il-11、或il-13或其任何组合。在一些优选的实施方案中，融合蛋白包含在融合蛋白的n-末端缀合的两个il-10或il-10变体分子的单体形式、和在融合蛋白的c-末端缀合的两个il-10或il-10变体分子；融合蛋白包含在融合蛋白的n-末端缀合的两个il-10或il-10变体分子的单体形式、和在融合蛋白的c-末端缀合的至少一个il-2分子；融合蛋白包含在融合蛋白的n-末端缀合的两个il-10或il-10变体分子、和在融合蛋白的c-末端缀合的至少一个il-15分子。在另一个实施方案中，融合蛋白的c-末端可以具有至少两个不同的细胞因子，其选自il-2、il-7、il-15、il-26、il-27、il-28、il-29、il-10、il-10变体分子、ifn-α、tgf-β、碱性-fgf、egf、pdgf、il-4、il-11或il-13。
[0107]
在另一个实施方案中，融合蛋白如下制备：使用单链可变片段(scfv)、双抗体、fab或任何抗体片段作为基础支架，其上缀合il-10的一个或两个单体、il-10变体分子的一个或两个单体、il-2、il-7、il-15、il-26、il-27、il-28、il-29、ifn-α、tgf-β、碱性-fgf、egf、pdgf、il-4、il-11或il-13或其组合。
[0108]
在一个特别优选的实施方案中，融合蛋白包含至少一个可变区，其具有与il-10或il-10变体分子连接的可变重链(vh)和/或可变轻链(vl)。在该构型中，融合蛋白包含与抗体的至少一个可变区连接的il-10单体或变体il-10单体。在一个方面，该融合蛋白是线性连续的序列，其包含il-10单体或il-10单体变体分子，连接至vh，连接至vl，连接至il-10单体。抗体的可变区可以是可变重(vh)链区、可变轻(vl)链区或两者。第一融合蛋白包含具有线性连续构型的蛋白质序列，使得il-10单体或变体il-10单体缀合至可变区的(vh或vl或两者)羧基末端。第二融合蛋白可包含具有线性连续构型的蛋白质序列，使得il-10单体或变体il-10单体连接至可变区的(vh或vl或两者)氨基末端。上述第一融合蛋白的代表性示例可包括以下构型：
[0109]
a)
nh2
(ab1vl)
cooh-(接头)-nh2
(单il10)
cooh
[0110]
上述第二融合蛋白的代表性示例可包括以下构型：
[0111]
b)
nh2
(单il10)
cooh-(接头)-nh2
(ab1vh)
cooh
[0112]
第一(a)和第二(b)融合蛋白以反向平行的方式在一起形成功能性蛋白复合物，由此末端连接的il-10或变体il-10的单体形成功能性同源二聚体，可变区在一起能够形成功能性抗原结合位点(“abs”)(参见，例如图9(a)-(f))。
[0113]
在替代实施方案中，il-10单体或变体il-10单体可以与来自相同抗体或来自两个不同抗体的至少两个可变区缀合。在该构型中，至少两个可变区是vh和vl。这种构型的一个示例包括第一融合蛋白，其中第一抗体的vh区的线性连续蛋白序列在其羧基末端连接至第二抗体的vl区的氨基末端，随后连接至il-10单体或il-10变体分子单体的氨基末端。替代构型包括第二融合蛋白，其中单体il-10或il-10变体分子的单体的线性连续蛋白序列在其羧基末端连接至第二抗体的vh区的氨基末端，随后连接至第一抗体的vl区的氨基末端。上述第一融合蛋白的代表性示例可包括以下构型：
[0114]
a)
nh2
(ab
1-vh)
cooh-‑
(接头)-nh2
(ab2vl)
cooh-(接头)-nh2
(单il10)
cooh
[0115]
上述第二融合蛋白的代表性示例可包括以下构型：
[0116]
b)
nh2
(单il10)
cooh-(接头)-nh2
(ab2vh)
cooh-(接头)-nh2
(ab
1-vl)
cooh
[0117]
第一(a)和第二(b)融合蛋白以反向平行的方式在一起形成功能性蛋白质复合物，由此末端连接的il-10或变体il-10的单体形成功能性同源二聚体，可变区在一起能够形成abs(参见，例如图9(a)
–
(c))。
[0118]
在又一个实施方案中，融合蛋白包含融合在一起的两个il-10单体或两个变体il-10单体以及一个或多个vh和vl区。每个单体单独连接至抗体的一个或多个vh区和/或vl区。当在该融合蛋白构型中使用多于一个vh和/或vl区时，vh和vl区可以来自相同的抗体或来自至少两个不同的抗体。在该融合蛋白的一个特定构型中，vh或vl区连接至第一单体的氨基末端，然后该第一单体通过其羧基末端连接至第二单体的氨基末端，然后该第二单体连接至vl或vh的氨基末端。任选地，额外的vh或vl区可连接至氨基或羧基末端，其中vh或vl区可来自相同的抗体或不同的抗体。上述融合蛋白的代表性示例可包括以下构型(参见，例如图10(d)-(f))：
[0119]
nh2
(ab
1-vh)
cooh-‑
(接头)-nh2
(单il10)
cooh-(接头)-nh2
(单il10)
cooh-(接头)-nh2
(ab
1-vl)
cooh
[0120]
上述融合蛋白能够以允许il-10单体形成同源二聚体以及抗体的可变结构域(vh和vl)形成功能性abs的方式折叠。
[0121]
在另一个实施方案中，融合蛋白包含位于融合蛋白相对末端的两个il-10单体或两个变体il-10的单体，以及至少一个vh和vl区，其中vh和vl区连接在一起。在该构型中，vh和vl区融合在一起并且每个单体单独连接至第一抗体的vl区或vh区。在该构型中，il-10单体或变体il-10的单体各自单独地连接至第一抗体的vh或vl。上述融合蛋白的代表性示例可包括以下构型(参见，例如图10(a)-(c))：
[0122]
a)
nh2
(单il10)
cooh-(接头)-nh2
(ab
1-vh)
cooh-(接头)-nh2
(ab
1-vl)
cooh-(接头)-nh2
(单il10)
cooh
[0123]
b)
nh2
(单il10)
cooh-(接头)-nh2
(ab
1-vl)
cooh-(接头)-nh2
(ab
1-vh)
cooh-(接头)-nh2
(单
il10)
cooh
[0124]
il-10单体或变体il-10的单体可以通过接头序列与vh或vl序列连接。接头可以是羧基末端接头，其将可变链区(vh或vl)的羧基末端连接至il-10单体或单体il-10变体分子的氨基末端。或者，接头可以是氨基末端接头，由此将单体il-10或单体il-10变体分子的羧基末端连接至可变链区(vh或vl)的氨基末端。
[0125]
因此，在一种形式中，融合蛋白包含与来自至少两个不同抗体的两个可变区连接的单体il-10分子或变体il-10分子，其中所述两个可变区被构型为来自第一抗体的vh区与来自第二抗体的vl区连接，或来自第一抗体的vl与来自第二抗体的vh连接。根据这种形式的融合蛋白可以包含单体il-10分子或其变体，其包括至少一个增加或降低对il-10受体的亲和力的氨基酸取代。影响il-10受体结合的氨基酸取代可发生在人、cmv或ebv il-10中。氨基酸取代可以优选地在ebv il-10中，并且包括第31、75位或两者处的氨基酸取代。氨基酸取代可包括v31l或a75i取代或两者中的任何一个或多个。除了影响il-10受体结合亲和力的氨基酸取代之外，il-10变体还可包括影响结构域间角度的修饰。在另一个实施方案中，融合蛋白包含选自以下的构型：(a)第一抗体的vh区在其羧基末端连接至第二抗体的vl区的氨基末端，随后连接至il-10单体或其变体的羧基末端；或(b)il-10分子或其变体在其羧基末端连接至第二抗体vh区的氨基末端，随后连接至第一抗体的vl区的氨基末端。在一个优选的实施方案中，这些融合蛋白构型包括seq id no.：24-28、29和33-53的序列。这些融合蛋白序列能够形成复合物，其中il-10的单体或变体il-10的单体能够形成同源二聚体。这样的复合物可以包括和/或构型为双抗体复合物。
[0126]
在另一种形式中，融合蛋白可以制成免疫缀合物，其包含第一融合蛋白和第二融合蛋白，所述第一融合蛋白在其氨基末端包含第一抗体的重链可变区(vh)，其与第二抗体的轻链可变区(vl)连接，所述第二抗体的轻链可变区(vl)进一步与il-10单体连接；所述第二融合蛋白在其氨基末端包含il-10单体，其与第二抗体的vh连接，所述第二抗体的vh进一步与第一抗体的vl连接，其中所述第一和第二抗体的vh和vl结合成双抗体，并且所述il-10单体形成功能性二聚il-10分子。在另一个优选的实施方案中，免疫缀合物复合物包含第一融合蛋白和第二融合蛋白，所述第一融合蛋白在其氨基末端包含第一抗体的vh区和通过其氨基末端连接的单体il-10分子；所述第二融合蛋白在其氨基末端包含il-10单体，其与第一抗体的vl连接，其中第一抗体的vh区与第一抗体的vl区结合从而允许在每条肽链上的单体il-10分子形成功能性il-10二聚体。il-10的单体或变体il-10单体可以包括，如上所述，影响il-10受体结合和/或结构域间角度的氨基酸修饰。在另一个优选的实施方案中，免疫缀合物复合物包含第一融合蛋白和第二融合蛋白，所述第一融合蛋白在其氨基末端包含第一抗体的vh区，其与单体il-10分子连接；所述第二融合蛋白在其氨基末端包含il-10单体，其与第一抗体的vl连接，其中第一抗体的vh区与第一抗体的vl区结合从而允许在每条肽链上的单体il-10分子形成功能性il-10二聚体。在又一个实施方案中，免疫缀合物在其氨基末端包含第一il-10(或il-10变体分子)单体的单体，该单体与第一抗体的vh区连接，第一抗体的vh区连接至第一抗体的vl区，该第一抗体的vl区连接至第二il-10(或il-10变体分子)的单体，其中两个il-10单体能够结合在一起形成il-10的功能性二聚体。所描述的vh和vl区能够形成特异性靶向抗原(例如，受体、蛋白质、核酸等)的抗原结合位点。因此，存在在一起形成融合蛋白复合物的两条链：链1和链2，其产生功能性il-10(或il-10变体分子)同
源二聚体。代表性融合蛋白链(即链1和链2)包括以下：
[0127][0128][0129]
融合蛋白包含来自至少一种抗体的vh和vl对。vh和vl对作为支架发挥作用，il-10或其变体的单体可以连接在支架上，从而能够同源二聚化成功能性il-10分子。因此，本领域技术人员将理解，可基于正确的il-10或il-10变体蛋白二聚化和/或维持vh和vl靶向能力所需的适当物理属性，选择融合蛋白中使用的vh和vl支架。同样，技术人员也将理解，vh和vl对内的cdr区也可以被其他cdr区取代，以获得特异性靶向的融合蛋白。还设想如果融合蛋白质不旨在靶向任何特定抗原，则可选择vh和vl对作为不靶向任何特定抗原(或体内低丰度的抗原)的支架，例如来自抗hiv和/或抗埃博拉抗体的vh和vl对。融合蛋白可包含1-4个可变区。可变区可以来自相同的抗体或来自至少两种不同的抗体。抗体可变链可以从多种抗体(例如，靶向蛋白、细胞受体和/或肿瘤相关抗原等的那些抗体)获得或衍生。在另一个实施方案中，可变区从靶向与各种疾病(例如，癌症)相关的抗原或通常在健康受试者的血清中没有发现或很少发现的那些抗原的抗体获得，例如，可变区来自针对egfr、pdgfr、vegfr、her2neu、fgfr、gpc3或其他肿瘤相关抗原、madcam、icam、vcam或其他炎症相关细胞表面蛋白、hiv和/或埃博拉的抗体。因此，在一个实施方案中，例如，可变区获自或衍生自抗egfr、抗madcam、抗hiv(chan等人,j.virol,2018,92(18):e006411-19)、抗icam、抗vcam或抗埃博拉(美国公开申请2018/0180614，通过引用整体并入，尤其是表2、3和4中描述mab)抗体。在另一个实施方案中，可变区获自或衍生自能够将细胞因子(例如il-10)的浓度富集到特定靶区域以使得il-10能够引起其生物学效应的抗体。此类抗体可包括靶向某些患病区域中过表达或上调的受体或抗原的那些抗体，或包括在某些受影响区域中特异性表达的那些抗体。例如，可变区可来自对以下具有特异性的抗体：表皮生长因子受体(egfr)；cd52；各种免疫检查点靶标，例如但不限于pd-l1、pd-1、tim3、btla、lag3或ctla4；cd20；cd47；gd-2；her2；epcam；icam(icam-1、-2、-3、-4、-5)、vcam、fapα；5t4；trop2；edb-fn；tgfβtrap；madcam；β7整合素亚基；α4β7整合素；α4整合素sr-a1；sr-a3；sr-a4；sr-a5；sr-a6；sr-b；dsr-c1；sr-d1；sr-e1；sr-f1；sr-f2；sr-g；sr-h1；sr-h2；sr-i1；和sr-j1，仅举几例。il-10(例如人、cmv或ebv)或变体il-10分子(本文所述)的单体缀合至可变区(vh或vl)的氨基末
端或羧基末端，使得il-10或变体il-10分子能够彼此二聚化。
[0130]
融合蛋白或融合蛋白复合物还可具有抗原靶向功能。融合蛋白或融合蛋白复合物包含vh和vl区，其能够结合在一起形成抗原结合位点或abs。在一些构型中，il-10或il-10变体分子或其单体将共价连接至包含抗原结合位点的末端。这些靶向融合蛋白可在融合蛋白的一端包含至少一个功能性可变区或成对的vh和vl，使得融合蛋白保留靶向抗原的能力并且具有il-10或il-10变体分子的功能性同源二聚体(参见图9(a)-(f)和10(a)-(f))。可以通过改变一个或多个降低受试者抗原性的氨基酸来进一步修饰可变区(例如，通过添加、减去或取代)。vh和vl对形成支架，可以将多个抗体获得的cdr区移植到该支架上。此类抗体cdr区包括已知的和上文描述的那些抗体。例如，可以将来自任何抗体的cdr区移植到vh和vl对上，例如在seq id no：37、44或45中描述的那些，或能够形成融合蛋白复合物的那些融合蛋白，例如在seq id no：46和47；48和49；或50和51中描述的那些。上述vh和vl支架中的cdr区将包括以下数量的可用于cdr移植/插入的氨基酸位置：
[0131]
重链cdr13-7个氨基酸重链cdr27-11个氨基酸重链cdr37-11个氨基酸轻链cdr19-14个氨基酸轻链cdr25-9个氨基酸轻链cdr37-11个氨基酸
[0132]
在另一方面，上述融合蛋白可由以下通式之一表示：
[0133]
1)il10-l
1-x
1-l
1-x
2-l
1-il10
ꢀꢀ
(式i)；
[0134]
2)(z)
n-x
1-l
2-y
2-l
1-il10
ꢀꢀ
(式ii)；
[0135]
3)il10-l
1-y
1-l
2-x
2-(z)nꢀꢀ
(式iii)；
[0136]
4)x
1-l
2-x
2-l
1-il10
ꢀꢀ
(式iv)；
[0137]
5)il10-l
1-x
1-l
2-x2ꢀꢀ
(式v)；
[0138]
6)x
1-l
1-il10
ꢀꢀ
(式vi)；和
[0139]
7)il10-l
1-x2ꢀꢀ
(式vii)
[0140]
其中
[0141]“il-10”是人il-10(seq id no:1)、ebv il-10(seq id no:3)、dv05(seq id no:14、18或55)、dv06(seq id no:15、19或57)或dv07(seq id no:16、20或59)，在一个优选的实施方案中，“il-10”由dv05、dv06或dv07组成，更优选地，“il-10”由seq id no：55、57或59组成；
[0142]“l
1”是seq id no：31或54的接头；
[0143]“l
2”是seq id no：30的接头；
[0144]“x
