用于从废弃银杏果外种皮中同时分离提取多种活性成分的两相深共熔溶剂及其提取方法与流程

1.本发明属于农林废弃生物资源的高值化利用，具体涉及一种用于从废弃银杏果外种皮中同时分离提取多种活性成分的两相深共熔溶剂及其提取方法。


背景技术：

2.银杏(ginkgo biloba l.)是银杏科、银杏属植物。银杏为中生代孑遗的稀有树种，系中国特产，仅浙江天目山有野生状态的树木。银杏为速生珍贵的用材树种，可供建筑、家具、室内装饰、雕刻、绘图版等用。银杏果可供食用及药用。银杏叶可作药用和制杀虫剂，亦可作饲料、肥料。
3.银杏的现代医学研究起源于1928年，其中银杏叶已被德国schwabe公司开发出多种治疗心血管疾病的药物，如egb761。但银杏果特别是其外种皮一直没有得到很好的开发利用。目前每年大量干银杏果外种皮被废弃，不仅造成资源浪费，还污染环境。近年来许多研究表明，银杏果外种皮也具有与银杏叶中相同的活性成分，如银杏黄酮、萜内酯、原花青素、银杏酚酸等。
4.研究表明，银杏黄酮类化合物具有一定抗氧化、保护神经、改善认知、抑菌等功能。银杏萜内酯化合物是银杏特有的成分，目前在其它植物中尚未发现。银杏萜内酯属于萜类化合物，主要包括银杏内酯a、b、c、j、m和白果内酯，其中银杏内酯a、b、c、j、m属于二萜类化合物，白果内酯为倍半萜化合物。大量研究表明银杏内酯对神经功能和脑缺血损伤具有保护作用。原花青素具有抗高血压、内皮依赖性血管舒张活性、抗缺血-再灌注损伤、抗动脉粥样硬化、抗血小板凝集等功效，对急性肾功能衰竭也具有显著的保护作用。
5.银杏酚酸(ginkgolic acids,gas)属漆酚类物质，是一类6-烷基或6-烯基水杨酸衍生物，侧链通常为13～17个碳原子，侧链双键数为0～2个，主要含有五种成分：白果新酸(c13:0)、白果酸(c15:1)、氢化白果酸(c15:0)、十七烷二烯银杏酸(c17:2)和十七烷一烯银杏酸(c17:1)。目前，银杏酚酸对于银杏叶制剂来说是不利成分，可引起细胞毒性、胚胎毒性、致敏、抑制酶系统以及轻微神经毒性等。但近些年也有大量研究表明银杏酚酸具有一定的药理作用，如杀菌作用、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等，可用于杀虫剂、化妆品等领域。
6.由于银杏黄酮、萜内酯、原花青素具有亲水性，而银杏酚酸具有疏水性。因此，以往的提取方法都是使用大量不同有机溶剂将亲水性成分和疏水性成分分别或分步提取，这样不仅增加了提取步骤和操作复杂性，而且会造成活性成分的浪费，提高提取成本。此外，传统的有机溶剂易挥发、易残留，对环境和人体造成危害。现有技术中公开了一种提取银杏叶活性成分的两相深共熔溶剂(cn107789376a)，其以银杏叶为原料，采用特定的两相深共熔溶剂提取银杏叶中多种活性成分，包括黄酮、萜内酯、原花青素、聚异戊烯醇乙酸酯。但是如何从废弃的银杏果外种皮中提取其中多种活性成分现有技术中没有报道，因此，寻找一种绿色、安全、高效、同时分离提取银杏果外种皮中活性成分的方法非常有必要。


技术实现要素：

7.发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种两相深共熔溶剂用于同时提取废弃银杏果外种皮中多种活性成分，疏水性成分银杏酚酸富集在上相疏水相中，亲水性成分银杏黄酮、萜内酯和原花青素富集在下相亲水相中。
8.本发明提供的两相深共熔溶剂作为绿色溶剂具有制备简单、氢键稳定、易生物降解、安全无污染等特点，可以绿色安全高效地同步提取并且分离银杏果外种皮中的银杏酚酸、黄酮、萜内酯和原花青素，解决了现有方法存在的有机溶剂使用量大、操作复杂、成本高、效率低等一系列问题。
9.本发明还提供了该两相深共熔溶剂的制备方法及利用该两相深共熔溶剂提取废弃银杏果外种皮活性成分的方法。
10.技术方案：为了实现上述目的，本发明一种用于从废弃银杏果外种皮中同时分离提取多种活性成分的两相深共熔溶剂，由疏水相和亲水相按体积比1:9～9:1组成；所述疏水相是薄荷醇、己醇和月桂酸按照摩尔比2.5:0.8:0.2～1:2:0.5制备成的疏水性深共熔溶剂des-u；所述亲水相由des-d和水组成，其中含水量为40％～70％(质量百分比)，所述des-d是以摩尔比1:1:1～3:2:1的氯化胆碱、柠檬酸和乙二醇制备而成的亲水性深共熔溶剂。
11.作为优选，所述疏水相和亲水相的体积比为2:8～8:2。
