一种草莓用复合生防菌及复合生物制剂的制作方法

1.本发明涉及农业种植领域，具体涉及一种用于草莓病害防治的生物制剂。


背景技术：

2.江苏省草莓种植面积大，其中设施草莓占据主导，是江苏省冬季上市的时令水果，已经成为各主要产地现代农业生产中的支柱产业和农民增收的重要途径。但长期以来，我市草莓生产管理还存在重产量轻品质的陈旧观念，高频率的化肥和农药投入，致使草莓种植棚内病原菌积累，化学农药残留，土壤盐渍化和酸化，肥料利用率降低，造成草莓品质下降，食品安全性难以保障。
3.现代农业多采用有益生防菌剂进行病害防控，对环境友好，是减少或替代农药的重要资源。然而针对草莓多种病害(根腐病、灰霉病、枯萎病、炭疽病等)，只能对单一病原菌进行不同的防治处理，无法实现统一防治，同时也无法完全取代化学农药的使用，对草莓的病害综合防治仍需要进一步的研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种能够有效取代化学农药，全面综合防治草莓病害的生物制剂。
5.为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
6.一种草莓用复合生防菌，该复合生防菌包括解淀粉芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌；所述解淀粉芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的活菌数比例为：1～2：1～2：1～2：1～2。通过各菌种的协同作用，综合防治草莓病害。
7.一种草莓用复合生物制剂，该复合生物制剂包括等体积混合的解淀粉芽孢杆菌发酵液、甲基营养型芽孢杆菌发酵液、贝莱斯芽孢杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液；所述解淀粉芽孢杆菌发酵液、甲基营养型芽孢杆菌发酵液、贝莱斯芽孢杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液的活菌浓度为5
×
107～1
×
108cfc/ml。
8.一种草莓用复合生物制剂，该复合生物制剂包括等体积混合的解淀粉芽孢杆菌发酵液、甲基营养型芽孢杆菌发酵液、贝莱斯芽孢杆菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和朝鲜白头翁提取液；所述解淀粉芽孢杆菌发酵液、甲基营养型芽孢杆菌发酵液、贝莱斯芽孢杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液的活菌浓度为5
×
107～1
×
108cfc/ml。本发明在生物制剂中加入植物源抗菌剂—朝鲜白头翁，进一步提高草莓的抗病性。
9.其中，朝鲜白头翁的制备过程如下：取朝鲜白头翁干燥粉末，加入10倍重量的70％乙醇，热回流提取4小时，过滤，滤液留存，滤渣重复热回流提取2次，合并提取液；浓缩提取液至原体积的1/10～1/12，上大孔树脂d101，依次采用35％乙醇和60％乙醇洗脱，收集60％部分的洗脱液，浓缩至原体积的1/8～1/10，即为所述朝鲜白头翁提取液。
10.本发明相比现有技术具有以下优点：
11.本发明通过对多种微生物菌种的筛选，获得具有草莓病害防治效果的菌株；进一步通过复配试验，获得具有草莓病害综合防治的最佳组合。并通过草莓田间试验获得了进一步的验证。
12.本发明复合生物菌剂不仅能够有效防治草莓病害，同时还具有一定的草莓增产效果。本发明复合生物菌剂能够完全取代化学农药，适合大面积推广，有助于草莓绿色生产。
具体实施方式
13.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
14.试验菌株：
15.粉红螺旋聚孢霉(clonostachys rosea)，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmcc 5.1503；
16.解淀粉芽孢杆菌a(bacillus amyloliquefaciens),购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmcc 1.15674；
17.解淀粉芽孢杆菌b(bacillus amyloliquefaciens),购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmcc 1.8716；
18.贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis),购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmcc 1.12669；
19.甲基营养型芽孢杆菌(bacillus methylotrophicus)，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmcc 1.12059；