1”是来自第一抗体的vh区，所述第一抗体对以下具有特异性：表皮生长因子受体(egfr)；cd52；各种免疫检查点靶标，例如但不限于pd-l1、pd-1、tim3、btla、lag3或ctla4；cd20；cd47；gd-2；her2；epcam；icam(icam-1、-2、-3、-4、-5)、vcam、fapα；5t4；trop2；edb-fn；tgfβtrap；madcam、β7整合素亚基；α4β7整合素；α4整合素sr-a1；sr-a3；sr-a4；sr-a5；sr-a6；sr-b；dsr-c1；sr-d1；sr-e1；sr-f1；sr-f2；sr-g；sr-h1；sr-h2；sr-i1；sr-j1；hiv或埃博拉；
[0145]“x
2”是从与x1相同的抗体获得的vl区；
[0146]“y
1”是来自第二抗体的vh区，所述第二抗体对以下具有特异性：表皮生长因子受体(egfr)；cd52；各种免疫检查点靶标，例如但不限于pd-l1、pd-1、tim3、btla、lag3或ctla4；cd20；cd47；gd-2；her2；epcam；icam(icam-1、-2、-3、-4、-5)、vcam、fapα；5t4；trop2；edb-fn；tgfβtrap；madcam、β7整合素亚基；α4β7整合素；α4整合素sr-a1；sr-a3；sr-a4；sr-a5；sr-a6；sr-b；dsr-c1；sr-d1；sr-e1；sr-f1；sr-f2；sr-g；sr-h1；sr-h2；sr-i1；sr-j1；hiv或埃博拉；
[0147]“y
2”是从y1相同的抗体获得的vl区；
[0148]
其中x和y来自相同或不同的抗体；
[0149]“z”是细胞因子，其选自il-6、il-4、il-1、il-2、il-3、il-5、il-7、il-8、il-9、il_15、il-26、il-27、il-28、il-29、gm-csf、g-csf、干扰素-α、-β、-γ、tgf-β、或肿瘤坏死因子-α、-β、碱性fgf、egf、pdgf、il-4、il-11、或il-13；
[0150]“n”是选自0-2的整数。
[0151]
在一个实施方案中，上述式i-vii的取代基优选选自以下：il-10优选为dv05、dv06或dv07，更优选il-10由dv05、dv06或dv07组成，或最优选il-10由seq id no：55、57或59组成；x1和x2优选为抗egfr、抗pdgfr、抗fgfr、抗vegf、抗her2neu、抗gpc3、抗madcam、抗icam-1、-2、-3、-4、抗vcam、抗hiv或抗埃博拉；y1和y2优选为抗egfr、抗madcam、抗icam-1、-2、-3、-4、抗vcam、抗hiv或抗埃博拉；z选自il-2、il-7或il-15；并且n是1。在一个最优选的实施方案中，融合蛋白是seq id no：33-53、61、63、65或67中的任何一个。本领域技术人员将理解组氨酸标签的存在用于融合蛋白的纯化过程，并且该标签可以保持完整或从最终产物中去除。本领域技术人员还将理解，上述任何抗体的vh和vl框架区可以被其他互补决定区(cdr)区取代。例如，如果vh和vl区来自抗埃博拉抗体，则六个cdr区(即vh和vl的cdr 1-3)可以被抗egfr抗体(例如，西妥昔单抗)的6个cdr区取代。因此，在一个优选的实施方案中，融合蛋白是seq id no：33-34、52或53。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白是具有seq id no：37、44、45、46-47、48-49或50-51表示的支架的融合蛋白；其中可以移植来自任何抗体的任何6个cdr区。在其他优选的实施方案中，来自抗埃博拉抗体的vh和vl区的cdr区可以移植来自抗madcam、抗vcam或抗icam-1、-2、-3、-4抗体的cdr区，其中在一个优选的实施方案中，cdr区可以移植到seq id no：37的融合蛋白中。以上的式ii和iii；式iv和v；和式vi和vii的融合蛋白被设计为结合在一起，以形成il-10(或其变体)的生物活性同源二聚体。根据所选的vh和vl区的对和/或移植到vh和vl中的cdr区，将上述融合蛋白设计为非靶向或靶向的。术语“非靶向”旨在描述不能靶向在体内定位的特定抗原的vh和vl区，因为该抗原不存在或抗原结合位点(abs)已被禁用或被修饰以消除abs功能。
[0152]
上述融合蛋白可以进一步与辅助蛋白/分子缀合。如本文所用，辅助蛋白描述了与融合蛋白或融合蛋白复合物缀合的蛋白质，使得其连接至与il-10单体或变体il-10单体分子相反的一侧。辅助蛋白的添加有效地产生了多功能分子，该分子结合了il-10或il-10变体分子功能和辅助蛋白的功能。辅助蛋白(例如，细胞因子il-2、il-7、il-12、il-15等)的连接，例如，可以连接至包含vh和vl支架的融合蛋白的vh区的n-末端。例如，当应用于治疗肿瘤的融合蛋白或融合蛋白复合物时，辅助蛋白包括但不限于il-10、il-10变体分子、il-6、il-4、il-1、il-2、il-3、il-5、il-7、il-8、il-9、il-15、il-26、il-27、il-28、il-29、gm-csf、
g-csf、干扰素-α、-β、-γ、tgf-β、或肿瘤坏死因子-α、-β、碱性fgf、egf、pdgf、il-4、il-11或il-13或其任何组合。当应用于治疗炎性疾病的融合蛋白或融合蛋白复合物时，辅助蛋白包括但不限于tgfβ。当应用于治疗自体免疫性疾病(例如但不限于脂肪肝疾病)的融合蛋白或融合蛋白复合物时，辅助分子包括但不限于奥比胆酸(obticholic acid)、阿拉姆醇(aramchol)、elafibranor、利拉鲁肽(liraglutide)、selonsertib或simtuzumab。当使用上式i-v描述时，以上定义的辅助蛋白可以在支架的vh部分的n-末端侧连接至取代基x1或y1。
[0153]
上述融合蛋白还可包括附加氨基酸序列，其在制造过程中有助于融合蛋白的回收或纯化。这些附加氨基酸序列可以包括各种序列修饰或亲和标签，例如但不限于蛋白a、白蛋白结合蛋白、碱性磷酸酶、flag表位、半乳糖结合蛋白、组氨酸标签和本领域公知的任何其他标签。参见，例如kimple等人(curr.protoc.protein sci.，2013，73:第9.9单元,表9.91，通过引用整体并入)。在一个方面，亲和标签是具有氨基酸序列hhhhhh(seq id no.:32)的组氨酸标签。组氨酸标签可以从最终产品中去除或保持完整。在另一个实施方案中，亲和标签是并入融合蛋白(例如，并入本文所述的融合蛋白的vh区)的蛋白a修饰，例如seq id no：34或44-53中所述的那些。本领域技术人员将理解，本文所述的任何融合蛋白序列都可以通过在抗体框架区内插入氨基酸点取代来修饰以并入蛋白a修饰，如本领域所述。
[0154]
在又一个实施方案中，上述各种融合蛋白可用于治疗癌症、治疗或预防ibd或克罗恩病、自体免疫性疾病、nafld或nash的方法中。
[0155]
il-10变体多核苷酸
[0156]
本技术的范围内还包括编码变体il-10分子和上述各种融合蛋白和/或免疫细胞因子的多核苷酸序列。一旦在本技术的变体il-10分子中定位了关键的il-10受体结合区和/或结构域间角度的区域后，实现氨基酸序列中期望的修饰所必须的dna修饰在本领域技术人员的技能组合内。这种修饰将采用常规的重组dna技术和方法。例如，可以使用合成的寡核苷酸通过定点诱变方法在核酸(dna)水平将特定氨基酸序列的添加或取代引入il-10序列中，这些方法也是本领域公知的。
[0157]
在另一个实施方案中，可以使用分子生物学的标准技术制备编码变体il-10序列的多核苷酸。例如，可以使用重组方法获得编码上述变体分子的多核苷酸序列，例如通过从表达基因的细胞中筛选cdna和基因组文库，或通过从已知包含基因的载体中衍生该基因。感兴趣的基因也可以基于已知序列合成产生，而不是克隆。可以针对特定序列设计具有合适密码子的分子。然后从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸组装完整序列，组装成完整的编码序列。参见，例如，edge,nature(1981)292:756；nambair等人,science(1984)223:1299；和jay等人,j.biol.chem.(1984)259:6311。
[0158]
在一个实施方案中，il-10变体分子或其融合蛋白是编码seq id no:9-29、33-53、55、57或59中任意的核酸分子。在另一个实施方案中，il-10变体分子是分别为seq id no:56、58或60的dv05、dv06或dv07。编码dv05、dv06或dv07的核酸分子可以包括不改变il-10变体分子功能的插入、缺失或取代(例如简并密码子)。由于遗传密码子的简并性，编码本文所述的il-10变体和融合蛋白的核苷酸序列可能与seq id no：1、3、5、7、9-29、33-53、55、57、59、61、63、65或67的序列不同，其可以与上述序列70-99％同源，优选与上述序列70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。由于至少一个核苷酸的插入、缺失或取代，编码seq id no：1、3、5、7、9-29、33-53、55、57、59、61、63、65或67的il-10变体和
融合蛋白的核苷酸序列也可以是70％-99％同源，优选70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。本技术还设想由于至少一个核苷酸的插入、添加、缺失或取代，核苷酸序列与seq id no:2、4、6、8、56、58、60、62、64、66和68具有70-99％的序列同源性，优选地具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。此外，编码本文所述的il-10变体和融合蛋白的核苷酸序列还可包含有助于例如蛋白表达、产生或分泌的众所周知的序列。这样的序列可以包括例如前导序列、信号肽和/或翻译起始位点/序列(例如kozak共有序列)。本文所述的核苷酸序列还可包括允许插入各种表达系统/载体的多个限制酶位点之一。
[0159]
在另一个实施方案中，多核苷酸包含在载体中，所述载体包含期望的il-10序列；或者使用本领域已知的寡核苷酸合成技术人工合成所述多核苷酸，例如定点诱变和聚合酶链反应(pcr)技术。参见，例如，sambrook，同上。在另一个实施方案中，编码变体il-10分子的核苷酸序列通过以下过程获得：使在自动多核苷酸合成仪中产生的互补的重叠合成寡核苷酸退火，随后连接并通过pcr扩增连接的核苷酸序列。参见，例如jayaraman等人,proc.natl.acad.sci.usa(1991)88:4084-4088。此外，寡核苷酸定向合成(jones等人,nature(1986)54:75-82)、预存在的核苷酸区域的寡核苷酸定向诱变(riechmann等人,nature(1988)332:323-327和verhoeyen等人,science(1988)239:1534-1536)、以及使用t4 dna聚合酶对缺口寡核苷酸进行酶促填充(queen等人,proc.natl.acad.sci.usa(1989)86:10029-10033)可用于提供用于本主旨方法中的分子。
[0160]
可以使用本领域技术人员熟知的多种合适的表达载体，其可用于变体il-10分子和融合蛋白的表达和引入。这些载体包括例如，可以使用puc型载体、pbr型载体、pbi型载体、pga型、pbinl9、pbi121、pgreen系列、pcambria系列、ppzp系列、ppcv001、pga482、pcld04541、pbibac系列、pyltac系列、psb11、psb1、pgptv系列和病毒载体等。
[0161]
包含il-10变体分子的载体还可包括载体功能所需的其他载体成分。例如，载体可以包括信号序列、标签序列、蛋白酶识别序列、选择标志物和其他序列调控序列，例如变体il-10分子的正确复制和表达所需的启动子。载体中使用的特定启动子没有特别限制，只要它们可以驱动变体il-10分子在多种宿主细胞类型中表达即可。同样，标签启动子的类型不受限制，只要标签序列使表达的变体il-10分子的纯化更简单或更容易。这些标签可包括，例如，可以使用6-组氨酸、gst、mbp、hat、hn、s、tf、trx、nus、生物素、flag、myc、rcfp、gfp等。蛋白酶识别序列没有特别限制，例如可以使用如xa因子、凝血酶、hrv、3c蛋白酶的识别序列。选择的标志物没有特别限制，只要其能够检测转化的水稻植物细胞，例如可以使用新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等。
[0162]
得到的携带期望的il-10变体或融合蛋白的dna构建体然后可直接用于基因治疗，或可用于生产重组il-10变体或融合蛋白。在一个实施方案中，本技术的变体il-10分子或融合蛋白可以通过本领域已知的任何方法递送，包括突变il-10蛋白的直接施用和用编码突变il-10蛋白的载体的基因治疗。基因治疗可以使用质粒dna或病毒载体完成，例如腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，本技术的病毒载体作为病毒颗粒施用，并且在其他实施方案中，其作为质粒施用(例如作为“裸”dna)。
[0163]
递送核苷酸序列的其他方法包括本领域已知的那些。这些方法包括通过细胞穿透肽、疏水部分、静电复合物、脂质体、配体、脂质体纳米颗粒、脂蛋白(优选hdl或ldl)、叶酸靶
向脂质体、抗体(如叶酸受体、转铁蛋白受体)、靶向肽或通过适体递送编码il-10或il-10变体分子的核苷酸序列，例如但不限于dna、rna、sirna、mrna、寡核苷酸或其变体。编码il-10变体分子的核苷酸序列可通过直接注射、输注、贴片、绷带、雾或气雾剂或通过薄膜递送递送至受试者。核苷酸(或蛋白质)可以递送到期望细胞因子刺激物的靶向递送的任何区域。这些区域包括，例如，肺、胃肠道、皮肤、肝脏、脑(通过颅内注射)、深部转移性肿瘤病变(通过超声引导注射)。
[0164]
测试il-10变体
[0165]
在一个实施方案中，筛选变体il-10分子或其融合蛋白的新功能，该功能是先前使用il-10同源二聚体序列未产生的功能，其抑制巨噬细胞分泌炎性细胞因子但不激活t细胞。在优选实施方案之一中，变体il-10分子或其融合蛋白基于ebv-il10骨架，其具有抗炎反应但缺乏刺激t细胞的能力。这些变体ebv-il10分子或其融合蛋白包括对受体结合结构域和先前未探索的连接区域的修饰，这些连接区域改变一级、二级和三级结构，以限制或加宽il-10同源二聚体之间的角度。在另一个实施方案中，包含对连接区域或负责结构域间角度形成的区域的修饰的il-10变体分子具有增强的cd8 t细胞功能。在另一个实施方案中，包含对连接区域或负责结构域间角度形成的区域的修饰的il-10变体分子或其融合蛋白具有抑制的骨髓功能但增强的kupffer细胞功能。
[0166]
一旦构建并表达了变体il-10分子或其融合蛋白，本领域技术人员将能够对il-10变体分子或其融合蛋白进行筛选测定法，以确定这些分子是否具有期望的对il-10受体结合区和/或结构域间角度的修饰所赋予的生物学功能性。多种筛选测定法是本领域技术人员已知的，并且可用于测试期望的生物学功能。在一个实施方案中，期望的生物学功能包括但不限于降低抗炎反应、降低t细胞刺激、增强t细胞功能、增强kupffer细胞功能和降低肥大细胞脱颗粒。
[0167]
例如，已知il-10暴露促使t细胞在t细胞受体刺激后产生和分泌更多的ifnγ。同时，il-10暴露阻止单核细胞/巨噬细胞响应于lps分泌tnfα、il-6和其他促炎细胞因子。il-10还抑制foxp3

