一种嗜几丁质属菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用的制作方法

技术特征：
1.一种嗜几丁质属菌株，其特征在于，该菌株分离自海岛上的野生仙人掌根系土壤。2.一种嗜几丁质属菌株的筛选与鉴定方法，其特征在于，以下步骤：步骤1：拮抗菌株分离，该菌株分离自海岛上的野生仙人掌根系土壤；步骤2：观察平板拮抗效果，将步骤1中的分离菌株分别转移至1ml新鲜的lb液体培养基中，并在恒温摇床(200rmp、30℃)振荡培养48h，获得分离菌株lb培养液，用于下游拮抗试验筛选；将香蕉枯萎病菌foc4于pda固体培养基中培养，待菌丝长满平板后，用0.5cm打孔器进行打孔，将含有foc4菌丝的菌饼放置于新鲜的pda固体培养基平板中央培养2-3天，然后在距离菌丝边缘1.5cm左右，滴取0.5微升的待检测菌株的菌液，然后于30℃下培养2-3天，观察拮抗效果；步骤3：16s rdna测序，提取hnu63基因组dna，使用16s rdna通用引物27f(5
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agagtttgatcmtggctcag-3’，seq id no.1)和1492r(5
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taccttgttacgactt-3’，seq id no.2)进行pcr反应。3.根据权利要求2所述的一种嗜几丁质属菌株的筛选与鉴定方法，其特征在于，所述拮抗菌株的分离方法包括以下步骤：步骤1：采集仙人掌的根系组织及根际土；步骤2：将仙人掌根系样品的根剪碎并充分研磨后转移至装有20ml 20％甘油的离心管中充分震荡混匀，经梯度密度稀释后分别吸取100微升103cfu/ml、104cfu/ml和105cfu/ml密度梯度下的悬液涂布于lb固体培养基(以平皿中单菌落分布均匀，数目约40-60个为适宜的稀释浓度)，每个密度梯度设置3次重复；步骤3：置于30℃恒温培养箱中培养48h，然后分离出单个菌落，纯化后进行超低温冷冻保存。4.根据权利要求2所述的一种嗜几丁质属菌株的筛选与鉴定方法，其特征在于，所述步骤3中将16s rdna测序后的序列置于ncbi数据库中进行序列比对。5.一种嗜几丁质属菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：hnu63的培养：将hnu63单菌落分别接种于lb液体培养基(体积2l)中30℃，150rpm震荡培养48小时，离心后弃去上清然后收集菌体，使用无菌水进行稀释，得hnu63生防菌悬液，备用；步骤2：香蕉枯萎病菌foc4的培养：将foc4先接种于pda固体培养基中培养，加入一定量无菌水后用涂布棒刮取菌丝收集菌丝和孢子获得悬浮液，收集足量foc4菌悬液后用于后续接种；步骤3：无菌土的制备：在从未进行香蕉种植的地方收集土壤，取其地表部分以下10cm左右的土壤，然后将土壤经过2次高压蒸汽灭菌处理，以避免其它微生物干扰；步骤4：生物防治实验：选取60株出苗30天的健康粉蕉苗，随机分成3组：先对粉蕉苗进行伤根处理，在根部培养土中灌注约20ml的hnu63生防菌悬液，再将20ml的foc4菌悬液灌注入粉蕉苗根系，然后于30℃温室条件下培养，空气湿度未进行严格控制，统计时间为30天，每天观察并统计粉蕉苗的发病情况。6.根据权利要求5所述的一种嗜几丁质属菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用，其特征在于，所述步骤1中稀释后的菌液浓度控制在od600≈1.0。7.根据权利要求5所述的一种嗜几丁质属菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用，其特
征在于，所述步骤2中的培养条件为在30℃恒温培养箱中培养96h。8.根据权利要求5所述的一种嗜几丁质属菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用，其特征在于，所述步骤4中表现出典型的萎蔫症状即统计为发病，即先是叶片边缘出现黄色病变，逐渐叶片和植株开始凋萎。9.根据权利要求5所述的一种嗜几丁质属菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用，其特征在于，所述步骤4中在开展本实验的同时，同时以不接种香蕉枯萎病菌foc4，不灌注生防菌悬液hnu63，只添加无菌水作为对比例1；以接种香蕉枯萎病菌foc4，不灌注生防菌悬液hnu63，作为对比例2，其中实施例2中和对比例2中加入的菌悬液量一致，且粉蕉苗的健康水平和株高一致，发病率＝发病植株数/总接种植株数*100％。

技术总结
本发明公开了一种嗜几丁质属菌株，该菌株分离自海岛上的野生仙人掌根系土壤；嗜几丁质属菌株的筛选与鉴定方法，以下步骤：步骤1：拮抗菌株分离，该菌株分离自海岛上的野生仙人掌根系土壤；步骤2：观察平板拮抗效果，将步骤1中的分离菌株分别转移至1mL新鲜的LB液体培养基中，获得分离菌株LB培养液，用于下游拮抗试验筛选；步骤3：16S rDNA测序，提取HNU63基因组DNA，使用16S rDNA通用引物27F进行PCR反应。该菌株可有效防治由镰刀菌4号小种引起的香蕉枯萎病，施加HNU63的植株与不施加HNU63生防菌的对照相比，香蕉枯萎病发病率下降约60％。本发明通过将嗜几丁质属菌株应用于防治香蕉枯萎病中，具有环境友好、污染少的特点，符合现代化生态农业发展的需求。生态农业发展的需求。生态农业发展的需求。


技术研发人员：李鹏 陈婷 曹秀兰 王清楠
受保护的技术使用者：海南师范大学
技术研发日：2021.12.21
技术公布日：2022/2/8