20.枯草芽孢杆菌a(bacillus subtilis)，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmcc 1.8955；
21.枯草芽孢杆菌b(bacillus subtilis)，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmcc 1.12939。
22.实施例1
23.菌种筛选实施例
24.自中国普通微生物菌种保藏管理中心购买多种粉红螺旋聚孢霉、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌，将购买的冻干物进行菌种活化，分别利用拟盘多毛孢、镰刀菌、灰葡萄孢菌、枯萎病原菌和炭疽病原菌进行平皿拮抗试验，测定平皿拮抗率。具体操作为：制备pda培养基，用打孔器在病原菌边缘打取直径为5mm的菌饼，将其移植在平板中央，同时将不同的菌株用牙签接种在平板四周，接种后将培养皿在28℃恒温培养，观察不同菌株对于病原菌的抑制作用。2～3天后测定相应的平皿拮抗率。
25.平皿拮抗率计算公式：拮抗率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径*100。
26.从中选取出如下具有草莓灰霉病菌、根腐病菌、炭疽病菌拮抗作用的菌株，其平皿拮抗效果如下表所示：
27.表1平皿拮抗效果
[0028][0029]
从表中给出的结果可以看出，针对灰葡萄孢菌，甲基营养型芽孢杆菌的拮抗效果更强，解淀粉芽孢杆菌a和枯草芽孢杆菌a、b也具有较强的拮抗效果。针对拟盘多毛孢和镰刀菌，粉红螺旋聚孢霉和解淀粉芽孢杆菌b、贝莱斯芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌均有较强的拮抗作用。针对疫霉菌，贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌b具有较强拮抗作用。针对草莓炭疽病病原菌，贝莱斯芽孢杆菌具有较强的拮抗作用。
[0030]
实施例2
[0031]
草莓根腐病防治用复合菌种筛选
[0032]
在百嘉利农业科技(江苏)有限公司的试验大棚内进行草莓盆栽抗病试验，以粉红螺旋聚孢霉、解淀粉芽孢杆菌a、解淀粉芽孢杆菌b、甲基营养型芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌a、贝莱斯芽孢杆菌，制备发酵液，各菌剂发酵液中活菌浓度为5
×
107～1
×
108cfc/ml。
[0033]
将苗龄为30天的大小一致的草莓(百利)幼苗分别移入盆内，缓苗15天后，分别按照下表2的处理方式加入不同的菌剂发酵液灌根处理(并以清水作为空白对照)，48h后接入病原菌(每盆接种两种根腐病病原菌40ml，浓度为107cfc/ml)，14天后计算发病率(％)＝∑(病害级别
×
该级别植株数)/(总株数
×
病害最高级值)
×
100。
[0034]
根腐病病害根据根部的发病情况分为6级：0级为根系未发病；1级为根系发病率(以下用x表示)≤30％，叶片正常；2级为30％＜x≤60％，叶片正常；3级为60％＜x≤80％，叶片变黄；4级为根系发病率80％以上，叶片枯萎；5级为整株死亡，叶片干枯。
[0035]
表2复合菌剂防治草莓根腐病效果
[0036][0037][0038]
从上表可以看出，采用本发明复合菌剂进行草莓根腐病防治均能显著降低菌株的发病率。且采用粉红螺旋聚孢霉与枯草芽孢杆菌a复合，以及解淀粉芽孢杆菌b与甲基营养型芽孢杆菌复合，对草莓根腐病的防治效果较佳。
[0039]
实施例3
[0040]
草莓灰霉病防治用复合菌种筛选
[0041]
在百嘉利农业科技(江苏)有限公司的试验大棚内进行草莓盆栽抗病试验，以粉红螺旋聚孢霉、解淀粉芽孢杆菌a、解淀粉芽孢杆菌b、甲基营养型芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌a，制备发酵液，各菌剂发酵液中活菌浓度为5
×
107～1
×
108cfc/ml。
[0042]
将苗龄为30天的大小一致的草莓(百利)幼苗分别移入盆内，缓苗15天后，分别按照下表2的处理方式加入不同的菌剂发酵液灌根处理(并以清水作为空白对照)。当天进行喷雾接种(灰霉病菌孢子悬浮液，喷雾用量为叶片表面完全湿透并低落为宜)。待对照组出现发病情况后(大约15天左右)开始统计发病情况。
[0043]
草莓灰霉病病害按照以下分级标准：
[0044]
0级，无病斑；1级，病斑面积占整个叶面积1/4以下；2级，病斑面积占整个叶面积的1/4～1/2；3级，病斑面积占整个叶面积的1/2～3/4；4级，病斑面积占整个叶面积3/4以上。
[0045]
病害严重度＝{∑(各级病叶数
×
相对级数值)/(调查总数
×
4)}；
[0046]