cd4

t
reg
增殖。在一个实施方案中，积极选择那些使单核细胞/巨噬细胞抑制最大化但缺乏t细胞效应(包括刺激和抑制反应)的il-10变体分子或其融合蛋白。在一个实施方案中，筛选具有增加的抗炎作用的il-10变体分子或其融合蛋白，其将被积极选择用于治疗自体免疫性疾病、抗炎性疾病或两者。在另一个实施方案中，还将选择增强kupffer细胞清除和缺乏t
reg
抑制的il-10变体分子或其融合蛋白，以开发用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(nash)和/或非酒精性脂肪性肝病(nafld)。在又一个实施方案中，选择最大化t细胞生物学功能(包括刺激和抑制反应)、并且还具有增强的kupffer细胞清除的il-10变体，以开发用于治疗癌症。
[0168]
文献中有许多对测定细胞因子对免疫系统细胞的影响的描述，例如t细胞、单核细胞/巨噬细胞、kupffer细胞、t
reg
细胞和肥大细胞。本技术将应用这些测定系统，采用类似测定法通过接触本技术的变体il-10分子或其融合蛋白，来测试生物反应。
[0169]
现有技术中描述了各种用于测定引起t细胞反应的有效性的方法。这些方法中的任何一种都适用于测试本文所述的变体il-10分子。例如，chan等人(2015)描述了一种此类适用于变体il-10分子的方法。使用抗cd8微珠从外周血单个核细胞(pbmc)中分离cd8

t细胞。使用抗cd3和抗cd28抗体激活分离的cd8

t细胞。例如，使用包被有至少约5至20微克/ml
抗cd3抗体和至少约1至5微克/ml抗cd28抗体的平板，在约3天的时间段内，可以发生激活。激活后，收集t细胞、铺板、并用ebv-il10变体或其融合蛋白处理约3-5天的时间。市售的聚乙二醇化重组人il-10或ebv-il10可用作对照。用ebv-il10变体处理后，用可溶性抗cd3处理t细胞。用抗cd3处理后，收集细胞培养基并通过elisa检测干扰素γ(ifnγ)的分泌。
[0170]
现有技术中描述了用于测定细胞因子对单核细胞/巨噬细胞的刺激的各种方法。这些方法中的任何一种都适用于测试本文所述的变体il-10分子。例如，conway等人(2017)描述了一种此类适用于变体il-10分子的方法。使用ficoll梯度从新鲜供体血液的血沉棕黄层中分离人单核细胞，然后在percoll中进行高渗密度离心。在补充有5％人血清和1％l-谷氨酰胺的rpmi中培养30分钟后，单核细胞变成贴壁，用smem spinner培养基洗涤以去除污染的淋巴细胞。测试溶液和材料以确保不含lps。培养4天后，将单核细胞/巨噬细胞与10ng/ml lps和不同浓度的变体il-10分子接触或孵育至少24小时。收获培养物上清液，通过elisa测定tnf-α和il-1β浓度。
[0171]
现有技术中描述了用于测定kupffer细胞对细胞因子的反应的各种方法。这些方法中的任何一种都适用于测试本文所述的变体il-10分子。例如，chan等人(2016)描述了一种此类适用于变体il-10分子的方法。将kupffer细胞铺板在24孔或96孔平板中，并在肝细胞培养基(不含酚红的rpmi，pen/strep，cell maintenance supplement b(invitrogen))中孵育过夜。洗涤细胞并暴露于变体il-10分子24小时。洗涤细胞一次，暴露于15
–
20μl dii-ldl、dii-vldl、dii-oxldl或dii-acldl，2μl dmso，15μl细胞松弛素d，4小时后测量摄取。所有细胞在1x pbs中洗涤一次，并用110μl细胞裂解缓冲液裂解。将45μl细胞裂解物转移到透明底部、黑色壁的平板中，在575nm下读取荧光。
[0172]
现有技术中描述了各种用于测定使用细胞因子刺激t调节细胞反应的有效性的方法。这些方法中的任何一种都适用于测试本文所述的变体il-10分子。例如，chan等人(2016)描述了一种此类适用于变体il-10分子的方法。用cd4

微珠分离cd4

t细胞，并在aimv培养基中培养5-6天，所述aimv培养基含有不同浓度的变体il-10分子和2微克/ml固定的抗cd3和1mg/ml抗cd28。通过流式细胞术分析细胞表达的foxp3，以确定在fox p3