12.进一步地，所述两相深共熔溶剂中疏水相和亲水相的体积比为8:2，所述des-u是由薄荷醇、己醇和月桂酸按照摩尔比1:1.6:0.4制备而成，所述des-d是由氯化胆碱、柠檬酸和乙二醇按照摩尔比3:2:1制备而成，所述亲水相中des-d占总质量的55％，水占总质量的45％。
13.本发明所述的两相深共熔溶剂的制备方法，包括如下步骤：
14.(1)按摩尔比称取薄荷醇、己醇和月桂酸并混合均匀，加热搅拌，直至形成均一透明液体，即为疏水深共熔溶剂des-u，作为两相深共熔溶剂的疏水相；
15.(2)按摩尔比称取氯化胆碱、柠檬酸和乙二醇并混合均匀，加热搅拌，直至形成均一透明液体，作为亲水相中的des-d，将des-d和水混合作为两相深共熔溶剂的亲水相；
16.(3)将疏水相和亲水相按体积比混合，静置后分层，即得两相深共熔溶剂。
17.本发明所述的两相深共熔溶剂同时分离提取废弃银杏果外种皮中活性成分的方法，包括如下步骤：
18.(1)将两相深共熔溶剂置于提取容器中，精确称取银杏果外种皮干燥粉末加入提取容器中的两相深共熔溶剂中，混合均匀；
19.(2)混匀后加热提取，提取结束后离心，两相体系分离，上相为疏水相，下相为亲水相，分别取疏水相和亲水相检测其中银杏酚酸、萜内酯、黄酮和原花青素的含量；其中，步骤(1)所述的废弃银杏果外种皮干燥粉末和两相深共熔溶剂的质量体积比为1:10～1:50g/ml。
20.作为优选的质量体积比为1:30g/ml。
21.其中，步骤(2)所述加热提取为振荡加热提取或搅拌加热提取。
22.其中，步骤(2)所述振荡或搅拌的转速为100～300rpm，温度为25～50℃，时间为5～55min。
23.优选的转速为220rpm，温度为30℃，时间为40min。
24.其中，步骤(2)所述离心温度为室温，离心力2000～6000g，离心时间为3～7min。
25.作为优选，离心力为3000g，离心时间5min。
26.其中，提取后从疏水相中回收银杏酚酸，从亲水相中回收萜内酯、黄酮和原花青素，回收方法为液液萃取法、大孔树脂吸附法或反溶剂法中的一种或多种。优选采用大孔树脂吸附法。
27.其中，所述从疏水相中回收所得产品为银杏酚酸，从亲水相中回收所得产品为萜内酯或黄酮或原花青素或萜内酯、黄酮和原花青素混合物。
28.本发明中原料为废弃的银杏果外种皮，其与银杏叶有诸多不同：首先，组织结构和主要成分不同，银杏叶是银杏树的营养器官，组织结构紧密牢固，主要成分中含较多的纤维素、半纤维素、木质素，而银杏果外种皮为银杏树生殖器官果实的一部分，成熟的果实外种皮组织结构松软，主要成分中含较多果胶、粗脂肪；其次，所含生物活性成分不尽相同，尽管外种皮与银杏叶亲水性活性成分大致相同，但是疏水性活性成分不同，银杏果外种皮中的疏水性活性成分主要是银杏酚酸，而银杏叶中主要是聚异戊烯醇乙酸酯。
29.采用现有技术中的两相深共熔溶剂无法同时提取废弃银杏果外种皮中的有效成分。主要因为：(1)现有技术中的疏水相是根据提取聚异戊烯醇乙酸酯的需要进行定向设计制备而成，聚异戊烯醇乙酸酯是长链脂肪醇的酯，本发明中待分离的银杏酚酸是芳香族酸，其结构不同于聚异戊烯醇乙酸酯，不能简单使用现有技术中的疏水相进行两相体系构建，必须针对提取银杏酚酸的需要进行定向设计制备；(2)现有技术两相构建时较多地考虑深共熔溶剂对纤维素、半纤维素、木质素的溶胀、溶解，本专利中要更多地考虑对银杏果外种皮中的果胶、脂类的溶解。因此，现有技术中的两相深共熔溶剂直接用于提取废弃银杏果外种皮中的活性成分是不现实的。
30.本发明主要目的是构建双相深共熔溶剂体系同时提取银杏果外种皮中的多种活性成分。为了达到这一目的，设计双相深共熔溶剂时，既要考虑所选用于制备深共熔溶剂的组分对银杏果外种皮主要组分果胶、粗脂肪类的崩解或溶解能力，还要考虑对银杏酚酸和萜内酯、黄酮和原花青素的选择性定向富集能力。实际实验优化中通过制备深共熔溶剂的组分筛选、摩尔比优化，获得了可以同时高效提取银杏果外种皮中多种活性成分的疏水深共熔溶剂和亲水深共熔溶剂，并实现了亲水活性成分和疏水活性成分的定向富集。
31.本发明中疏水-亲水双相深共熔溶剂的疏水相对外种皮中疏水粗脂肪类具有溶解作用，亲水相对外种皮中的亲水果胶具有崩解作用，由于粗脂肪的溶解、果胶的崩解，有利于胞内生物活性成分的释放，从而达到了高效提取的目的；疏水-亲水双相深共熔溶剂的疏水相和亲水相通过组分筛选、摩尔比优化、两相比例优化，达到了疏水相对银杏酚酸的相似相容，亲水相对萜内酯、黄酮和原花青素最大程度的相似相容，从而实现了亲水活性成分和疏水活性成分的定向富集和高效分离。
