鸢尾素在制备治疗自身免疫性疾病和严重炎症性疾病药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，具体说是鸢尾素在制备治疗自身免疫性疾病和严重炎症性疾病药物中的应用。


背景技术：

2.自身免疫性疾病(autoimmue disease,aid)是多种内外因素共同作用下，机体自身免疫耐受遭到破坏，免疫系统对自身抗原发生过强或持续时间过久的免疫应答，造成机体自身细胞组织发生病例损害或功能障碍，出现相应临床症状的一类疾病。自身免疫性疾病虽然相对不常见，但是其发病率和死亡率都比较高，aid在全世界的发病率为7～10％，并呈逐年上升趋势。但是目前aid疾病都没有确切的治疗方法，因为这种疾病的进展是逐渐的，因此在临床诊断前可能已发生严重的组织损伤。
3.既往研究认为，一方面，aid为机体免疫功能异常激活导致对自身抗原产生的免疫应答，因此大多采用免疫抑制法进行治疗，但是该治疗方法对于部分病患效果不佳，无法达到缓解病情或降低疾病活动度的目的；另一方面，调节性t细胞(regulatory tcells，treg)数目减少或功能降低导致体内免疫稳态破坏在aid疾病的发生发展中起到至关重要的作用。treg细胞是维持机体免疫平衡的功能成熟的t细胞，treg可通过与靶细胞直接接触或分泌tgf-β和il-10等细胞因子，下调效应性免疫细胞的功能并削弱其活化和增殖能力，从而调控制机体免疫应答的程度。因此，treg的数量减少或功能异常均可能导致自身免疫性疾病的发生。因此，treg与其他t淋巴细胞之间的相互调节、动态平衡对维持机体免疫稳态，给治疗aid疾病提供了全新的治疗途径，但是目前并没有有效的药物可以刺激treg细胞的分化。
4.鸢尾素(irisin)是近年来发现的一种新型的肌因子，是由iii型纤维连接蛋白结构域5(fndc5)水解后生成，并以内分泌的方式释放至血液。鸢尾素自发现以来其主要功能是通过增加线粒体解偶联蛋白1(ucp-1)的表达，促进白色脂肪组织转化为棕色脂肪组织，从而增强机体的代谢。因此目前鸢尾素对脂肪的研究比较充分，但是由于免疫系统紊乱性疾病主要是与t细胞的性能有关，但是t细胞与线粒体解偶联蛋白1(ucp-1)并没有直接联系，因此目前并没有鸢尾素可以治疗自身免疫性疾病的研究。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明的目的是提供鸢尾素在制备治疗自身免疫性疾病和严重炎症性疾病药物中的应用。
6.本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
7.鸢尾素在制备促进cd3 t细胞向treg细胞分化药物中的应用。
8.优选的，鸢尾素促进cd3 t细胞向treg细胞分化包括以下步骤：
9.①
准备鸢尾素；
kinase and erk map kinase signaling.diabetes.diabetes 2014feb；63(2):514-25记载了鸢尾素的制备工艺。
28.二、人原代cd3 t细胞筛选、培养
29.(1)采用ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(pbmc)，磷酸盐缓冲液(ph7.2)洗3遍，重选细胞；
30.(2)按照说明书比例向步骤(1)的重选细胞中加入cd3 t细胞阳性分选磁珠，混匀后4℃孵育半小时；
31.(3)将分选柱置于分选架上，1ml磷酸盐缓冲液过柱平衡2遍；
32.(4)将步骤(2)中的pbmc悬液加入分选柱中，1ml磷酸盐缓冲液洗2遍，将分选柱从分选架上取下，加入1ml磷酸盐缓冲液冲洗出cd3 t细胞；
33.(5)将步骤(4)中得到的细胞计数，加入适量比例(25μl/106～107个细胞)的cd3/cd28磁珠激活8小时，培养基中同时加入不同浓度的鸢尾素(浓度分别为0nm，20nm，50nm和100nm)进行原代cd3 t细胞培养，每两天换液一次，培养cd3 t细胞的培养基选用x-vivo20无血清培养基，其中浓度为0nm即为空白实验；
34.三、流式细胞术检测t细胞各种标志物的表达
35.cd3 t细胞培养12天后，通过流式细胞术检测treg细胞的比例，流式具体染色步骤如下：
36.(1)取2
×
106个细胞到流式管中，磷酸盐缓冲液洗2遍；
37.(2)加入0.25μg percp-cd4，apc-cd8，apc-cd25，fitc-cd3或apc-cd25，相应的表面染色流式抗体(均购买自biolegend公司)，室温避光孵育30分钟；
38.(3)磷酸盐缓冲液洗步骤(2)中的细胞2遍，加入组织细胞固定液，室温避光孵育20分钟，1000rpm离心，弃上清；
39.(4)将步骤(3)中固定好的细胞中加入2ml细胞破膜工作液，1000rpm离心，弃上清；
40.(5)重复步骤(4)；
41.(6)用100μl细胞破膜工作液重悬细胞，加入0.25μgpe-foxp3抗体进行胞内染色，室温避光孵育30分钟；
42.(7)用2ml细胞破膜工作液洗涤细胞2遍，离心，弃上清；
43.(8)用流式缓冲液重悬细胞，上流式细胞仪检测。
44.由于cd3 t分为2类，一类为cd3 cd8 t细胞；另一类为cd3 cd4 t细胞；其中treg细胞是从cd3 cd4 t细胞中分化而来，其表型为cd3 cd4 cd25 foxp3 treg细胞。因此，通过检测cd3 细胞中cd3 cd4 cd25 foxp3 treg细胞所占的百分比，即可证明irisin能够促进cd3 t细胞向treg细胞分化。
45.结果如图1所示，irisin处理t细胞12天后cd25

foxp3

细胞占比结果图，可以看出，cd25

foxp3

细胞的数量在irisin浓度为0～50nm时，cd25

foxp3

细胞占比随着浓度的增加而增加，但是高于50nm后，cd25

foxp3

细胞占比不在增加，还呈现略微下降的趋势，说明irisin刺激cd3 t细胞向cd25

foxp
3
细胞转换在50nm就已经到达极限了，增加irisin浓度不会使分化进一步提高。
46.如图2所示，irisin处理t细胞12天后treg/cd4细胞的数量在irisin浓度为0～50nm时，treg/cd4细胞占比随着浓度的增加而增加，但是高于50nm后，treg/cd4细胞占比不
在继续增加，说明irisin刺激cd3 t细胞向cd25

foxp
3
细胞转换在50nm就已经到达极限了，增加irisin浓度不会使分化进一步提高。
47.图3为irisin处理t细胞12天后，cd4

/cd8

细胞比值，由图3结果可以看出，随着irisin浓度的提高，cd4细胞占cd8细胞的含量也提高，说明cd3 t细胞向cd4 cd24 foxp3 treg细胞的转化增加了。
48.四、rna提取及rt-qpcr检测目的基因表达
49.cd3 t细胞培养24天后，采用trizol法提取rna，逆转录成cdna(invitrogen)，采用实时定量pcr(rt-qpcr)法检测细胞foxp3 mrna的表达，如图4所示，用含有或不含有irisin(50nm)的培养基培养t细胞，24小时后foxp3基因表达改变，这进一步说明了irisin可以调控cd3 t细胞向treg细胞的分化。