cd4

t调节细胞中是否诱导了tgf-β或il-2。
[0173]
现有技术中描述了各种用于测定肥大细胞响应于细胞因子刺激而增殖的有效性的方法。鼠肥大细胞系mc/9是一种常见的细胞系，用于制备il-10分子的释放测试。具体而言，il-10和il-10变体分子诱导肥大细胞的可剂量滴定的增殖。相反，il-10抑制肥大细胞的fc表达，表明il-10对这些细胞具有刺激和抑制两种作用。这些方法中的任何一种都适用于测试本文所述的变体il-10分子。例如，thompson-snipes等人(1991)描述了一种此类适用于变体il-10分子的方法。将mc/9肥大细胞铺板在平底24孔平板中，该平板含有1ml rpmi1640、10％fcs、50mm 2-me和不同浓度的变体细胞因子。培养3天后，使用细胞计数器对细胞进行计数，以确定变体il-10分子对肥大细胞增殖的影响。
[0174]
已知il-10在抑制肥大细胞表达ige受体、fcεri和ige介导的细胞因子产生中起作用。因此，现有技术中已经描述了用于测试il-10对肥大细胞的影响的方法。这些方法适用于测试本文所述的il-10变体分子。例如，kennedy norton等人(2008)描述了一种这样的方法。从供体皮肤样本中分离人肥大细胞，并在存在或不存在il-10的情况下、在含有干细胞因子(scf)的培养基中培养。使用抗fcεri特异性抗体，然后通过fitc标记的抗小鼠f
(ab')2，通过流式细胞术测定fcεri的表达。
[0175]
包含il-10变体分子的组合物和制剂
[0176]
本技术的il-10变体分子或其融合蛋白也可以配制在药物组合物中，所述药物组合物包含治疗有效量的变体il-10分子和药用载体和/或药学上可接受的赋形剂。药物组合物可以与常用的缓冲剂、赋形剂、防腐剂、稳定剂一起配制。药物组合物将配制用于以足以提供期望的治疗结果的治疗有效量施用于患者。优选地，这样的量具有最小的负面副作用。在一个实施方案中，施用的变体il-10分子或其融合蛋白的量将足以治疗炎性疾病或病症。在另一个实施方案中，施用的变体il-10分子或其融合蛋白的量将足以治疗癌症。施用量可能因患者而异，需要通过考虑受试者或患者的疾病或病症、患者的整体健康状况、施用方法、副作用的严重程度等来确定。在优选的实施方案中，药物组合物将包含变体il-10分子或其融合蛋白，其包含对il-10的受体结合结构域和/或结构域间角度的修饰之一或两者。在另一个实施方案中，变体il-10分子是变体il-10分子的聚乙二醇化形式。在又一个更优选的实施方案中，药物组合物包含作为融合蛋白或免疫细胞因子并入的变体il-10分子和药物赋形剂。
[0177]
对特定患者的有效量可以根据以下因素而不同：例如，所治疗的病症、患者的整体健康状况、施用的方法途径和剂量以及副作用的严重程度。施用至患者的适当剂量通常由临床医生使用本领域已知或怀疑会影响治疗或预期会影响治疗的参数或因素来确定。通常，剂量以略低于最佳剂量的量开始，此后以小的增量增加，直到相对于任何负面副作用实现期望的或最佳效果。重要的诊断措施包括那些症状，例如炎症或产生的炎性细胞因子的水平。
[0178]
还可以基于对il-10或变体il-10分子添加某些血清半衰期延长修饰来优化对患者施用的剂量(参见，例如，在美国专利9,943,568、10,010,588和10,143,726中详细讨论的，例如，已知聚乙二醇化il-10改善了循环的il-10半衰期)。本文公开的包含il-10或变体il-10的融合蛋白、免疫缀合物、融合蛋白、小抗体和双抗体也能够延长循环半衰期，同时保持与il-10受体的高亲和力结合。因此，在一个实施方案中，与il-10相关的的各种疾病、疾患、或病症或可通过施用包含il-10或变体il-10的融合蛋白、融合蛋白复合物、免疫缀合物或双抗体改善的各种疾病、疾患、或病症，可施用其至有需要的患者。在一个优选的实施方案中，可以通过向有需要的患者施用治疗有效量的具有ebv il-10或其变体(包括影响il-10受体结合亲和力的变体)的免疫缀合物复合物、融合蛋白或双抗体治疗或预防与il-10相关的疾病、疾患或病症，其中免疫缀合物复合物、融合蛋白或双抗体具有约60至155kda的分子量，其中治疗有效量在约0.5微克/公斤至100微克/公斤的范围内。本文所述的免疫缀合物、融合蛋白或双抗体可以每天、每周三次、每周两次、每周、每两个月或每个月施用。免疫缀合物、融合蛋白或双抗体的ebv il-10部分和可变区可以是本文讨论的那些结构的任何构型或组合。本文所述的半衰期延长的分子将有效治疗多种疾病，包括但不限于癌症、炎性疾病、自体免疫性疾病(例如，非酒精性脂肪性肝炎(nash)或非酒精性脂肪性肝病(nafld))，以及胆固醇升高。
[0179]
与第二治疗剂例如细胞因子、类固醇、化疗剂、抗生素、抗炎剂或放射共同施用或治疗的方法是本领域公知的。这些可包括与其他治疗剂的组合治疗，所述其他治疗剂例如但不限于以下一种或多种：干扰素-β(例如ifnβ-1α和ifn-β-1β)；模拟髓鞘碱性蛋白的蛋白
质；皮质类固醇；il-1抑制剂；tnf抑制剂；抗tnfα抗体、抗il-6抗体、il-1br-ig融合蛋白、抗il-23抗体、cd40配体和cd80的抗体；il-12和il-23的拮抗剂，例如il-12和il-23的p40亚基的拮抗剂(例如，针对p40亚基的抑制性抗体)；il-22拮抗剂；小分子抑制剂，例如甲氨蝶呤、来氟米特、西罗莫司(雷帕霉素)及其类似物，例如cci-779；cox-2和cpla2抑制剂；nsaid；p38抑制剂；tpl-2；mk-2；nfkβ抑制剂；rage或可溶性rage；p-选择素或psgl-1抑制剂(例如小分子抑制剂、其抗体，例如p-选择素的抗体)；雌激素受体β(erb)激动剂或erb-nfkβ拮抗剂。
[0180]
此外，用于与il-10变体分子或其融合蛋白施用的组合治疗可以包括tnf抑制剂，包括例如与tnf结合的嵌合、人源化、有效的人、人或体外产生的抗体，或其抗原结合片段；tnf受体的可溶性片段，例如p55或p75人tnf受体或其衍生物，例如，75kdtnfr-igg(75kd tnf受体-igg融合蛋白，enbrel
tm
)、p55kd tnf受体-igg融合蛋白；和tnf酶拮抗剂，例如，tnfα转化酶(tace)抑制剂。与抗炎剂/药物的其他组合治疗，抗炎剂/药物包括但不限于标准的非甾体抗炎药(nsaid)和环氧化酶-2-抑制剂。nsaid可包括阿司匹林、塞来昔布、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、纳布美通、萘普生、奥沙普嗪、吡罗昔康、双水杨酯、舒林酸和/或托美汀。在根据本技术的组合物中使用的环氧化酶-2抑制剂可以是例如塞来昔布或罗非昔布。
[0181]
可以与il-10变体分子或其融合蛋白共同施用和/或共同配制的其他治疗剂包括以下一种或多种：干扰素-β(例如ifnβ-1α和ifnβ-1β)；皮质类固醇；il-1抑制剂；tnf拮抗剂(例如，tnf受体的可溶性片段，例如，p55或p75人tnf受体或其衍生物，例如，75kdtnfr-igg；cd40配体和cd80的抗体；以及il-12和/或il-23的拮抗剂，例如，il-12和il-23的p40亚基的拮抗剂(例如，与il-12和il-23的p40亚基结合的抑制性抗体)；甲氨蝶呤、来氟米特和西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物，例如，cci-779。其他治疗剂可包括imfimzi或atezolizum。
[0182]
例如，出于治疗nash的目的，il-10变体分子或其融合蛋白可以与降胆固醇剂如他汀类药物和非他汀类药物组合。这些药剂包括但不限于辛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、吉非贝齐、氟伐他汀、消胆胺、非诺贝特、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸结合树脂或螯合剂、和/或微粒体甘油三酯转移蛋白(mtp)抑制剂。
[0183]
有效量的治疗剂将通过缓解症状来影响炎症或疾病或病症的水平。例如，影响可包括至少10％；至少20％；至少约30％；至少40％；至少50％；或更多的影响水平，使得疾病或病症减轻或完全治疗。
[0184]
包含变体il-10分子或其融合蛋白的药物组合物与药学上可接受的载体或赋形剂混合。各种药物载体是本领域已知的并且可以用于药物组合物中。例如，载体可以是适合于将本技术的变体il-10分子组合物递送至患者的任何相容的、无毒物质。合适的载体的示例包括生理盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克溶液。载体还可包括本领域技术人员通常已知的任何泊洛沙姆，包括但不限于分子量为2900(l64)、3400(p65)、4200(p84)、4600(p85)、11,400(f88)、4950(p103)、5900(p104)、6500(p105)、14,600(f108)、5750(p123)、和12,600(f127)的那些。载体还可包括乳化剂，包括但不限于聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80，仅举几例。也可以使用非水性载体，例如不挥发的油和油酸乙酯。载体还可以包括添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲剂和防腐剂，参
见，例如remington's pharmaceutical sciences and u.s.pharmacopeia:national formulary,mack publishing company,easton,pa.(1984)。治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备，例如，以冻干粉末、浆液、水性溶液或悬浮液的形式制备。
[0185]
应用的组合物可以口服或注射施用至身体。口服使用的制剂还可包括进一步包括保护变体il-10分子免受胃肠道蛋白酶影响的化合物。注射通常是肌内、皮下、皮内或静脉内注射。或者，在适当的情况下可以使用关节内注射或其他途径。肠胃外施用的变体il-10分子优选与药物载体和/或药学上可接受的赋形剂一起以单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)配制。在其他实施方案中，可以通过可植入或可注射的药物递送系统将应用的组合物引入患者身体。
[0186]
il-10变体的治疗用途
[0187]
在一个实施方案中，本技术提供了治疗、减轻或降低与炎症、炎性疾病或自体免疫性疾病相关的症状的方法。本技术还提供il-10、il-10变体分子、融合蛋白或其嵌合分子，用作炎症、炎性疾病或自体免疫性疾病、癌症或肿瘤的药物。本技术还考虑了il-10、il-10变体分子、融合蛋白或其嵌合分子用于治疗炎症或炎性疾病、或自体免疫性疾病、癌症或肿瘤的用途。这些疾病包括，例如，ibd、克罗恩病、溃疡性结肠炎、nash、nafld、高胆固醇血症或癌症，仅举几例。方法考虑了施用治疗有效量的一种或多种本文所述的变体il-10分子或其融合蛋白。在一个实施方案中，本技术包括一种治疗炎性疾病或自体免疫性疾病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的变体il-10分子，该变体il-10分子包含一个或多个与受体结合结构域和/或负责形成结构域间角度的区域相关的修饰。在一个优选的实施方案中，方法包括施用变体ebv-il10分子或其融合蛋白。在一个优选的实施方案中，用于治疗炎性疾病的变体il-10分子或其融合蛋白包括与野生型il-10分子相比，具有受限的结构域间角度和/或还表现出较低的受体亲和力的变体分子。在其他实施方案中，用于治疗炎性疾病的变体il-10分子或其融合蛋白包括与野生型il-10分子相比，具有松弛的结构域间角度和/或还表现出较低的受体亲和力的变体分子。变体il-10分子的聚乙二醇化形式也被设想为本技术的一部分，用于炎性疾病或炎症。
[0188]
本技术的炎性疾病或自体免疫性疾病包括与不想要的或不希望的炎症和免疫反应相关的任何疾病或病症。这些疾病包括但不限于炎性肠疾病(ibd)、克罗恩病、牛皮癣、类风湿性关节炎、非酒精性脂肪性肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)。在其他实施方案中，疾病或病症包括神经退行性疾病，例如帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(als)、致死性家族性失眠症、拉斯穆森脑炎、唐氏综合症、亨廷顿病、gerstmann-straussler-scheinker病、结节性硬化症、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚急性硬化性全脑炎、莱姆病；tse tse病(非洲昏睡病)、hiv痴呆、牛海绵状脑病(“疯牛病”)；克雅氏病；单纯疱疹脑炎、带状疱疹小脑炎、麻痹性痴呆(梅毒)、结核性脑膜炎、结核性脑炎、视神经炎、肉芽肿性血管炎、颞关节炎、脑血管炎、spatz-lindenberg病、甲基苯丙胺相关血管炎、可卡因相关性血管炎、创伤性脑损伤、中风、lance-adams综合征、缺氧后脑病、放射性坏死、边缘性脑炎、阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹、纹状体黑质变性、皮质基底节变性、原发性进行性失语症、与17号染色体相关的额颞叶痴呆、脊髓性肌萎缩、hiv相关脊髓病、htlv-1相关脊髓病(热带痉挛性下肢轻瘫)、脊髓痨(梅毒)、横贯性脊髓炎、脊髓灰质炎后综合征、脊髓损伤、放射性脊髓病、
charcot-marie-tooth、hiv相关多发性神经病、弯曲杆菌相关运动轴突病、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、糖尿病性肌萎缩撕脱症、幻肢、复杂区域疼痛综合征、糖尿病性神经病、副肿瘤性神经病、肌强直性营养不良、htlv-1相关性肌病、旋毛虫病、炎性肌病(多发性肌炎、包涵体肌炎、皮肌炎)、镰状细胞病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、肺结核、亚急性细菌性心内膜炎、慢性病毒性肝炎、病毒性心肌病、chaga病、疟疾、柯萨奇病毒感染、黄斑变性、色素性视网膜炎、血管炎、炎性肠疾病、类风湿性关节炎、大疱性天疱疮、churg-strauss综合征、心肌梗塞、中毒性表皮坏死松解症、休克(如急性过敏性休克)、1型糖尿病、自体免疫性甲状腺炎、淋巴瘤、卵巢癌、狼疮(系统性红斑狼疮)、哮喘、早衰、结节病、2型糖尿病和代谢综合征。作为本技术的实施方案的与炎症相关的其他疾病或病症，包括炎性肺疾病，例如支气管炎、氧化剂诱导的肺损伤和慢性阻塞性气道疾病；眼部炎性疾病，包括角膜营养不良、高眼压症、沙眼、盘尾丝虫病、视网膜炎、葡萄膜炎、交感神经性眼炎和眼内炎；牙龈慢性炎性疾患，包括牙周炎；关节的慢性炎性疾患，包括关节炎、化脓性关节炎和骨关节炎、结核性关节炎、麻风性关节炎、结节性关节炎；皮肤的疾患，包括硬化性皮炎、晒伤、牛皮癣和湿疹；脑脊髓炎和病毒性或自体免疫性脑炎；自体免疫性疾病，包括免疫复合血管炎；以及心脏疾病，包括缺血性心脏病、心力衰竭和心肌病。可受益于变体il-10分子或其融合蛋白的疾病的其他非限制性实例包括，肾上腺功能不全；高胆固醇血症；动脉粥样硬化；与骨吸收增加相关的骨疾病，例如骨质疏松症、先兆子痫、子痫、尿毒症并发症；慢性肝衰竭和其他与炎症相关的疾病，如囊性纤维化、结核、恶病质、缺血/再灌注、血液透析相关病症、肾小球肾炎、再狭窄、病毒感染的炎症后遗症、缺氧、高压氧惊厥和中毒、痴呆、sydenham舞蹈病、亨廷顿病、癫痫、korsakoff病、与脑血管疾患相关的低能、no介导的脑创伤及相关后遗症、缺血性脑水肿(中风)、偏头痛、呕吐、免疫复合物疾病、同种异体移植排斥、侵入性微生物引起的感染；和老化。
[0189]
对治疗抗炎性疾病或病症最有效的il-10变体或其融合蛋白包括刺激t细胞能力降低的那些。因此，本技术的发明人已经表明，通过在第75位的氨基酸取代修饰受体结合结构域以诱导最少量的t细胞刺激。特别地，已经表明在seq id no.：3中具有a75i取代(或seq id no.57)的ebv il-10降低t细胞刺激(参见，例如图8e，表示为dv06)。因此，一个特别优选的实施方案考虑使用具有il-10变体分子的双抗体和单抗体，所述il-10变体分子具有基于dv06的突变(在seq id no.：3的氨基酸第75位的取代，或seq id no.57)。在更优选的实施方案中，炎性疾病的方法将利用包含seq id no：26-27；37；40；41-42、43、48-49或其组合的融合蛋白或融合蛋白复合物。
[0190]
在本技术的另一个实施方案中，治疗方法包括施用il-10或变体il-10分子或其融合蛋白以治疗或减轻与癌症相关的症状。方法考虑了施用治疗有效量的一种或多种本文所述的il-10或变体il-10分子或其融合蛋白。在一个实施方案中，本技术包括一种治疗或减少与癌症相关的症状的方法，所述方法包括施用治疗有效量的变体il-10分子，该变体il-10分子包含一个或多个与受体结合结构域和/或负责形成结构域间角度的区域相关的修饰。在一个优选的实施方案中，方法包括施用变体ebv-il10分子或其融合蛋白。用于治疗癌症的变体il-10分子或其融合蛋白包括与野生型il-10分子相比，具有受限的结构域间角度和/或还表现出更高的受体亲和力的变体分子。用于治疗或减少与癌症相关的症状的变体il-10分子或其融合蛋白包括与野生型il-10分子相比，具有松弛的结构域间角度和/或还
表现出更高的受体亲和力的变体分子。变体il-10分子的聚乙二醇化形式也被设想为本技术的一部分，用于治疗癌症。能够在体内减小肿瘤体积的融合蛋白的一个具体示例包括在seq id no.：3的氨基酸第31和75位具有两个取代的il-10变体，其包括特定取代v31l和a75i，称为dv07(例如，seq id no.：59)。图16a-c证明在不同剂量下，包含缀合在双抗体结构上的dv07 ebv il-10分子的融合蛋白，称为d:dv07，在7天和10天的时间过程中减小了肿瘤体积。因此，一个特别优选的实施方案考虑使用具有il-10变体分子的双抗体和单抗体，所述il-10变体分子具有基于dv07的突变(在seq id no.：3的氨基酸第31和75位的取代；或seq id no.59)。在更优选的实施方案中，治疗癌症或肿瘤或肿瘤的方法将利用包含seq id no：28-29；33；34；35-36；38-39；46-47、61、63、65或67；或其组合的融合蛋白或融合蛋白复合物。
[0191]
可由本文所述的变体il-10分子或其融合蛋白治疗的癌症或增殖性疾病包括各种形式的癌症，包括但不限于子宫癌、子宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、阴茎癌、胃肠道癌，例如，食道癌、口咽癌、胃癌、小肠或大肠癌、结肠癌或直肠癌、肾癌、肾细胞癌、膀胱癌、骨癌、骨髓癌、皮肤癌、头或颈部癌、皮肤癌、肝癌、胆囊癌、心脏、肺癌、胰腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌、甲状腺癌、脑癌，例如神经胶质瘤、神经节癌、中枢神经系统(cns)和外周神经系统(pns)癌，以及免疫系统癌，例如脾脏或胸腺癌。本技术提供了治疗例如免疫原性肿瘤、非免疫原性肿瘤、休眠肿瘤、病毒诱导的癌症的方法，例如上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌、乳头状瘤病毒、腺癌、淋巴瘤、癌、黑素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌、化学诱导的癌症、转移和血管生成。本技术还考虑降低对肿瘤细胞或癌细胞抗原的耐受性，例如通过调节调节性t细胞(t
reg
)和/或cd8