32.本发明最终目的在于同时分离提取银杏果外种皮中的多种活性成分，其中疏水性成分银杏酚酸富集在疏水相中，而亲水性成分萜内酯、黄酮和原花青素富集在亲水相中。本发明设计疏水-亲水两相深共熔溶剂，既能高效地溶解或崩解银杏果外种皮组织结构，有利于活性成分游离释放，从而达到高效提取，又能最大程度地达到对疏水、亲水活性成分的相似相容，从而实现高效分离、定向富集。
33.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
34.(1)本发明制备的两相深共熔溶剂制备原料多采用天然来源的化合物，具有绿色安全、可生物降解等优点。
35.(2)本发明制备的两相深共熔溶剂为绿色溶剂，具有与离子液体相似的化学性质，且制备方法简单、具有绿色安全等优点。
36.(3)本发明制备的疏水-亲水双相深共熔溶剂的疏水相对外种皮中疏水粗脂肪类具有溶解作用，亲水相对外种皮中的亲水果胶具有崩解作用，粗脂肪的溶解、果胶的崩解，有利于胞内生物活性成分的游离释放，从而达到了高效提取的目的。
37.(4)本发明制备的两相深共熔溶剂，其疏水相由薄荷醇、己醇和月桂酸组成，亲水相由氯化胆碱、柠檬酸、乙二醇和水组成，通过优化两相中各物质的摩尔比来调节其极性，使疏水相的极性更接近于银杏酚酸、亲水相的极性更接近于萜内酯、黄酮和原花青素，从而达到银杏酚酸富集在疏水相，银杏黄酮、萜内酯、原花青素富集在亲水相的目的。
38.(5)采用本发明制备的两相深共熔溶剂可以达到同时分离提取银杏果外种皮中多种活性成分的目的，操作简单、提取效率高、绿色安全，为银杏果外种皮开发利用提供新思路，减少银杏果外种皮的浪费、保护环境。
附图说明
39.图1为银杏酚酸的高效液相色谱图。
40.图2为初筛制备的十种两相深共熔溶剂状态图。
41.图3为初筛制备的十种两相深共熔溶剂对银杏果外种皮中活性成分提取分离的效果图。
42.图4为疏水深共熔溶剂中不同醇类组分对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响关系图。
43.图5为疏水深共熔溶剂中hba/hbd不同摩尔比对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响关系图。
44.图6为亲水深共熔溶剂中不同醇类组分对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响关系图。
45.图7为亲水深共熔溶剂中不同酸类组分对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响关系图。
46.图8为亲水深共熔溶剂中hba/hbd不同摩尔比对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响关系图。
47.图9为亲水深共熔溶剂中hbd1/hbd2不同摩尔比对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响关系图。
48.图10为亲水深共熔溶剂中不同含水量对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响关系图。
49.图11为两相深共熔溶剂体系中疏水des/亲水des不同体积比对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响关系图。
50.图12为两相深共熔溶剂体积与银杏果外种皮粉末不同料液比对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响关系图。
51.图13为不同提取温度对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响。
52.图14为不同提取时间对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响。
具体实施方式
53.实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
54.实验原料及试剂：
55.实验用银杏果外种皮采自江苏省邳州市，在40℃下烘干至恒重，用固体粉碎机打碎成粉末，过40目筛得40目以下银杏果外种皮粉末；白果新酸标准品购自四川维克奇生物科技有限公司；总银杏酸标准品和银杏内酯a标准品购自南京狄尔格医药科技有限公司；芦丁标准品购自上海源叶生物科技有限公司。实验中冰乙酸及甲醇为色谱纯，其余所用试剂均为分析纯。其它原料都是市售可得。
56.实验仪器见表1.
