雷公藤红素在制备抑制金黄色葡萄球菌药物中的用途的制作方法

1.本发明涉及雷公藤红素的新药理用途，尤其涉及雷公藤红素在制备抑制金黄色葡萄球菌药物中的用途，属于雷公藤红素的新药理用途领域。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是一种常见的革兰氏阳性菌，隶属于葡萄球菌属，显微镜下呈现葡萄簇状，无鞭毛及孢子形成。目前临床上主要以抗菌药物治疗金黄色葡萄球菌感染，这一情况导致大量的耐药金黄色葡萄球菌的出现。其中以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant s.aureus，mrsa)最臭名昭著。据报道显示，mrsa感染已经和hbv感染、aids并列为世界范围内三大难解决感染性疾病。美国每年有超过两百万人因为金黄色葡萄球菌感染而住院，其中mrsa感染率高达40％。
3.目前，mrsa在金黄色葡萄球菌中所占的比例日益上升，其多重耐药的特点也日益突出，近年来临床分离的mrsa中，具有多重耐药特性的占90％左右，对β-内酰胺类，氨基糖苷类，氟喹诺酮类，大环内酯类等抗生素同时耐药(wang j l,chen s y,wang j t,et al.comparison of both clinical features and mortality risk associated with bacteremia due to community-acquired methicillin-resistant staphylococcus aureus and methicillin-susceptible s.aureus[j].clin infect dis,2008,46(6):799-806.)。万古霉素是当今治疗mrsa感染的一线药物，也是最后一道防线。但近些年发现mrsa菌株已经对万古霉素中度耐药甚至完全耐药(程禹,罗敏玉,陈代杰.耐甲氧西林金葡菌到万古霉素高度耐药金葡菌的发展及其感染的药物治疗[j].世界临床药物,2011,32(8):482-487.)。甚至最近上市的利奈唑胺和达托霉素等抗mrsa药物也相继发现耐药菌株(李苏娟.金黄色葡萄球菌对利奈唑胺耐药机制及其分子基础研究[d].浙江大学,2015.)，对mrsa感染临床上将面临无药可用的窘境，因此开发新的抗mrsa感染药物已经迫在眉睫。
[0004]
1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(p5cdh)是脯氨酸分解代谢途径关键酶，在脯氨酸转化为谷氨酸过程中发挥着重要作用(primo-capellaa,martinez-cuencam-r,gil-munozf,et al.physiological characterization and proline route genes quantification under long-term cold stress in carrizo citrange[j].scientia horticulturae,2021,276.)。脯氨酸可被脯氨酸脱氢酶(prodh)氧化为δ1-吡咯啉-5-羧酸(p5c)，p5c随后被p5cdh氧化为谷氨酸。p5cdh对防止p5c-pro密集循环和避免电子流失而产生活性氧(reactive oxygen species，ros)至关重要(ines monteolivam,soledad rizzi y,miguel cecchini n,et al.context of action of proline dehydrogenase(prodh)in the hypersensitive response of arabidopsis[j].bmc plant biology,2014,14.)。因此，p5cdh含量的降低可以导致ros含量的增加。ros包括过氧化物、超氧化物、羟基自由基、单线态氧和α-氧等。ros可介导细菌细胞膜损伤，破坏膜的完整性，增加膜的通透性，以杀死细菌；ros能对dna损伤并抑制正常的代谢(韦秋羽,李特特,陈京涛.活性氧对树突状细胞的调控作用[j/ol].中国生物化学与分子生物学报,2021(05):1-12.)。因而p5cdh可能是抗mrsa
的靶蛋白。
[0005]
雷公藤又名断肠草、黄藤等，味苦、辛，性寒；有大毒，归肝肾经，具有杀虫解毒、消肿止痛、活血通络、祛风湿的功效(南京中医药大学.中药大辞典[m].上海：上海科学技术出版社，2006:3459-3465.)。雷公藤有抑制免疫、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用，临床上主要用于治疗类肾病综合征、风湿性关节炎、红斑狼疮等。雷公藤红素是中草药雷公藤的主要活性成分之一，是第一个从雷公藤的根皮中分离得到的天然活性产物。2007年被国际顶级期刊《cell》杂志列为最有可能发展为药物的5种天然产物之一(胡德俊，彭泽燕，何东初.雷公藤的药理作用研究进展[j].医药导报，2018,37(5):586-592.)。近年来，众多研究发现雷公藤红素具有良好的抗炎、抗氧化、免疫抑制、抗肿瘤、抗肥胖、抗生育等药理活性并对神经退行性疾病及ⅱ型糖尿病具有治疗作用，迄今为止，未有雷公藤红素抑制金黄色葡萄球菌的有关报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明的主要目的是提供雷公藤红素在制备抑制金黄色葡萄球菌药物中的用途；
[0007]
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0008]
本发明通过同源模建及分子对接筛选出与p5cdh结合的最佳先导化合物，分子对接结果表明，雷公藤红素可占据结合口袋。化合物雷公藤红素与活性位点lys 487残基形成氢键，并且具有结合自由能(-4.257kcal/mol)。分子对接的结果表明，雷公藤红素有可能通过p5cdh抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
[0009]
为了确证雷公藤红素是否具有确切的抑制抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药理作用，本发明利用微量稀释法测定雷公藤红素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)。肉眼观察发现雷公藤红素处理后，在第6孔开始出现浑浊，则雷公藤红素的最小抑菌浓度为4μg/ml。药物浓度小于4μg/ml的孔中培养基浑浊，眼观观察与阳性对照组无显著性差异。而2mic、4mic浓度下，金黄色葡萄球菌生长受到显著抑制，培养基澄清，与阴性对照组无显著性差异。
[0010]
综合上述试验结果可见，雷公藤红素通过与p5cdh蛋白结合发挥抗mrsa作用，为抗mrsa药物的开发提供了新的靶点。因此，雷公藤红素可以用于制备抑制金黄色葡萄球菌的药物。
[0011]
本发明公开了一种抑制金黄色葡萄球菌的药物组合物，包括：预防或治疗上有效量的雷公藤红素和药学上可接受的辅料或载体。
[0012]
本发明还公开了一种抑制金黄色葡萄球菌的药物组合物，包括:预防或治疗上有效量的雷公藤红素和药学上可接受的辅料或载体。
[0013]
优选的，所述的黄色葡萄球菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
[0014]