t细胞的活性。在一个优选的实施方案中，il-10变体分子特别适用于治疗患有肝转移性疾病的患者或受试者。
[0192]
在其他实施方案中，治疗或减少与炎性疾病或癌症相关的症状的方法包括与其他治疗剂组合施用变体il-10分子或其融合蛋白或其衍生形式(例如聚乙二醇化)。这些治疗剂包括但不限于细胞因子或细胞因子拮抗剂，例如il-12、il-2、il-15、干扰素-α或抗表皮生长因子受体、多柔比星、表柔比星、抗叶酸，例如，甲氨蝶呤或氟尿嘧啶、伊立替康、环磷酰胺、放疗、激素或抗激素疗法，例如雄激素、雌激素、抗雌激素、氟他胺或己烯雌酚、手术、他莫昔芬、异环磷酰胺、二溴卫矛醇、烷化剂，例如美法仑或顺铂、依托泊苷、长春瑞滨、长春花碱、长春地辛、糖皮质激素、组胺受体拮抗剂、血管生成抑制剂、放射、放射增敏剂、蒽环类、长春花生物碱、紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛、细胞周期抑制剂，例如细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制剂、针对另一种肿瘤抗原的单克隆抗体、单克隆抗体和毒素的复合物、t细胞佐剂、骨髓移植或抗原呈递细胞，例如树突细胞疗法。
[0193]
在其他实施方案中，本技术还体现了治疗脂质相关疾患(例如高胆固醇血症和高三酸甘油酯血症)、和/或改善脂质参数(例如总胆固醇、高密度脂蛋白(hdl)胆固醇、低密度脂蛋白(ldl)胆固醇、极低密度脂蛋白(vldl)胆固醇、甘油三酯和非hdl胆固醇)的方法，所述方法包括施用变体il-10分子或其衍生形式(例如聚乙二醇化)。
[0194]
对治疗脂质相关疾病或疾患最有效的il-10变体或其融合蛋白包括对巨噬细胞具有最小抑制能力的那些。因此，本技术的发明人已经表明，通过在第31位的氨基酸取代(与同源二聚体的结构域间角度增加关联)修饰受体结合结构域以诱导最少量的巨噬细胞反应。特别地，已经表明在seq id no.：3中具有v31l取代的ebv il-10降低巨噬细胞反应(参
见，例如图8a，表示为dv05，或seq id no.55)。因此，一个特别优选的实施方案考虑使用具有il-10变体分子的双抗体和单抗体，所述il-10变体分子具有基于dv05的突变(在seq id no.：3的氨基酸第31位的取代，或seq id no.55)。在更优选的实施方案中，治疗基于脂质的疾病或疾患的方法将利用包含seq id no：24-25；50-51；或45的融合蛋白或融合蛋白复合物。
[0195]
在本技术的又一个实施方案中，il-10变体分子或其融合蛋白、病毒il-10(包括ebv或cmv il-10)或野生型il-10(其中任一者可任选地包括聚乙二醇化或hes化)用于通过减少肥大细胞脱颗粒来靶向肥大细胞的方法中。在一个优选的实施方案中，靶向肥大细胞的方法包括接触病毒il-10或il-10变体分子以治疗季节性变态反应或急性过敏反应。在另一方面，il-10变体分子、病毒il-10(包括ebv或cmv il-10)或野生型il-10用于降低ige反应性的方法中。
[0196]
在又一个实施方案中，当筛选患者群体时，本技术的il-10变体分子或其融合蛋白优选可用于所描述的方法(例如抗炎和/或癌症)中。在一个实施方案中，表现出升高的或高的ifnγ反应特征的那些患者是对使用il-10变体分子治疗癌症最易感的或最理想的。在另一个实施方案中，表现出降低的或低的ifnγ反应特征的那些患者是对使用il-10变体分子治疗抗炎最易感的或最理想的。
[0197]
参考以下实施例可以最好地理解本技术的广泛范围，这些实施例并非旨在将本技术限制为任何特定实施方案。本文中的所有引文以引用方式并入本文，其范围正如每个单独出版物或专利申请以引用方式并入，并被具体地和单独地提及。
[0198]
在不脱离本技术的精神和范围的情况下，可以对本技术进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。在此描述的具体实施方案是通过实施例的方式提供的，并且本技术受所附权利要求条款以及这些权利要求所赋予的等效物的全部范围的限制；本技术并不受本文中以举例方式给出的具体实施方案的限制。此外，上述说明书中引用的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用并入本文。
实施例
[0199]
以下实施例仅用于说明本技术的各种实施方案，不应以任何方式解释为限制本技术的范围。
[0200]
实施例1
[0201]
ebv-il-10变体或其融合蛋白是通过标准分子生物学克隆技术改变一级序列而构建的。设计一级序列的改变，以改变受体结合结构域的亲和力以及结构域间角度的打开或关闭。通过改变成熟分泌序列中第31和/或75位及其周围的氨基酸，可以改变受体亲和力。可以改变结构域间角度，例如但不限于，在螺旋c和d以及d和e之间的非α螺旋序列中引入脯氨酸。脯氨酸在一级氨基酸序列的线性方向上驱动扭结，潜在地改变由d和e螺旋的二级和三级结构驱动的后续结构域的氨基酸序列域间角度。类似地，引入具有庞大侧链的氨基酸(例如色氨酸)可以对一级氨基酸骨架的线性结构引入不太显著的改变，从而对二级和三级结构产生不大的变化。
[0202]
实施例2
[0203]
以下实施例提供了如何在巨噬细胞中评估变体il-10分子或其融合蛋白的描述。
[0204]
抽取来自健康患者群体或患有炎性疾病(例如，克罗恩病)的患者的人血液，并使用标准的ficoll密度梯度离心程序处理新鲜抽取的血沉棕黄层，以收获pbmc。然后使用easysep tm人单核细胞富集试剂盒(目录号19059，stem cell technologies)并按照制造商的说明对pbmc进行cd14

单核细胞的富集。通过标准流式细胞术评估富集效率。
[0205]
富集的单核细胞以2x106细胞/ml/孔铺板在24孔板中的补充有5％人血清和psg的rpmi培养基中。细胞用变体il-10分子的系列稀释液(0、0.1、1、10、100、1000ng/ml)在37℃/5％co2加湿培养箱中处理1小时，然后暴露于10ng/ml lps(目录号l4391，sigma-aldrich)12-16小时。过夜孵育后，收集上清液并通过标准elisa或使用ique screener(intellicyt)测量炎性细胞因子(il-6、tnfα、il-1β)。
[0206]
在研究中，上述方法用于比较非聚乙二醇化ebv-il10和非聚乙二醇化人il-10对巨噬细胞免疫抑制能力的影响。图2a、2b和3a、3b表明ebv-il10保留了抑制炎性细胞因子il-1β和tnfα的能力，这表明尽管结构域间角度存在差异，但ebv-il10能够以类似于人il-10的方式维持其抑制炎性能力。
[0207]
实施例3
[0208]
以下实施例提供了如何在人cd8

t细胞中评估变体il-10分子或其融合蛋白的描述。
[0209]
抽取来自健康患者群体或患有炎性疾病(例如，克罗恩病)的患者的人血液，并使用标准的ficoll密度梯度离心程序处理新鲜抽取的血沉棕黄层，以收获pbmc。然后使用easysep tm人cd8

t细胞富集试剂盒(目录号19053，stem cell technologies)并按照制造商的说明对pbmc进行cd8

t细胞的富集。通过标准流式细胞术方法评估富集效率。富集的细胞悬浮在aimv(thermo fisher scientific,目录号12055083)培养基中。通过在37℃/5％002加湿细胞培养箱中孵育，然后用1x pbs洗涤1-2次，用10微克/ml抗cd3(目录号thermo fisher scientific)和2微克/ml抗cd28(目录号thermo fisher scientific)包被24孔平板，持续2小时。
[0210]
将富集的cd8

t细胞(3x106/ml/孔)加入抗cd3/抗cd28包被的平板中，并在37℃/5％co2的加湿细胞培养箱中孵育72小时。
[0211]
72小时后，收获细胞，计数并将100μl重新铺板在圆底96孔平板中(2x105细胞/孔)，其中存在/不存在系列稀释(0、0.1、1、10、100、1000ng/ml——以100μl/孔加入)的变体il-10分子或对照样品。测试一式三份进行。将具有变体il-10分子或其融合蛋白的细胞在37℃/5％co2加湿培养箱中孵育72小时。72小时后，收集细胞，洗涤，并重新铺板在新的圆底96孔平板中，其中存在可溶性抗cd3(目录号16-0039-85，thermo fisher scientific)，在37℃/5％co2的加湿培养箱中持续4小时。
[0212]
在研究中，上述方法用于比较非聚乙二醇化ebv-il10和非聚乙二醇化人il-10对cd8

t细胞的刺激。图2c和3c显示，与人il-10相比，ebv-il10呈现降低的ifnγ(t细胞刺激的量度)水平。这表明通过改变结构域间角度，能够调节t细胞的刺激。图4a和4b显示，一半接受治疗的供体表现出期望的完全抗炎作用，而另一半则没有。选择用于开发的变体将模拟供体1的反应，完全抑制巨噬细胞响应于lps的炎性细胞因子分泌，并且缺乏激活的cd8