57.表1.实验仪器列表
[0058][0059]
银杏酚酸的hplc检测：
[0060]
液相条件的确定
[0061]
本实施例采用hplc等度洗脱法，测定了银杏酚酸的含量，最终确定的hplc分析条件为：色谱柱为依利特sinochrom ods-bp 5μm(4.6mm
×
250mm)，流动相为甲醇-4％冰乙酸(94:6,v/v)，检测波长为310nm，柱温为36℃，流速1ml/min，进样量10μl。在此条件下的标准品液相图谱如图1所示。银杏酚酸中：白果新酸(c13:0)出峰时间13.190min、白果酸(c15:1)出峰时间14.077min、十七烷二烯银杏酸(c17:2)出峰时间15.870min、氢化白果酸(c15:0)出峰时间19.332min和十七烷一烯银杏酸(c17:1)出峰时间20.497min。由图1可见，酚酸的五种成分峰型良好，完全分开，可用于本发明的检测。
[0062]
用白果新酸标准品配成标准液并稀释至相应倍数，浓度梯度为0.0000、0.0108、0.108、0.216、0.324、0.432、0.540、0.648mg/ml，经hplc检测后绘制标准曲线。酚酸检测标准曲线为y＝690.3131x-1.2774，r2＝0.9999，检测范围0-0.648mg/ml。
[0063]
黄酮检测方法：
[0064]
黄酮检测采用紫外分光光度计芦丁法，具体检测方法为：取0.5ml待测样品，加入0.3ml 5％nano2溶液，放置6min，加入0.3ml 10％al(no3)3溶液，放置6min，加入4ml 4％naoh溶液，4.5ml 70％乙醇溶液，混匀后放置20min，510nm下检测吸光值。
[0065]
用芦丁标准品配成标准液并稀释至相应倍数，浓度梯度为0.000、0.0161、0.161、0.322、0.644、0.966、1.288、1.610mg/ml，显色后检测，并绘制标准曲线。使用芦丁法检测的黄酮标准曲线为y＝0.2963x-0.0081，r2＝0.9991，检测范围0-0.610mg/ml。
[0066]
萜内酯检测方法：
[0067]
萜内酯检测采用分光光度法，具体检测方法为：取0.5ml待测样品，加入0.4ml碱性羟胺混合溶液(13.9％盐酸羟胺水溶液-12.3％氢氧化钠溶液(1:2)混合，现用现配)，放置5min，加入3mol/l hcl溶液0.4ml，6％fecl3溶液0.2ml，混匀，加入70％乙醇溶液3ml，混匀，在517nm下检测吸光值。
[0068]
用银杏内酯a标准品配制成标准液并稀释至相应倍数，浓度梯度为0.000、0.085、0.425、0.850、1.700、2.550、3.400、4.250mg/ml，显色后检测，并绘制标准曲线。萜内酯标准曲线为y＝0.071x 0.003，r2＝0.9945，检测范围0-4.250mg/ml。
[0069]
原花青素检测方法：
[0070]
原花青素含量测定选用4-二甲基肉桂醛(dmac)分光光度法，具体检测方法为：精确量取12.5ml浓盐酸、12.5ml水，用无水乙醇定容至100ml制成酸性乙醇，酸性乙醇需现配现用。将50mg dmac用酸性乙醇定容至50ml配制成显色剂。1ml样品液加3ml显色剂，在室温下放置10min进行显色反应，反应后在644nm处检测。
[0071]
用银杏叶原花青素标准品配成标准液并稀释至相应倍数，浓度梯度分别为0.0129、0.0258、0.0387、0.0516、0.0645、0.0774、0.0903、0.1032、0.1161、0.129mg/ml，显色后检测，并绘制标准曲线。原花青素标准曲线为y＝4.8401x 0.0357，r2＝0.9994，检测范围0-0.129mg/ml。
[0072]
实施例1
[0073]
(1)按照摩尔比1:0.4:0.1称取薄荷醇、己醇和月桂酸并混合均匀，在80℃加热，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des-u，作为两相深共溶溶剂的疏水相；
[0074]
(2)按照摩尔比2:2:1称取氯化胆碱、柠檬酸和乙二醇并混合均匀，在80℃加热，直至形成透明液体，即为深共熔溶剂des-d，将des-d与水按照质量比7:3混合即得两相深共熔溶剂的亲水相；
[0075]