所述的载体或辅料是指药学领域常规的载体或辅料，例如：稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂、表面活性剂等；另外，还可以在药物组合物中加入其它辅助剂如香味剂和甜味剂。
[0015]
所述稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分；常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等，其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。
[0016]
所述崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)、海藻酸(与总重量比为2-5％)、微晶纤维素(与总重量比为5-15％)中之一种或几种混合物。其中以交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-7％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)为佳。最佳为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)。
[0017]
所述的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙，聚乙二醇，滑石粉，氢化植物油中之一种或几种混合物。其中以硬脂酸镁最为适宜。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10-1％，一般用量为0.25-0.75％，最佳用量为0.5-0.7％。
[0018]
所述的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀粉浆(10-30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(2-5％，与粘合剂总重量比)，聚乙烯吡咯烷酮(2-20％，与粘合剂总重量比)，以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳，最佳为聚乙烯吡咯烷酮的50％乙醇水溶液。
[0019]
所述助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉或三硅酸镁中的一种或几种混合物。
[0020]
所述表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分。常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2-6％，与总重量比)。
[0021]
本发明通过同源模建及分子对接筛选出雷公藤红素可能通过p5cdh抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，本发明进一步利用微量稀释法测定雷公藤红素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，结果发现雷公藤红素对金黄色葡萄球菌具有确切的抑制作用，能应用于制备抑制金黄色葡萄球菌的药物。
附图说明
[0022]
图1雷公藤红素与p5cdh结合靶点的预测(黄色虚线所示的氢键表示配位键之间的距离(单位为埃)。
具体实施方式
[0023]
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0024]
试验例1雷公藤红素通过p5cdh抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试验
[0025]
1材料和试验方法
[0026]
1.1材料
[0027]
雷公藤红素(纯度＞98％，色谱纯)购自成都瑞芬思生物科技公司，用dmso(sigma-aldrich，美国)溶解，配成质量浓度为40.96mg/ml的母液备用；金黄色葡萄球菌atcc43300购自美国模式培养物集存库；胰酪胨大豆肉汤培养基(tsb)购自青岛高科园海博生物技术有限公司。
[0028]
1.2试验方法
[0029]
1.2.1菌种的复苏、传代
[0030]
无菌条件下，将金黄色葡萄球菌复苏后接种到tsb培养基中，放入37℃恒温培养箱
中培养24h，以相同接种方法对金黄色葡萄球菌进行传代纯化培养后，备用。
[0031]
1.2.2同源模建及分子对接
[0032]
通过swiss model官方网站，得到p5cdh同源蛋白，构建p5cdh的三级结构(rong c,li l,proteins z w j.zdock:an initial-stage protein-docking algorithm[j].proteins，2003，52(1)：80-87.)。下载得到雷公藤红素配体分子。使用cdocker进行分子对接，在工具浏览器中，展开receptor-ligands interraction|dock ligands，点击cdocker进行分子对接，maximun bad orientations设置为800，orientation vd w energy threshold设置为300，其他参数默认(proteins z w j.rdock:refinement of rigid-body protein docking predictions[j].proteins，2003，53(3)：693-707.)。
[0033]
1.2.3最小抑菌浓度的测定(mic)和最小杀菌浓度的测定(mbc)
[0034]
采用微量肉汤稀释法测定雷公藤红素对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，mic)，其中第1孔至第8孔雷公藤红素质量浓度分别为64、32、16、8、4、2、1和0.5μg/ml；第10孔为阴性对照，培养基中只加入雷公藤红素药液；第11孔为阳性对照，培养基中只加菌液，第12孔为空白对照。37℃条件下静置培养24h，肉眼观察无菌生长的最低浓度孔的雷公藤红素质量浓度为mic。试验设3次重复，取平均值。
[0035]
2试验结果
[0036]
2.1同源模建及分子对接结果
[0037]
通过分子对接研究，筛选出与p5cdh结合的最佳先导化合物，为进一步的实验提供依据。
[0038]
分子对接结果表明，雷公藤红素可占据结合口袋。如图1所示，化合物雷公藤红素与活性位点lys 487残基形成氢键，并且具有结合自由能(-4.257kcal/mol)。
[0039]
2.2雷公藤红素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(mic)测定
[0040]
利用微量稀释法测定雷公藤红素对金黄色葡萄球菌的mic。
[0041]
肉眼观察发现雷公藤红素处理后，在第6孔开始出现浑浊，则雷公藤红素的最小抑菌浓度为4μg/ml。药物浓度小于4μg/ml的孔中培养基浑浊，眼观观察与阳性对照组无显著性差异。而2mic、4mic浓度下，金黄色葡萄球菌生长受到显著抑制，培养基澄清，与阴性对照组无显著性差异，见表1。
[0042]
表1雷公藤红素对金黄色葡萄球菌的mic
[0043][0044]
注：“－”表示细菌生长抑制，培养液澄清；“ ”表示细菌生长，培养液混浊
[0045]
根据试验结果可见，雷公藤红素可以通过与p5cdh蛋白结合发挥抗mrsa作用，为抗mrsa药物的开发提供了新的靶点。