t细胞诱导的ifnγ。供体2表现出与供体1相似地抑制单核细胞/巨噬细胞对炎性细胞因子的分泌，但仅使t细胞ifnγ分泌的曲线和最大激活右移。改变受体亲和力和结构域间角度的
il-10变体分子应进一步降低类似于供体2的患者中的t细胞激活。
[0213]
实施例4
[0214]
如前所述，培养从atcc购买的人单核细胞/巨噬细胞、t细胞和鼠mc/9细胞，并评估对单或双n-末端5kda聚乙二醇化ebv-il10的反应。ebv-il10的聚乙二醇化导致巨噬细胞对lps的反应略微降低(图5b)，但几乎完全抑制受刺激的t细胞的ifnγ诱导(图5c)。同样，ebv-il10的聚乙二醇化几乎消除了其对mc/9细胞的刺激作用(图5a)。
[0215]
使用mc/9细胞增殖测定法测试了各种形式的具有抗cd3α和抗egfr vh和vl区的ebv-il-10变体双抗体。ebv-10变体部分包括d:dv05(具有v31l突变的ebv il-10)、d:dv06(具有a75i突变的ebv il-10)和d:dv07(具有v31l和a75i突变)。此外，还测试了包含抗hiv和抗埃博拉vh和vl区的dv07双抗体。将各种变体双抗体形式与人il-10和ebv il-10进行比较。结果在图15中提供。
[0216]
还对其他形式的ebv-il-10融合蛋白进行了体外测试。特别是，将dhivdebo:dv06(seq id no:26和27)和dmadcamdebo:dv06(seq id no:41和42)与人il-10在本文所述的巨噬细胞和t细胞反应测定法中进行了比较。结果在图20a和20b中提供。
[0217]
实施例5
[0218]
以下实施例提供了用于在体内肿瘤模型中测试il-10和il-10变体分子及其融合蛋白的代表性方案。所有体内研究均按照标准操作程序和机构动物护理和使用委员会(“iacuc”)批准的既定指南进行。
[0219]
购买八周龄雌性balb/c小鼠，隔离一周，并维持在标准的食物和水中，每周更换1次垫料，标准24小时光照/黑暗循环。
[0220]
将ct26肿瘤细胞(2x105)悬浮在汉克斯缓冲盐溶液中，并皮下植入八周龄的小鼠中并使其生长。携带ct26肿瘤(平均50-150mm3)的野生型balb/c(envigo)、或b细胞敲除(jackson)小鼠用0.4和0.2mg/kg(每周3次(q3w))、0.2和0.1mg/kg(每天(qd)，5天，两天停药)的il-10或il-10变体分子或其融合蛋白(例如，具有两个受体结合取代的ebv il-10变体分子，dv07(图8c)，共价连接至来自两种不同抗体或双抗体的vh和vl)皮下(颈背)处理10天。每三天通过电子卡尺测量肿瘤的长度和宽度并计算肿瘤体积((lxw2)/2))。通过静脉内(i.v.)施用200μg/小鼠抗小鼠cd20而耗尽野生型小鼠中的b细胞。在图16中提供了一项此类研究的结果，其中使用称为d:dv07的il-10变体分子，其是具有v31l和a75i突变的il-10变体，并且包含来自抗cd33α和抗egfr的可变区。
[0221]
在图17a和17b中，在体内肿瘤模型中比较了两种形式的il-10变体融合蛋白(即，由图9c(大形式)和9f(小形式)表示的包含v31l和a75i突变的il-10变体，dv07)。融合蛋白是非靶向融合蛋白，其包含来自抗hiv抗体和抗埃博拉抗体(大形式)的vh和vl区，和来自抗埃博拉抗体的vh和vl区。给药研究检查了与聚乙二醇化重组人il-10(每天0.75mg/kg)相比，以5天给药、2天停药施用小形式非靶向il-10融合蛋白的作用(图17a)。给药研究还检查了与聚乙二醇化il-10(每天0.75mg/kg)相比，以每周3次施用大形式和小形式非靶向il-10融合蛋白的作用(图17b)。
[0222]
还在体内测试了使用具有肿瘤靶向能力的小形式和大形式il-10融合蛋白(即，包含v31l和a75i突变的il-10变体，dv07)的研究。图18a是每天施用各种靶向的il-10变体融合蛋白的结果，其中将大形式(degfdebo:dv07)和小形式(degf:dv07)与小形式非靶向
(debo:dv07)il-10融合蛋白和聚乙二醇化il-10进行了比较。图18b是每周3次施用各种大形式靶向的il-10变体融合蛋白的结果，其中将不同剂量(1mg/kg和0.25mg/kg)的大形式(degfdebo:dv07)与小形式非靶向(debo:dv07)il-10融合蛋白和聚乙二醇化il-10进行了比较。图18c是每周3次施用各种小形式靶向的il-10变体融合蛋白的结果，其中将不同剂量(1mg/kg和0.25mg/kg)的小形式(degf:dv07)与小形式非靶向(debo:dv07)il-10融合蛋白和聚乙二醇化il-10进行了比较。
[0223]
实施例6
[0224]
以下实施例提供了用于在体内胆固醇模型中测试il-10和il-10变体分子及其融合蛋白的代表性方案。所有体内研究均按照标准操作程序和iacuc批准的既定指南进行。
[0225]
从适当的供货商购买八周龄雌性c57bl/6j小鼠，隔离一周，并维持在标准的食物和水中，每周一次更换垫料，标准24小时光照/黑暗循环。
[0226]
八周龄雌性c57bl/6j小鼠，杰克逊实验室，被喂食高脂肪饮食(envigo)三周。通过对每只小鼠进行框后采血获得血浆样品，然后用il-10或il-10变体或其融合蛋白(例如，在seq id no:3的氨基酸第31位包含单个取代(v31l)的ebv il-10变体，连接成双抗体(d:dv05 ebv il-10变体)治疗。用0.4和0.2mg/kg(每周3次(q3w))以及0.2和0.1mg/kg(每周(qd)，5天处理，治疗间隔2天)皮下处理小鼠。对动物进行两周的治疗，并进行末期抽血，然后定量给药前和给药后的血浆胆固醇浓度。在治疗开始前一天，通过静脉内(i.v.)施用200μg/小鼠抗小鼠cd20耗尽b细胞。图19a和19b中提供了一项此类研究的结果。
[0227]
实施例7
[0228]
以下实施例提供了用于在体内右旋糖酐硫酸酯钠(“dss”)炎症模型中测试il-10和il-10变体分子及其融合蛋白的代表性方案。所有体内研究均按照标准操作程序和iacuc批准的既定指南进行。
[0229]
从适当的供货商购买八周龄雌性balb/c小鼠，隔离一周，并维持在标准的食物和水中，每周一次更换垫料，标准24小时光照/黑暗循环。b细胞敲除(jackson)小鼠喂食含4％dss的水6天，随意进食，然后提供正常水。在第5天，小鼠用0.4和0.2mg/kg(每周3次(q3w))、0.2和0.1mg/kg(每天(qd)，5天，两天停药)的il-10或il-10变体或其融合蛋白(例如，在seq id no:3的氨基酸第75位具有单个突变(a75i)的ebv il-10变体，连接至双抗体(d:dv06 ebv il-10变体))皮下(颈背)处理10天。每天对小鼠进行评估：
[0230]
1.)体重
[0231]
2.)大便血
[0232]
3.)总血量(gross blood)
[0233]
4.)大便稠度
[0234]
通过组合得分确定疾病活动指数；
[0235]
1.体重减少
[0236]
2.大便稠度
[0237]
3.出血(除以3)
[0238]
每个得分如下确定：体重变化(0:《1％,1:1-5％,2:5-10％,3:10-15％,4》15％)；大便血(0：阴性，2：阳性)；或总出血(4)；以及大便稠度(0：正常，2：稀便，4：腹泻)。
[0239]
优选实施方案的列表
[0240]
1.一种epstein-barr病毒il-10(ebv-il10)变体蛋白，其包含一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代，与野生型ebv-il10相比，呈现改变的结构域间角度和/或改变的对同源受体的亲和力，其中当二聚化时，所述改变的结构域间角度调节与同源受体接合的角度。
[0241]
2.根据前述实施方案的ebv-il10蛋白，其中一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代位于il-10受体结合结构域中。
[0242]
3.根据前述实施方案中任一项的ebv-il10蛋白，其中一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代位于α螺旋a和/或螺旋d内。
[0243]
4.根据前述实施方案中任一项的ebv-il10蛋白，其中一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代位于ebv-il10的连接结构域中。
[0244]
5.根据前述实施方案中任一项的ebv-il10蛋白，其中一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代位于ebv-il10的de环内。
[0245]
6.根据前述实施方案中任一项的ebv-il10蛋白，其中一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代位于α螺旋d和α螺旋e或α螺旋c和α螺旋d之间存在的12个氨基酸接头区域内，优选在12个氨基酸接头区域内脯氨酸的添加或取代。
[0246]
7.根据前述实施方案中任一项的ebv-il10蛋白，其中对同源受体改变的亲和力包括在il-10受体结合结构域中的一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代。
[0247]
8.根据前述实施方案中任一项的ebv-il10蛋白，进一步包含位于α螺旋a和/或α螺旋d内的一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代。
[0248]
9.根据前述实施方案中任一项的ebv-il10蛋白，进一步包含位于il-10受体结合结构域内的一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代。
[0249]
10.根据前述实施方案中任一项的ebv-il10蛋白，进一步包含位于α螺旋a和/或α螺旋d内的一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代。
[0250]
11.根据前述实施方案中任一项的ebv-il10蛋白，其中一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代在seq id no.3的氨基酸第31位和/或第75位。
[0251]
12.一种单体重组蛋白，其包含六个能够与相同的单体蛋白形成同源二聚体的编号为a-f的α螺旋，其中α螺旋d和e通过链间氨基酸接头连接，所述接头通过至少一个氨基酸的添加、缺失或取代被修饰，从而当同源二聚化时改变蛋白的分子间角度。
[0252]
13.根据前述实施方案的重组蛋白，其中所述重组蛋白是来自病毒的蛋白。
[0253]
14.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中所述病毒是epstein-barr病毒(ebv)。
[0254]
15.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中在两个相同单体蛋白质之间形成的同源二聚体与其同源受体形成特定的相互作用角度。
[0255]
16.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中所述相互作用角度大于天然野生型蛋白质。
[0256]
17.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中在同源二聚化时形成的相互作用角度导致蛋白质对同源受体具有更高的亲和力。
[0257]
18.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中在同源二聚化时形成的相互作用角度导致蛋白质对同源受体具有更低的亲和力。
[0258]
19.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中所述相互作用角度小于天然野
生型蛋白质。
[0259]
20.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中所述相互作用角度导致蛋白质对同源受体具有更高的亲和力。
[0260]
21.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中所述相互作用角度导致蛋白质对同源受体具有更低的亲和力。
[0261]
22.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中所述单体蛋白质是白细胞介素10。
[0262]
23.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中所述单体蛋白质是ebv-il10。
[0263]
24.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中通过对导致与同源受体的相互作用角度的接头修饰赋予蛋白质角度。
[0264]
25.一种重组变体epstein-barr病毒il-10(ebv-il10)蛋白，其包含对ebv-il10的α螺旋d和e之间的接头区域和/或对ebv-il10的受体结合区的至少一个氨基酸添加、缺失或取代。
[0265]
26.根据前述实施方案的重组蛋白，其中变体ebv-il10蛋白与相同蛋白的相互作用，导致同源二聚体具有改变的与其同源受体的相互作用角度，和/或改变的同源二聚体间角度。
[0266]
27.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中变体ebv-il10蛋白形成大于野生型ebv-il10蛋白的相互作用角度和/或改变的同源二聚体间角度。
[0267]
28.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中变体ebv-il10蛋白形成小于野生型ebv-il10蛋白的相互作用角度和/或改变的同源二聚体间角度。
[0268]
29.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中在同源二聚体形成时形成的相互作用角度导致变体ebv-il10蛋白具有增加的对其同源受体的亲和力。
[0269]
30.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中在同源二聚体形成时形成的相互作用角度导致变体ebv-il10蛋白具有降低的对其同源受体的亲和力。
[0270]
31.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中所述相互作用角度赋予对其同源受体增加的亲和力。
[0271]
32.根据前述实施方案中任一项的重组蛋白，其中所述相互作用角度赋予对其同源受体降低的亲和力。
[0272]
33.一种分离的重组多核苷酸，其编码根据前述实施方案中任一项的蛋白质。
[0273]
34.一种分离的重组多核苷酸，其编码根据前述实施方案中任一项的蛋白质。
[0274]
35.一种载体，其包含编码根据前述实施方案中任一项的蛋白质的核酸。
[0275]
36.一种宿主细胞，其包含根据前述实施方案中任一项的多核苷酸。
[0276]
37.一种治疗或预防受试者炎症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据前述实施方案中任一项的变体蛋白。
[0277]
38.根据前述实施方案的方法，其中所述变体蛋白的改变的角度小于野生型ebv-il10。
[0278]
39.根据前述实施方案中任一项的方法，其中与野生型ebv-il10相比，变体蛋白以中度亲和力与il10受体结合。
[0279]
40.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述炎症是炎性肠疾病(ibd)、克罗
恩病、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、银屑病、类风湿性关节炎、急性过敏性休克、和/或季节性变态反应。
[0280]
41.一种治疗或预防受试者自体免疫性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据前述实施方案中任一项的变体蛋白。
[0281]
42.根据前述实施方案的方法，其中所述变体蛋白的改变的角度小于野生型ebv-il10。
[0282]
43.根据前述实施方案中任一项的方法，其中与野生型ebv-il10相比，变体蛋白以中度亲和力与il10受体结合。
[0283]
44.一种治疗或预防受试者ibd或克罗恩病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据前述实施方案中任一项的变体蛋白。
[0284]
45.根据前述实施方案的方法，其中所述变体蛋白的改变的角度小于野生型ebv-il10。
[0285]
46.根据前述实施方案中任一项的方法，其中与野生型ebv-il10相比，变体蛋白以中度亲和力与il10受体结合。
[0286]
47.一种治疗或预防受试者非酒精性脂肪性肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1的变体蛋白。
[0287]
48.根据前述实施方案的方法，其中所述变体蛋白的改变的角度小于野生型ebv-il10。
[0288]
49.根据前述实施方案中任一项的方法，其中与野生型ebv-il10相比，变体蛋白以中度亲和力与il10受体结合。
[0289]
50.一种治疗或预防受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据前述实施方案中任一项的变体蛋白。
[0290]
51.根据前述实施方案的方法，其中所述变体蛋白的改变的角度大于野生型ebv-il10。
[0291]
52.根据前述实施方案中任一项的方法，其中与野生型ebv-il10相比，变体蛋白以增加的亲和力与il10受体结合。
[0292]
53.一种工程化的融合蛋白，其包含在融合蛋白的第一末端缀合的至少一个il-10或il-10变体分子的单体、在融合蛋白的第二末端缀合的至少一个细胞因子或其单体、以及接头或间隔物，
[0293]
其中接头或间隔物连接第一和第二末端。
[0294]
54.根据前述实施方案的融合蛋白，其中所述接头或间隔物是抗体的恒定区。
[0295]
55.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述恒定区源自iggl、igg2、igg3、igg4、iga、igm、igd或ige。
[0296]
56.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述接头或间隔物进一步包含至少两个链间二硫键。
[0297]
57.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述接头或间隔物是scfv、双抗体或其片段。
[0298]
58.前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述恒定区是重链恒定(ch)区1、ch2、ch3或其任意组合。
[0299]
59.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述至少一个il-10或il-10变体分子在融合蛋白的n-末端、c-末端或两者缀合。
[0300]
60.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中在另一末端缀合的至少一个细胞因子包括il-10、il-10变体分子il-6、il-4、il-1、il-2、il-3、il-5、il-7、il-8、il-9、il-15、il-26、il-27、il-28、il-29、gm-csf、g-csf、干扰素-α、-β、-γ、tgf-β或肿瘤坏死因子-α、-β、碱性fgf、egf、pdgf、il-4、il-11或il-13、或其任何组合。
[0301]
61.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含在融合蛋白的n-末端缀合的两个il-10或il-10变体分子、和在融合蛋白的c-末端缀合的两个il-10或il-10变体分子。
[0302]
62.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含在融合蛋白的n-末端缀合的两个il-10或il-10变体分子、和在融合蛋白的c-末端缀合的至少一个il-2分子。
[0303]
63.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中c-末端进一步包含il-6、il-4、il-1、il-2、il-3、il-5、il-7、il-8、il-9、il-15、il-26、il-27、il-28、il-29、gm-csf、g-csf、干扰素-α、-β、-γ、tgf-β或肿瘤坏死因子-α、-β、碱性fgf、egf、pdgf、il-4、il-11或il-13。
[0304]
64.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含在融合蛋白的n-末端缀合的两个il-10或il-10变体分子、和在融合蛋白的c-末端缀合的至少一个il-15分子。
[0305]
65.一种融合蛋白v，其中c-末端进一步包含il-6、il-4、il-1、il-2、il-3、il-5、il-7、il-8、il-9、il-15、il-26、il-27、il-28、il-29、gm-csf、g-csf、干扰素-α、-β、-γ、tgf-β、或肿瘤坏死因子-α、-β、碱性fgf、egf、pdgf、il-4、il-11、或il-13。
[0306]
66.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含在融合蛋白的n-末端缀合的两个il-10或il-10变体分子、和在融合蛋白的c-末端缀合的至少一个il-2分子。
[0307]
67.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中c-末端进一步包含il-10、il-10变体分子、il-6、il-4、il-1、il-2、il-3、il-5、il-7、il-8、il-9、il-15、il-26、il-27、il-28、il-29、gm-csf、g-csf、干扰素-α、-β、-γ、tgf-β或肿瘤坏死因子-α、-β、碱性fgf、egf、pdgf、il-4、il-11或il-13。
[0308]
68.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白在单链可变片段(scfv)支架上制备。
[0309]
69.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白在双抗体支架上制备。
[0310]
70.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白在fab支架上制备。
[0311]
71.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白与另一融合蛋白复合，所述另一融合蛋白质具有在融合蛋白的第一末端缀合的至少一个il-10或il-10变体分子的单体、在融合蛋白的第二末端缀合的至少一个细胞因子或其单体、以及接头或间隔物，其中接头或间隔物连接第一和第二末端。
[0312]
72.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据前述实施方案中任一项的工程化的融合蛋白。
[0313]
73.一种治疗或预防ibd或克罗恩病的方法，所述方法包括向受试者施用根据前述实施方案中任一项的工程化的融合蛋白。
[0314]
74.一种治疗或预防受试者的非酒精性脂肪性肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据前述实施方案中任一项的工程化的融合蛋白。
[0315]
75.一种激活cd8阳性t细胞的方法，所述方法包括施用根据前述实施方案中任一项的工程化的融合蛋白。
[0316]
76.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述施用是体外施用。
[0317]
77.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述施用是向有需要的受试者的体内施用，其中所述受试者已被诊断患有癌症、ibd或克罗恩病、或nafld或nash。
[0318]
78.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述融合蛋白包含在融合蛋白的第一末端的il-10或il-10变体分子、和在融合蛋白的第二末端的il-2和/或il-15。
[0319]
79.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用双特异性t细胞接合剂(bite)和il-10、il-10变体分子或包含il-10或il-10变体分子的工程化的融合蛋白。
[0320]
80.根据前述实施方案的方法，其中工程化的融合蛋白包含在融合蛋白的第一末端缀合的至少一个il-10或il-10变体分子、在融合蛋白的第二末端缀合的至少一个细胞因子、和接头或间隔物，其中所述接头或间隔物连接第一和第二末端。
[0321]
81.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述il-10、il-10变体分子或包含il-10或il-10变体分子的工程化的融合蛋白增加并维持t细胞受体复合物(cd3)信号传导。
[0322]
82.一种治疗或预防受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的编码变体il-10分子的核苷酸序列。
[0323]
83.根据前述实施方案的方法，其中所述核苷酸序列是dna、rna或其修饰的变体。
[0324]
84.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列是mrna或与核苷连接的修饰的mrna。
[0325]
85.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列能够在细胞、组织或生物体内体内表达变体il-10分子。
[0326]
86.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列通过细胞穿透肽、疏水部分、静电复合物、脂质体、配体、脂质体纳米颗粒、脂蛋白(优选hdl或ldl)、叶酸靶向脂质体、抗体(如叶酸受体、转铁蛋白受体)、靶向肽或通过适体递送至细胞、组织或生物体。