(3)将疏水相和亲水相按照体积比9:1混合，静置后分层，即得两相深共熔溶剂。
[0076]
实施例2
[0077]
(1)按照摩尔比1:0.8:0.2称取薄荷醇、己醇和月桂酸并混合均匀，在80℃加热，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des-u，作为两相深共溶溶剂的疏水相；
[0078]
(2)按照摩尔比2.5:1.5:1称取氯化胆碱、柠檬酸和乙二醇并混合均匀，在80℃加热，直至形成透明液体，即为深共熔溶剂des-d，将des-d与水按照质量比4:6混合即得两相深共熔溶剂的亲水相；
[0079]
(3)将疏水相和亲水相按照体积比1:9混合，静置后分层，即得两相深共熔溶剂。
[0080]
实施例3
[0081]
(1)按照摩尔比1:1.6:0.4称取薄荷醇、己醇和月桂酸并混合均匀，在80℃加热，直
至形成透明液体，即为深共溶溶剂des-u，作为两相深共溶溶剂的疏水相；
[0082]
(2)按照摩尔比3:2:1称取氯化胆碱、柠檬酸和乙二醇并混合均匀，在80℃加热，直至形成透明液体，即为深共熔溶剂des-d，将des-d与水按照质量比4.5:5.5混合即得两相深共熔溶剂的亲水相；
[0083]
(3)将疏水相和亲水相按照体积比8:2混合，静置后分层，即得两相深共熔溶剂。
[0084]
实施例4
[0085]
实施例4与实施例3制备方法相同，不同之处在于将疏水相与亲水相按照体积比7:3混合。
[0086]
实施例5
[0087]
实施例5与实施例3制备方法相同，不同之处在于将疏水相与亲水相按照体积比6:4混合。
[0088]
实施例6
[0089]
实施例6与实施例3制备方法相同，不同之处在于将疏水相与亲水相按照体积比5:5混合。
[0090]
实施例7
[0091]
(1)准确称取0.2g银杏果外种皮粉末于具塞玻璃瓶中，加入实施例1制备得到的两相深共熔溶剂体系2ml，混合均匀；
[0092]
(2)将步骤(1)中得到的混合物在50℃，300rpm下恒温振荡提取5min，提取结束后在2000g下离心7min，离心后分别取疏水相和亲水相测定两相中银杏酚酸、萜内酯、黄酮和原花青素的含量。
[0093]
(3)提取后采用大孔树脂吸附法分别对双相体系的疏水相和亲水相中的活性成分进行回收。
[0094]
实施例8
[0095]
(1)准确称取0.2g银杏果外种皮粉末于具塞玻璃瓶中，加入实施例2制备得到的两相深共熔溶剂体系5ml，混合均匀；
[0096]
(2)将步骤(1)中得到的混合物在25℃，100rpm下恒温振荡提取55min，提取结束后在6000g下离心3min，离心后分别取疏水相和亲水相测定两相中银杏酚酸、萜内酯、黄酮和原花青素的含量。
[0097]
(3)提取后采用反溶剂法分别对双相体系的疏水相和亲水相中的活性成分进行回收。
[0098]
实施例9
[0099]
(1)准确称取0.2g银杏果外种皮粉末于具塞玻璃瓶中，加入实施例3制备得到的两相深共熔溶剂体系6ml，混合均匀；
[0100]
(2)将步骤(1)中得到的混合物在30℃，220rpm下恒温振荡提取40min，提取结束后在3000g下离心5min，离心后分别取疏水相和亲水相测定两相中银杏酚酸、萜内酯、黄酮和原花青素的含量。
[0101]
(3)提取后采用大孔树脂吸附法分别对双相体系的疏水相和亲水相中的活性成分进行回收。
[0102]
实施例10
[0103]
(1)准确称取0.2g银杏果外种皮粉末于具塞玻璃瓶中，加入实施例4制备得到的两相深共熔溶剂体系8ml，混合均匀；
[0104]
(2)将步骤(1)中得到的混合物在25℃，200rpm下恒温振荡提取50min，提取结束后在3000g下离心5min，离心后分别取疏水相和亲水相测定两相中银杏酚酸、萜内酯、黄酮和原花青素的含量。
[0105]
(3)提取后采用液液萃取法分别对双相体系的疏水相和亲水相中的活性成分进行回收。
[0106]
实施例11
[0107]
(1)准确称取0.2g银杏果外种皮粉末于具塞玻璃瓶中，加入实施例5制备得到的两相深共熔溶剂体系9ml，混合均匀；
[0108]
(2)将步骤(1)中得到的混合物在35℃，200rpm下恒温振荡提取40min，提取结束后在3000g下离心5min，离心后分别取疏水相和亲水相测定两相中银杏酚酸、萜内酯、黄酮和原花青素的含量。
[0109]
(3)提取后采用大孔树脂吸附法分别对双相体系的疏水相和亲水相中的活性成分进行回收。
[0110]
实施例12
[0111]
(1)准确称取0.2g银杏果外种皮粉末于具塞玻璃瓶中，加入实施例6制备得到的两相深共熔溶剂体系10ml，混合均匀；
[0112]
(2)将步骤(1)中得到的混合物在35℃，220rpm下恒温振荡提取40min，提取结束后在3000g下离心5min，离心后分别取疏水相和亲水相测定两相中银杏酚酸、萜内酯、黄酮和原花青素的含量。
[0113]
(3)提取后采用大孔树脂吸附法分别对双相体系的疏水相和亲水相中的活性成分进行回收。
[0114]
试验例1
[0115]
不同疏水相和亲水相组成的两相深共熔溶剂对目标物的提取分离效果的影响。
[0116]
本发明首先制备了两种疏水des和五种亲水des，制备方法参考实施例1，所用氢键供体(hbd)、氢键受体(hba)、hba与hbd的摩尔比以及亲水深共熔溶剂的含水量如表2所示。其中des1-2为疏水相，des3-7为亲水相。
[0117]
表2.制备的疏水des和亲水des
[0118][0119]
参考实施例6的方法将表2中的疏水des和亲水des两两组合制备两相深共熔溶剂体系(图2)。参考实施例9的方法考察银杏果外种皮中活性成分提取分离的效果。实验结果
表明，不同的疏水深共熔溶剂和亲水深共熔溶剂组成的两相深共熔溶剂对银杏果外种皮活性成分具有不同的提取效果。结果如图3所示，可以看出10种两相深共熔溶剂中银杏酚酸在疏水相中含量较高，在亲水相中几乎没有。纵观由疏水深共熔溶剂des2与其他亲水深共熔溶剂组成的五组两相体系，虽然萜内酯的提取总量相较于des1组成的双相体系较高，但其在疏水相中的分配比较高，不符合本发明将萜内酯富集在亲水相中的目的，且银杏酚酸的提取效果也不及des1组成的双相体系。基于des5组成的两组双相体系相较于其它亲水深共熔溶剂组成的双相体系其四种活性成分的提取效果都较低，因此，也不适于本发明的应用目的。由于黄酮和原花青素的含量比较低，因此不对它们进行主要考虑。综上所述，选择两相深共熔溶剂1-3(des1:des3体积比1:1)进行后续实验。
[0120]
试验例2
[0121]
疏水相hbd组分对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响。
[0122]
将疏水相深共熔溶剂中氢键供体组分己醇、月桂酸替换为碳链更长的组分，提高疏水深共熔溶剂的疏水性，以期达到更好的提取分离效果。首先将己醇替换成其它组分，制备的疏水深共熔溶剂如表3所示。
[0123]
表3.不同hbd的疏水深共熔溶剂
[0124][0125]
参考实施例6的方法用表3中的不同疏水des与亲水des3组合制备两相深共熔溶剂体系，参考实施例9的方法考察银杏果外种皮中活性成分的提取分离效果。结果如图4所示，结果表明，对于银杏酚酸的提取效果没有显著差异。随着碳链长度增加，银杏萜内酯的提取总量呈现下降趋势，上相和下相的分配率没有显著差异，黄酮和原花青素的提取效果提高，且下相分配率较高。根据结果分析可知，增长碳链提高疏水性不利于内酯的提取，且酸类组分在疏水des中所占比例很少，此外，月桂酸已经属于碳链较长的酸类，因此不再进行酸类hbd的优化。综上所述，选择己醇和月桂酸为疏水深共熔溶剂的最优hbd。
[0126]
试验例3
[0127]
疏水深共熔溶剂hba/hbd摩尔比对银杏果外种皮活性成分提取分离效果的影响。
[0128]
相同成分组成的深共熔溶剂，组分摩尔比不同也会使深共熔溶剂性质产生改变，从而影响提取效果。以hba/hbd摩尔比按照2.5:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5制备疏水深共熔溶剂，并参考实施例6的方法制备两相深共熔溶剂体系，参考实施例9的方法考察银杏果外种皮中活性成分的提取分离效果。结果如图5所示，结果表明，摩尔比1:1.5、1:2、1:2.5时银杏酚酸提取总量较高，摩尔比1:2时银杏萜内酯提取总量较高，因此选择hba/hbd摩尔比1:2即薄荷醇：己醇：月桂酸1:1.6:0.4为最佳疏水深共熔溶剂并编号为des14。
[0129]
试验例4
[0130]
亲水深共熔溶剂醇类组分对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响。