[0327]
87.一种治疗或预防受试者的自体免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的编码变体il-10分子的核苷酸序列。
[0328]
88.根据前述实施方案的方法，其中所述核苷酸序列是dna、rna或其修饰的变体。
[0329]
89.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列是mrna或与核苷连接的修饰的mrna。
[0330]
90.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列能够在细胞、组织或生物体内体内表达变体il-10分子。
[0331]
91.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列通过细胞穿透肽、疏水部分、静电复合物、脂质体、配体、脂质体纳米颗粒、脂蛋白(优选hdl或ldl)、叶酸靶向脂质体、抗体(如叶酸受体、转铁蛋白受体)、靶向肽或通过适体递送至细胞、组织或生物体。
[0332]
92.一种治疗或预防受试者的ibd或克罗恩病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的编码变体il-10分子的核苷酸序列。
[0333]
93.根据前述实施方案的方法，其中所述核苷酸序列是dna、rna或其修饰的变体。
[0334]
94.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列是mrna或与核苷连接的修饰的mrna。
[0335]
95.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列能够在细胞、组织或生物体内体内表达变体il-10分子。
[0336]
96.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列通过细胞穿透肽、疏水部分、静电复合物、脂质体、配体、脂质体纳米颗粒、脂蛋白(优选hdl或ldl)、叶酸靶向脂质体、抗体(如叶酸受体、转铁蛋白受体)、靶向肽或通过适体递送至细胞、组织或生物体。
[0337]
97.一种治疗或预防受试者的非酒精性脂肪性肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的编码变体il-10分子的核苷酸序列。
[0338]
98.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列是dna、rna或其修饰的变体。
[0339]
99.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列是mrna或与核苷连接的修饰的mrna。
[0340]
100.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列能够在细胞、组织或生物体内体内表达变体il-10分子。
[0341]
101.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述核苷酸序列通过细胞穿透肽、疏水部分、静电复合物、脂质体、配体、脂质体纳米颗粒、脂蛋白(优选hdl或ldl)、叶酸靶向脂质体、抗体(如叶酸受体、转铁蛋白受体)、靶向肽或通过适体递送至细胞、组织或生物体。
[0342]
102.一种融合蛋白，其包含与来自至少两个不同抗体的两个可变区连接的单体il-10分子或其变体，其中所述两个可变区被构型为来自第一抗体的重链可变(vh)区与来自第二抗体的轻链可变(vl)区连接，或来自第一抗体的vl与来自第二抗体的vh连接。
[0343]
103.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述单体il-10分子或其变体包括至少一个增加或降低对il-10受体的亲和力的氨基酸取代。
[0344]
104.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述单体il-10分子或其变体包括至少一个增加对il-10受体的亲和力的氨基酸取代。
[0345]
105.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述单体il-10分子或其变体是seq id no.：3的epstein barr病毒(ebv)il-10同源物。
[0346]
106.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述ebv il-10同源物包括在第31位、第75位或两者上的氨基酸取代。
[0347]
107.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述ebv-il-10同源物包括在第31位的氨基酸取代。
[0348]
108.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述ebv-il-10同源物包括在
第75位的氨基酸取代。
[0349]
109.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述ebv-il-10同源物包括在第31位和第75位的氨基酸取代。
[0350]
110.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述ebv-il-10同源物包括v31l氨基酸取代。
[0351]
111.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述ebv-il-10同源物包括a75i氨基酸取代。
[0352]
112.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述ebv-il-10同源物包括v31l和a75i氨基酸取代。
[0353]
113.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述第一抗体的vh区来自抗hiv单克隆抗体，并且所述第二抗体的vl区来自抗埃博拉单克隆抗体。
[0354]
114.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述第一抗体的vh区来自抗埃博拉单克隆抗体，并且所述第二抗体的vl区来自抗hiv单克隆抗体。
[0355]
115.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白是选自seq id no.：24-28、29、33-51、61、63、65或67的氨基酸序列。
[0356]
116.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白是双抗体。
[0357]
117.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自以下的构型：(a)第一抗体的vh区在其羧基末端连接至第二抗体的vl区的氨基末端，第二抗体的vl区随后连接至il-10单体或其变体的氨基末端；或
[0358]
(b)il-10分子或其变体在其羧基末端连接至第二抗体的vh区的氨基末端，第二抗体的vh区随后连接至第一抗体的vl区的氨基末端。
[0359]
118.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述构型(a)和(b)一起形成双抗体复合物。
[0360]
119.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其进一步包含位于vh区和vl区之间的接头。
[0361]
120.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述氨基酸序列选自seq id no：24-28、29、33-53、61、63、65、67。
[0362]
121.前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述第一抗体和第二抗体包含降低受试者中抗原性的一个或多个氨基酸取代。
[0363]
122.一种免疫缀合物复合物，其包含i)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白在其氨基末端包含第一抗体的重链可变区(vh)，其与第二抗体的轻链可变区(vl)连接，所述第二抗体的轻链可变区(vl)进一步与il-10单体或其变体连接；和ii)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白在其氨基末端包含il-10单体或其变体，其与第二抗体的vh连接，所述第二抗体的vh进一步与第一抗体的vl连接，其中所述第一和第二抗体的vh和vl结合成双抗体，并且所述il-10单体形成功能性二聚il-10分子。
[0364]
123.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述il-10单体包含至少一个增加或降低对il-10受体的亲和力的氨基酸取代。
[0365]
124.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述il-10分子包含至少一个增加对il-10受体的亲和力的氨基酸取代。
[0366]
125.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述il-10单体是seq id no.3的epstein barr病毒(ebv)il-10同源物。
[0367]
126.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv il-10同源物包含在第31位、第75位或两者上的氨基酸取代。
[0368]
127.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv-il-10同源物包含在第31位的氨基酸取代。
[0369]
128.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv-il-10同源物包含在第75位的氨基酸取代。
[0370]
129.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv-il-10同源物包含在第31位和第75位的氨基酸取代。
[0371]
130.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv-il-10同源物包含v31l氨基酸取代。
[0372]
131.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv-il-10同源物包含a75i氨基酸取代。
[0373]
132.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv-il-10同源物包含v31l和a75i氨基酸取代。
[0374]
133.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述第一抗体来自抗hiv单克隆抗体，并且所述第二抗体来自抗埃博拉单克隆抗体。
[0375]
134.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述第一融合蛋白是选自seq id no.：24、26、28、35、38、41、46、48或50的氨基酸序列。
[0376]
135.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述第二融合蛋白是选自seq id no.：25、27、29、36、39、42、47、49或51的氨基酸序列。
[0377]
136.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其进一步包含位于vh区和vl区之间的接头。
[0378]
137.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中第一融合蛋白中的il-10单体通过其氨基末端连接至vl区。
[0379]
138.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中第二融合蛋白中的il-10单体通过其羧基末端连接至vh区。
[0380]
139.前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述第一抗体和第二抗体包含降低受试者中抗原性的一个或多个氨基酸取代。
[0381]
140.一种双抗体，其包含第一肽链和第二肽链，所述第一肽链包含来自第一抗体的重链可变区(vh)、来自第二抗体的轻链可变区(vl)和单体il-10；所述第二肽链包含来自第二抗体的vh和vl、和单体il-10分子，其中第一抗体的vh区与第一抗体的vl区结合，第二抗体的vh区与第二抗体的vl区结合，从而允许在每条肽链上的单体il-10分子形成功能性il-10二聚体。
[0382]
141.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述单体il-10包含至少一个增加或降低对il-10受体的亲和力的氨基酸取代。
[0383]
142.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述单体il-10分子包含至少一个增加对il-10受体的亲和力的氨基酸取代。
[0384]
143.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述单体il-10分子是seq id no.3的epstein barr病毒(ebv)il-10同源物。
[0385]
144.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述ebv il-10同源物包含第31位、第75位或两者上的氨基酸取代。
[0386]
145.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述ebv-il-10同源物包含在第31位的氨基酸取代。
[0387]
146.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述ebv-il-10同源物包含在第75位的氨基酸取代。
[0388]
147.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述ebv-il-10同源物包含在第31位和第75位的氨基酸取代。
[0389]
148.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述ebv-il-10同源物包含v31l氨基酸取代。
[0390]
149.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述ebv-il-10同源物包含a75i氨基酸取代。
[0391]
150.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述ebv-il-10同源物包含v31l和a75i氨基酸取代。
[0392]
151.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述第一抗体来自抗hiv单克隆抗体，并且所述第二抗体来自抗埃博拉单克隆抗体。
[0393]
152.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述第一肽链是选自seq id no.：24、26、28、35、38、41、46、48或50的氨基酸序列。
[0394]
153.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述第二肽链是选自seq id no.：25、27、29、36、39、42、47、49、或51的氨基酸序列。
[0395]
154.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其进一步包含位于vh区和vl区之间的接头。
[0396]
155.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述第一抗体和第二抗体包含降低受试者中抗原性的一个或多个氨基酸取代。
[0397]
156.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述il-10单体通过其羧基末端连接至所述第一和第二肽链。
[0398]
157.根据前述实施方案中任一项的双抗体，其中所述第一抗体和第二抗体包含降低受试者中抗原性的一个或多个氨基酸取代。
[0399]
158.一种免疫缀合物复合物，其包含i)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白在其氨基末端包含第一抗体的重链可变(vh)区和通过其氨基末端连接的单体il-10分子；和ii)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白在其氨基末端包含il-10单体，其与第一抗体的轻链可变区(vl)连接，其中第一抗体的vh区与第一抗体的vl区结合从而允许在每条肽链上的单体il-10分子形成功能性il-10二聚体。
[0400]
159.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述il-10单体包含至少一个增加或降低对il-10受体的亲和力的氨基酸取代。
[0401]
160.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述il-10分子包含至少一个增加对il-10受体的亲和力的氨基酸取代。
[0402]
161.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述il-10单体是seq id no.3的epstein barr病毒(ebv)il-10同源物。
[0403]
162.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv il-10同源物包含在第31位、第75位或两者上的氨基酸取代。
[0404]
163.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv-il-10同源物包含在第31位的氨基酸取代。
[0405]
164.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv-il-10同源物包含在第75位的氨基酸取代
[0406]
165.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv-il-10同源物包含在第31位和第75位的氨基酸取代。
[0407]
166.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv-il-10同源物包含v31l氨基酸取代。
[0408]
167.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv-il-10同源物包含a75i氨基酸取代。
[0409]
168.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述ebv-il-10同源物包含v31l和a75i氨基酸取代。
[0410]
169.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述第一抗体的vh和vl区来自抗表皮生长因子受体(egfr)单克隆抗体。
[0411]
170.前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述第一融合蛋白进一步包含来自第二抗体的vl区，其将第一抗体的vh区与单体il-10连接，并且其中所述第二融合蛋白进一步包含来自第二抗体的vh区，其将单体il-10与vl区连接。
[0412]
171.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述第二抗体的vh和vl区来自抗埃博拉单克隆抗体。
[0413]
172.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述可变区通过接头连接至il-10单体。
[0414]
173.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述第一抗体和第二抗体包含降低受试者中抗原性的一个或多个氨基酸取代。
[0415]
174.根据前述实施方案中任一项的免疫缀合物复合物，其中所述第一抗体和第二抗体包含降低受试者中抗原性的一个或多个氨基酸取代。
[0416]
175.一种融合蛋白，其包含与il-10单体融合的第一抗体的可变轻(vl)和可变重(vh)区，其中il-10单体彼此直接连接。
[0417]
176.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述il-10单体从第一il-10单体的羧基末端连接至第二il-10单体的氨基末端。
[0418]
177.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白以氨基到羧基末端的方式包含以下构型：所述第一抗体的vl区连接至第一il-10单体，所述第一il-10单体连接至第二il-10单体，所述第二il-10单体连接至第一抗体的vh区。
[0419]
178.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其进一步包含与所述第一抗体的vl区的氨基末端连接的第二抗体的vh区、和与所述第一抗体的vh区的羧基末端连接的第二抗体的vl区。
[0420]
179.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述il-10单体各自包含至少一个增加或降低对il-10受体的亲和力的氨基酸取代。
[0421]
180.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述il-10单体各自包含至少一个增加对il-10受体的亲和力的氨基酸取代。
[0422]
181.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述il-10单体是seq id no.：3的epstein barr病毒(ebv)il-10同源物。
[0423]
182.根据权利要求181的融合蛋白，其中ebv il-10同源物包含在第31位、第75位或两者上的氨基酸取代。
[0424]
183.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述ebv-il-10同源物包含在第31位的氨基酸取代。
[0425]
184.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述ebv-il-10同源物包含在第75位的氨基酸取代。
[0426]
185.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述ebv-il-10同源物包含v31l氨基酸取代。
[0427]
186.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述ebv-il-10同源物包含a75i氨基酸取代。
[0428]
187.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述第一抗体是抗埃博拉单克隆抗体。
[0429]
188.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述第一抗体是抗表皮生长因子受体(egfr)单克隆抗体。
[0430]
189.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述第一抗体是抗埃博拉单克隆抗体，并且所述第二抗体是抗egfr单克隆抗体。
[0431]
190.一种治疗有需要的患者的疾病、病患或病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的epstein barr病毒(ebv)il-10免疫缀合物复合物，其中所述免疫缀合物复合物的分子量为约60至155kda，其中所述治疗有效量在约0.5微克/千克至100微克/千克的范围内，并且其中所述免疫缀合物的ebv il-10部分来自seq id no.：3。
[0432]
191.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述免疫缀合物复合物每月、每两个月、每周、每周两次、每周三次或每天施用。
[0433]
192.根据前述实施方案中任一项的方法，其中变体ebv il-10是包含至少一个增加或降低与il-10受体结合的氨基酸取代的变体。
[0434]
193.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述变体ebv il-10包含在seq id no.：3的第31位、第75位或两者上的氨基酸取代。
[0435]
194.根据前述实施方案中任一项的方法，其中变体ebv il-10包含v31l氨基酸取代。
[0436]
195.根据前述实施方案中任一项的方法，其中ebv il-10包含a75i氨基酸取代。
[0437]
196.根据前述实施方案中任一项的方法，其中ebv il-10包含v31l和a75i氨基酸取代。
[0438]
197.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述免疫缀合物复合物是两个融合蛋白的复合物。
[0439]
198.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述免疫缀合物复合物包含i.第一融合蛋白，所述第一融合蛋白在其氨基末端包含第一抗体的重链可变区(vh)，其与第二抗体的轻链可变区(vl)连接，所述第二抗体的轻链可变区(vl)进一步与ebv il-10单体的羧基末端连接；和ii.第二融合蛋白，所述第二融合蛋白在其氨基末端包含ebv il-10单体，其与第二抗体的vh连接，所述第二抗体的vh进一步与第一抗体的vl连接，其中所述第一和第二抗体的vh和vl结合成双抗体，并且所述ebv il-10单体形成功能性二聚ebv il-10分子。