[0131]
选取亲水性大于丙二酸即logp值小于丙二酸的组分与氯化胆碱、丙二酸制备三元des，制备情况如表4所示。
[0132]
表4.不同醇类hbd制备的亲水深共熔溶剂
[0133][0134]
参考实施例6的方法用试验例3中的最佳疏水des14与表4中的不同亲水des组合制备两相深共熔溶剂体系，参考实施例9的方法考察银杏果外种皮中活性成分的提取分离效果。结果如图6所示，结果表明随着醇类亲水性增强时，银杏酚酸的提取效果先降低和提高，醇类组分为丙三醇时，酚酸提取效果最差。随着醇类组分亲水性增加，亲水相的内酯先增加后减少，醇类组分为乙二醇和丙三醇时，内酯的提取效果最好。对于黄酮和原花青素，当醇类组分亲水性增强时，亲水相的提取效果下降；疏水相提取效果没有明显差异。综上所述，选择乙二醇为亲水深共熔溶剂的最佳醇类组分。
[0135]
试验例5
[0136]
亲水深共熔溶剂酸类组分对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响。
[0137]
选取亲水性大于丙二酸即logp值小于丙二酸的酸类与氯化胆碱、乙二醇制备深共熔溶剂，制备情况如表5所示。
[0138]
表5.不同酸类hbd制备的亲水深共熔溶剂
[0139][0140][0141]
参考实施例6的方法用试验例3中的最佳疏水des14与表5中的不同亲水des组合制备两相深共熔溶剂体系，参考实施例9的方法考察银杏果外种皮中活性成分的提取分离效果。结果如图7所示。结果表明，乙醇酸作为酸类组分时，银杏酚酸的提取效果较低，其它没有显著差异。柠檬酸作为酸类组分时，银杏萜内酯的提取效果较高，且下相分配率也较高。对于黄酮和原花青素，长链的酸类制备的深共熔溶剂的提取效果较低。综上所述，选择柠檬酸为亲水深共熔溶剂的最佳酸类组分。试验例6
[0142]
亲水深共熔溶剂hba/hbd摩尔比对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响。
[0143]
以hba/hbd摩尔比0:1、0.25:1、0.5:1、0.75:1、1:1(其中hbd1/hbd2即柠檬酸/乙二
醇摩尔比为1:1)制备亲水深共熔溶剂，参考实施例6的方法将制备得到的亲水深共熔溶剂与试验例3得到的最佳疏水深共熔溶剂des14组合制备两相深共熔溶剂体系，参考实施例9的方法考察银杏果外种皮中活性成分的提取分离效果，结果如图8所示。结果表明，银杏酚酸的提取效果整体没有显著性差异。随着hba/hbd摩尔比的增加，银杏萜内酯亲水相提取效果逐渐增加，疏水相无显著性差异。对于黄酮和原花青素，随着hba/hbd摩尔比的增加，两者总的提取效果都有一定的增加。因此，选择hba/hbd摩尔比为1:1为最佳摩尔比。
[0144]
试验例7
[0145]
亲水深共熔溶剂hbd1/hbd2摩尔比对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响。
[0146]
在亲水相深共熔溶剂hba/hbd摩尔比为1:1的基础上改变两个hbd之间的摩尔比考察其对银杏果外种皮中活性成分提取分离的效果的影响。以hbd1(柠檬酸)/hbd2(乙二醇)摩尔比0:1、0.5:1、0.75:1、1:1、1.25:1、1.5:1、2:1制备亲水深共熔溶剂，参考实施例6的方法将制备得到的亲水深共熔溶剂与试验例3得到的最佳疏水深共熔溶剂des14组合制备两相深共熔溶剂体系，参考实施例9的方法考察银杏果外种皮中活性成分的提取分离效果，结果如图9所示。结果表明，银杏黄酮和原花青素的提取效果没有显著改变。随着hbd1/hbd2的摩尔比的增加，银杏萜内酯的总提取效果逐渐提高，但由于hbd1/hbd2摩尔比为1.5:1时银杏酚酸提取效果较低，因此选择hbd1/hbd2摩尔比2:1为最佳摩尔比。最终确定最佳亲水深共熔溶剂组分为氯化胆碱：柠檬酸：乙二醇摩尔比为3:2:1。
[0147]
试验例8
[0148]
亲水相含水量对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响。
[0149]
采用实施例9的提取方法，其中提取条件：提取时间45min；考察本发明实施例6制备的两相深共熔溶剂中亲水相含水量对银杏果外种皮中活性成分提取分离的效果的影响。选取的亲水相的含水量分别为40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％，结果如图10所示。结果表明亲水相含水量改变对银杏酚酸、黄酮和原花青素提取效果没有显著影响。随着亲水相含水量的增加，银杏萜内酯的总提取量先增加后减少，在含水量为45％时，萜内酯具有最高的提取效果，且疏水相与亲水相的分配比较小，萜内酯大部分富集在亲水相中。因此，以45％为最佳亲水相含水量。
[0150]
试验例9
[0151]
疏水相des/亲水相des体积比对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响。
[0152]
采用实施例9的方法，其中提取条件：提取时间45min；考察本发明实施例6制备的两相深共熔溶剂中疏水相des/亲水相des体积比对银杏果外种皮中活性成分提取分离的效果的影响。选取的疏水des/亲水des体积比为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2，结果如图11所示。根据结果综合看来，体积比5:5和体积比8:2时，银杏酚酸和银杏萜内酯总的提取效果差不多，但银杏黄酮和原花青素的提取效果在体积比8:2时明显高于体积比5:5。因此，选择疏水相des/亲水相des体积比8:2为最佳体积比。
[0153]
试验例10
[0154]
银杏果外种皮粉末和两相深共熔溶剂的料液比对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响。
[0155]
采用实施例9的提取方法，其中疏水相与亲水相体积比为8:2，考察银杏果外种皮
粉末与本发明实施例3制备的两相深共熔溶剂的料液比对比对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响，选取的步骤(1)中的料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:50g/ml，结果如图12所示。结果表明，在不同料液比下银杏酚酸和原花青素的提取效果几乎没有差异。随着深共熔溶剂用量的增加，银杏萜内酯和黄酮的提取效果逐渐提高，在料液比为1:30g/ml时达到平衡。因此，选择料液比为1:30g/ml为最佳料液比。
[0156]
试验例11
[0157]
提取温度对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响。
[0158]
采用实施例9的方法，其中疏水相与亲水相体积比为8:2，考察不同温度下本发明实施例3的两相深共熔溶剂对银杏果外种皮中活性成分的提取分离效果的影响，步骤(2)选取的温度分别为25、30、35、40、45、50(℃)，结果如图13所示。由结果分析可知，温度对4种活性成分的提取效果影响都不大，考虑到一定的温度有利于降低深共熔溶剂的粘度，因此选择30℃为最佳提取温度。
[0159]
试验例12
[0160]
提取时间对银杏果外种皮中活性成分提取分离效果的影响。
[0161]
采用实施例9的方法，其中疏水相与亲水相体积比为8:2，考察在不同振荡提取时间下本发明实施例3制备的两相深共熔溶剂对银杏果外种皮中活性成分的提取分离效果的影响，步骤(2)选取的时间分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55(min)，结果如图14所示。由图中可以看出，随着时间的增加，银杏酚酸和银杏萜内酯的提取效果基本呈现逐渐提高的趋势，在40min时基本达到平衡。因此，选择振荡提取时间40min为最佳提取时间。
[0162]
综上所述，本发明制备的两相深共熔溶剂，在30℃下，220rpm提取40min，料液比为1:30g/ml时，银杏酚酸、萜内酯、黄酮、原花青素的提取效果在较高水平。且疏水性成分银杏酚酸富集在上相疏水des中，亲水性成分萜内酯、黄酮和原花青素主要富集在下相亲水相中。最优条件下，银杏酚酸在疏水相中的提取率为162.43
±
1.54mg/g，亲水相中总黄酮提取率为14.79
±
0.62mg/g、萜内酯提取率为246.96
±
4.83mg/g、原花青素提取率为3.28
±
0.03mg/g。因此，本发明制备的两相深共熔溶剂可以用于同时提取分离银杏果外种皮中的多个活性成分。