[0440]
199.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一抗体和所述第二抗体是不同的抗体。
[0441]
200.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一抗体是抗hiv单克隆抗体，并且所述第二抗体是抗埃博拉单克隆抗体。
[0442]
201.根据权利要求202的方法，其中所述融合蛋白是选自seq id no：24-51的氨基酸序列。
[0443]
202.根据权利要求202的方法，其中所述第一融合蛋白是选自seq id no：24、26、28、35、38、41、46、48或50的氨基酸序列。
[0444]
203.根据权利要求202的方法，其中所述第二融合蛋白是选自seq id no.：25、27、29、36、39、42、47、49或51的氨基酸序列。
[0445]
204.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述免疫缀合物复合物是双抗体，其包含融合在任意末端的ebv il-10单体，其中所述ebv il-10单体能够结合成功能性ebv il-10二聚体。
[0446]
205.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述疾病、病患或病症选自癌症、炎性疾病、自体免疫性疾病或胆固醇。
[0447]
206.根据前述实施方案中任一项的方法，其中基于至少每2至3天施用，所述ebv il-10免疫缀合物复合物以足以维持稳定的il-10血清浓度的量施用。
[0448]
207.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述免疫缀合物能够抑制tnfα分泌和诱导ifnγ以与野生型il-10相似的浓度产生。
[0449]
208.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述ebv il-10免疫缀合物复合物具有与野生型il-10相似的活性。
[0450]
209.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述免疫缀合物复合物包含
[0451]
(a)在n-末端的第一抗体的vh区，其与第二抗体的vl区连接，该第二抗体的vl区与il-10分子的羧基末端连接；和
[0452]
(b)il-10分子，其与第二抗体的vh区连接，该第二抗体的vh区与第一抗体的vl区连接。
[0453]
210.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用双抗体，所述双抗体包含第一肽链和第二肽链，所述第一肽链具有来自第一抗体的重链可变区(vh)、来自第二抗体的轻链可变区(vl)和单体il-10分子；所述第二肽链具有来自第二抗体的vh和vl、和单体il-10分子，其中第一抗体的vh区与第一抗体的vl区结合，第二抗体的vh区与第二抗体的vl区结合，从而允许在每条肽链上的单体il-10分子形成功能性il-10二聚体。
[0454]
211.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述单体il-10是seq id no.：3的
epstein barr病毒(ebv)il-10同源物。
[0455]
212.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述ebv il-10包含在seq id no.：3的第31位的氨基酸取代。
[0456]
213.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述ebv il-10包含v31l氨基酸取代。
[0457]
214.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一抗体的vh区来自抗hiv单克隆抗体，并且所述第二抗体的vl区来自抗埃博拉单克隆抗体。
[0458]
215.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一肽链是选自seq id no.：28、35、38、46的氨基酸序列。
[0459]
216.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第二肽链是选自seq id no.：29、36、39、47的氨基酸序列。
[0460]
217.根据前述实施方案中任一项的方法，其进一步包含位于vh区和vl区之间的接头。
[0461]
218.根据前述实施方案中任一项的方法，其中vh和vl各自包含一个或多个降低患者中抗原性的氨基酸取代。
[0462]
219.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一抗体来自抗hiv单克隆抗体，并且所述第二抗体来自抗埃博拉单克隆抗体。
[0463]
220.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述双抗体由具有以下氨基至羧基末端构型的两条肽链形成：(a)第一肽，其包含第一抗体的vh区，其与第二抗体的vl区连接，然后所述第二抗体的vl区连接至il-10单体或其变体的氨基末端；和
[0464]
(b)第二肽，其包含il-10单体，其与第二抗体的vh区连接，然后所述第二抗体的vh区与第一抗体的vl区连接。
[0465]
221.一种在有需要的患者中治疗胆固醇的方法，所述方法包括向所述患者施用降低胆固醇量的双抗体，所述双抗体包含第一肽链和第二肽链，所述第一肽链具有来自第一抗体的重链可变区(vh)、来自第二抗体的轻链可变区(vl)和单体il-10；所述第二肽链具有来自第二抗体的vh和vl、和单体il-10分子，其中第一抗体的vh区与第一抗体的vl区结合，第二抗体的vh区与第二抗体的vl区结合，从而允许在每条肽链上的单体il-10分子形成功能性il-10二聚体。
[0466]
222.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述单体il-10是seq id no.：3的epstein barr病毒(ebv)il-10同源物。
[0467]
223.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述ebv il-10包含在seq id no.：3的第31位的氨基酸取代。
[0468]
224.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述ebv il-10包含v31l氨基酸取代。
[0469]
225.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一抗体的vh区来自抗hiv单克隆抗体，并且所述第二抗体的vl区来自抗埃博拉单克隆抗体。
[0470]
226.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一肽链是选自seq id no.：24或50的氨基酸序列。
[0471]
227.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第二肽链是选自seq id no.：
25或51的氨基酸序列。
[0472]
228.根据前述实施方案中任一项的方法，其进一步包含位于vh区和vl区之间的接头。
[0473]
229.根据前述实施方案中任一项的方法，其中vh和vl各自包含一个或多个降低患者中抗原性的氨基酸取代。
[0474]
230.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一抗体来自抗hiv单克隆抗体，并且所述第二抗体来自抗埃博拉单克隆抗体。
[0475]
231.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述双抗体由具有以下氨基至羧基末端构型的两条肽链形成：
[0476]
(a)第一肽，其包含第一抗体的vh区，其与第二抗体的vl区连接，然后所述第二抗体的vl区连接至il-10单体或其变体的氨基末端；和
[0477]
(b)第二肽，其包含il-10单体或其变体，其与第二抗体的vh区连接，然后所述第二抗体的vh区与第一抗体的vl区连接。
[0478]
232.一种在有需要的患者中治疗非酒精性脂肪性肝炎(nash)或非酒精性脂肪性肝病(nafld)的方法，所述方法包括向所述患者施用nash或nafld量的双抗体，所述双抗体包含第一肽链和第二肽链，所述第一肽链具有来自第一抗体的重链可变区(vh)、来自第二抗体的轻链可变区(vl)和单体il-10；所述第二肽链具有来自第二抗体的vh和vl、和单体il-10分子，其中第一抗体的vh区与第一抗体的vl区结合，第二抗体的vh区与第二抗体的vl区结合，从而允许在每条肽链上的单体il-10分子形成功能性il-10二聚体。
[0479]
233.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述单体il-10是seq id no.：3的epstein barr病毒(ebv)il-10同源物。
[0480]
234.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述ebv il-10包含在seq id no.：3的第31位的氨基酸取代。
[0481]
235.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述ebv il-10包含v31l氨基酸取代。
[0482]
236.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一抗体的vh区来自抗hiv单克隆抗体，并且所述第二抗体的vl区来自抗埃博拉单克隆抗体。
[0483]
237.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一肽链是选自seq id no.：24或50的氨基酸序列。
[0484]
238.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第二肽链是选自seq id no.：25或51的氨基酸序列。
[0485]
239.根据前述实施方案中任一项的方法，其进一步包含位于vh区和vl区之间的接头。
[0486]
240.根据前述实施方案中任一项的方法，其中vh和vl各自包含一个或多个降低患者中抗原性的氨基酸取代。
[0487]
241.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一抗体来自抗hiv单克隆抗体，并且所述第二抗体来自抗埃博拉单克隆抗体。
[0488]
242.一种在有需要的患者中治疗炎症的方法，所述方法包括向所述患者施用抗炎量的双抗体，所述双抗体包含第一肽链和第二肽链，所述第一肽链具有来自第一抗体的重
链可变区(vh)、来自第二抗体的轻链可变区(vl)和单体il-10；所述第二肽链具有来自第二抗体的vh和vl、和单体il-10分子，其中第一抗体的vh区与第一抗体的vl区结合，第二抗体的vh区与第二抗体的vl区结合，从而允许在每条肽链上的单体il-10分子形成功能性il-10二聚体。
[0489]
243.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述单体il-10是seq id no.：3的epstein barr病毒(ebv)il-10同源物。
[0490]
244.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述ebv il-10包含在seq id no.：3的第75位的氨基酸取代。
[0491]
245.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述ebv il-10包含v31l氨基酸取代。
[0492]
246.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一抗体的vh区来自抗hiv单克隆抗体，并且所述第二抗体的vl区来自抗埃博拉单克隆抗体。
[0493]
247.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一肽链是选自seq id no.：26、41或48的氨基酸序列。
[0494]
248.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第二肽链是选自seq id no.：27、42、49的氨基酸序列。
[0495]
249.根据前述实施方案中任一项的方法，其进一步包含位于vh区和vl区之间的接头。
[0496]
250.根据前述实施方案中任一项的方法，其中vh和vl各自包含一个或多个降低患者中抗原性的氨基酸取代。
[0497]
251.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述第一抗体来自抗hiv单克隆抗体，并且所述第二抗体来自抗埃博拉单克隆抗体。
[0498]
252.一种式(i-vii)的融合蛋白
[0499]
il10-l
1-x
1-l
1-x
2-l
1-il10(式i)；(z)
n-x
1-l
2-y
2-l
1-il10(式ii)；il10-l
1-y
1-l
2-x
2-(z)
n(
式iii)；x
1-l
2-x
2-l
1-il10(式iv)；il10-l
1-x
1-l
2-x2(式v)；x
1-l
1-il10(式vi)；il10-l
1-x2(式vii)；或其任意组合，
[0500]
其中
[0501]“il-10”是选自seq id no：1、3、14、18、15、19、16、20、55、57或59的单体序列；更优选地，“il-10”由seq id no:55、57或59组成；
[0502]“l
1”是seq id no：31或54的接头；
[0503]“l
2”是seq id no：30的接头；
[0504]“x
1”是来自第一抗体的vh区，所述第一抗体对以下具有特异性：表皮生长因子受体(egfr)；cd52；各种免疫检查点靶标，例如但不限于pd-l1、pd-1、tim3、btla、lag3或ctla4；cd20；cd47；gd-2；her2；epcam；icam(icam-1、-2、-3、-4、-5)、vcam、fapα；5t4；trop2；edb-fn；tgfβtrap；madcam、β7整合素亚基；α4β7整合素；α4整合素sr-a1；sr-a3；sr-a4；sr-a5；sr-a6；sr-b；dsr-c1；sr-d1；sr-e1；sr-f1；sr-f2；sr-g；sr-h1；sr-h2；sr-i1；sr-j1；hiv或埃博拉；
[0505]“x
2”是从与x1相同的抗体获得的vl区；
[0506]“y
1”是来自第二抗体的vh区，所述第二抗体对以下具有特异性：表皮生长因子受
体(egfr)；cd52；各种免疫检查点靶标，例如但不限于pd-l1、pd-1、tim3、btla、lag3或ctla4；cd20；cd47；gd-2；her2；epcam；icam(icam-1、-2、-3、-4、-5)、vcam、fapα；5t4；trop2；edb-fn；tgfβtrap；madcam、β7整合素亚基；α4β7整合素；α4整合素sr-a1；sr-a3；sr-a4；sr-a5；sr-a6；sr-b；dsr-c1；sr-d1；sr-e1；sr-f1；sr-f2；sr-g；sr-h1；sr-h2；sr-i1；sr-j1；hiv或埃博拉；
[0507]“y
2”是从y1相同的抗体获得的vl区；
[0508]
其中x和y来自相同或不同的抗体；
[0509]“z”是细胞因子，其选自il-10、il-10变体分子、il-6、il-4、il-1、il-2、il-3、il-5、il-7、il-8、il-9、il-15、il-26、il-27、il-28、il-29、gm-csf、g-csf、干扰素-α、-β、-γ、tgf-β、或肿瘤坏死因子-α、-β、碱性fgf、egf、pdgf、il-4、il-11、或il-13；
[0510]“n”是选自0-2的整数。
[0511]
253.根据前述实施方案的融合蛋白，其中式ii和iii能够形成融合蛋白复合物，其中来自式ii和iii中的每一个的il-10单体能够形成功能性同源二聚体il-10或其变体。
[0512]
254.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中式ii是seq id no：24、26、28、41、48或50。
[0513]
255.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中式iii是seq id no：25、27、29、42、49或51。
[0514]
256.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中在seq id no：24和25；26和27、28和29；41和42；48和49；或50和51之间形成融合蛋白复合物。
[0515]
257.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中式iv和v能够形成融合蛋白复合物，其中来自式iv和v中的每一个的il-10单体能够形成功能性同源二聚体il-10或其变体。
[0516]
258.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中式iv是seq id no：35、38、46、48或50。
[0517]
259.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中式v是seq id no：36、39、47、49或51。
[0518]
260.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中在seq id no：35和36；38和39、46和47；48和49；或50和51之间形成融合蛋白复合物。
[0519]
261.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中式vi和vii能够形成融合蛋白复合物，其中来自式vi和vii中的每一个的il-10单体能够形成功能性同源二聚体il-10或其变体。
[0520]
262.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中式i是seq id no：33-34、40、43-44、45、52、53、61、63、65或67。
[0521]
263.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中“n”≥1，z是il-2、il-7、il-12、il-15或其任何组合。
[0522]
264.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中z缀合到x1、y1或两者的n-末端。
[0523]
265.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含根据前述实施方案中任一项的融合蛋白的组合物。
[0524]
266.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述融合蛋白是seq id no：28-29、
35-36、38-39、46-47、52、53、61、63、65或67。
[0525]
267.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述融合蛋白形成蛋白质复合物，并且所述蛋白质复合物在seq id no:28和29；35和36；38和39；或46和47之间形成。
[0526]
268.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述组合物包含seq id no：33、34、44、52或53、61、63、65或67的融合蛋白。
[0527]
269.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述融合蛋白包含由seq id no.59的dv07组成的il-10。
[0528]
270.一种治疗炎性疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含根据前述实施方案中任一项的融合蛋白的组合物。
[0529]
271.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述融合蛋白是seq id no：26-27、41-42、48或49。
[0530]
272.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述融合蛋白形成蛋白复合物，并且所述蛋白质复合物在seq id no:26和27；41和42；48和49之间形成。
[0531]
273.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述组合物包含seq id no：37、40或43的融合蛋白。
[0532]
274.根据权利要求18的方法，其中所述融合蛋白包含由seq id no.57的dv06组成的il-10。
[0533]
275.一种治疗基于脂质疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含根据前述实施方案中任一项的融合蛋白的组合物。
[0534]
276.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述融合蛋白是seq id no：24-25、50或51。
[0535]
277.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述融合蛋白形成蛋白质复合物，并且所述蛋白质复合物在seq id no:24和25；和50和51之间形成。
[0536]
278.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述组合物包含seq id no:45的融合蛋白。
[0537]
参考文献
[0538]
asadullah,k.(1999).interleukin 10 treatment of psoriasis:clinical results of a phase 2 trial.archives dermantology,187-192.
[0539]
berman,r.m.(1996).systemic administration of cellular il-10 induces an effective specific and long-lived immune response against established tumors in mice.journal of immunology,231-238.
[0540]
blum,a.m.(2003).cd4 t cells from il-10-deficient mice transfer susceptibility to nsaid-induced rag colitis.american journal of physiology,g320-g325.
[0541]
chan,i.h.(2015).the potentiation of ifng and induction of cytotoxic proteins by pegylated il-10 in human cd8 t cells.journal of interferon and cytokine research.
[0542]
chan,i.h.(2016).peg-ril-10 treatement decreases foxp3 t regs despite upregulation of intratumoral ido.oncoimmunology.
for mast cells and their progenitors.journal of experimental medicine,507-510.
[0576]
tilg,h.(2002).treatment of crohn's disease with recombinant human interleukin 10 induces the proinflammatory cytokine interferon gamma.gut,191-195.
[0577]
vieira,p.(1991).isolation and expression of human cytokine synthesis inhibitory factor cdna clones homology to epstein barr virus open reading frame bcrf1.pnas,1172-1176.
[0578]
yoon,s.i.(2005).same structure different function crystal structure of the epstein barr virus il-10 bound to the soluble il-10r1 chain.structure,551-564.
[0579]
yoon,s.i.(2012).epstein-barr virus il-10 engages il-10r1 by a two-step mechanism leading to altered signaling properties.journal of biological chemistry.
[0580]
zheng,l.(1996).interleukin 10 inhibits tumor metastasis through an nk cell-dependent mechanism.journal of experimental medicine,579-584.
[0581]
zhu,l.(2017).il-10 and il-10 receptor mutations in very early onset inflammatory bowel disease.gastroenterology research,65-69.
[0582]
zigmond,e.(2014).macrophage-restricted interkeukin-10 receptor deficiency,but not il-10 deficiency,causes severe spontaneous colitis.cell.