防治效果＝(对照组病害严重度-处理组病害严重度)/对照组病害严重度。
[0047]
表3复合菌剂防治草莓灰霉病效果
[0048][0049][0050]
从上表可以看出，当与粉红螺旋聚孢霉、解淀粉芽孢杆菌b或贝莱斯芽孢杆菌复配时，均有效提高了解淀粉芽孢杆菌a、甲基营养型芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌a对草莓灰霉病的防治效果。其中，以粉红螺旋聚孢霉20ml与解淀粉芽孢杆菌a 20ml复配，贝莱斯芽孢杆菌20ml与解淀粉芽孢杆菌a 20ml复配，及解淀粉芽孢杆菌b 20ml与甲基营养型芽孢杆菌20ml复配效果较佳。
[0051]
结合表2对草莓根腐病的防治效果，以解淀粉芽孢杆菌b 20ml与甲基营养型芽孢杆菌20ml复配为佳。
[0052]
实施例3
[0053]
复合生物菌剂的制备
[0054]
解淀粉芽孢杆菌发酵液：将购买的解淀粉芽孢杆菌b冻干物进行菌种活化后，在30℃、180rpm培养条件下，液体lb培养基中进行培养约24小时，获得种子液后，再以2％(体积浓度)的接种量接入发酵培养基，在30℃、180rpm培养条件下，发酵2天，获得发酵液，发酵液中活菌浓度为5
×
107～1
×
108cfc/ml。，发酵液中活菌浓度为5
×
107～1
×
108cfc/ml。发酵培养基的配方按照以下比例制备：蛋白胨10g，硫酸铵2.5g，牛肉浸出粉3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2g，聚乙烯醇5g，蒸馏水1000ml，ph7.2。
[0055]
甲基营养型芽孢杆菌发酵液：将购买的甲基营养型芽孢杆菌冻干物进行菌种活化后，在30℃、180rpm培养条件下，液体lb培养基中进行培养约24小时，获得种子液后，再以5％(体积浓度)的接种量接入发酵培养基，在30℃、180rpm培养条件下，发酵2天，获得发酵液，发酵液中活菌浓度为5
×
107～1
×
108cfc/ml。发酵培养基的配方按照以下比例制备：蛋白胨4g，葡萄糖12g，黄豆饼粉30g，氯化钠5g，碳酸钙1g，蒸馏水1000ml，ph7.0。
[0056]
贝莱斯芽孢杆菌发酵液：将购买的贝莱斯芽孢杆菌冻干物进行菌种活化后，在30℃、180rpm培养条件下，液体lb培养基中进行培养约24小时，获得种子液后，再以4％(体积浓度)的接种量接入发酵培养基，在30℃、180rpm培养条件下，发酵2天，获得发酵液，发酵液中活菌浓度为5
×
107～1
×
108cfc/ml。发酵培养基的配方按照以下比例制备：蛋白胨2g，葡萄糖2g，氯化钠2g，蒸馏水100ml，ph7.0。
[0057]
枯草芽孢杆菌发酵液：将购买的枯草芽孢杆菌b冻干物进行菌种活化后，在30℃、140rpm培养条件下，液体lb培养基中进行培养约48小时，获得发酵液，发酵液中活菌浓度为5
×
107～1
×
108cfc/ml。
[0058]
朝鲜白头翁提取液：取朝鲜白头翁干燥粉末，加入10倍重量的70％乙醇，热回流提取4小时，过滤，滤液留存，滤渣重复热回流提取2次，合并提取液。浓缩提取液至原体积的1/10～1/12，上大孔树脂d101，依次采用35％乙醇和60％乙醇洗脱，收集60％部分的洗脱液，浓缩至原体积的1/8～1/10。
[0059]
复合生物菌剂1：解淀粉芽孢杆菌发酵液、甲基营养型芽孢杆菌发酵液、贝莱斯芽孢杆菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液以等体积混合。
[0060]
复合生物菌剂2：解淀粉芽孢杆菌发酵液、甲基营养型芽孢杆菌发酵液、贝莱斯芽孢杆菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、朝鲜白头翁提取液以等体积混合。
[0061]
实施例4
[0062]
草莓田间病害防治效果
[0063]
选用上一年健康生长草莓种植区进行大棚试验。本试验随机设置3个处理区，每个处理区设置三个重复。3个处理区分别为空白对照区、复合生物菌剂1区、复合生物菌剂2区。
[0064]
将大棚划分为9个小区，每个小区面积为2
×
6m2，并采用随机抽签的方式分布各个处理。将苗龄为30天的大小一致的草莓(百利)幼苗移栽入大棚，缓苗后，各处理区按照抽签分布的方式分别进行灌根处理(空白对照区的土壤中施以清水，复合生物菌剂1区施以实施例3中制备得到的复合生物菌剂1，复合生物菌剂2区施以实施例3中制备得到的复合生物菌剂2，各区的施用量一致)。上述3个处理区，除缓苗后的灌根生物制剂施用不同，其它操作均相同，其他条件按照常规管理进行。试验期7个月，调查草莓发病率(发病率＝发生病害的植株数/处理区植株总数)及产量。
[0065]
表4草莓大棚试验结果
[0066][0067]
从试验结果可以看出，本发明所提供的复合生物菌剂能够有效降低草莓根腐病、灰霉病、枯萎病、炭疽病等的发病率，且具有一定的增产作用。施用复合生物菌剂2后，虽然单株产量和甜度相比施用复合生物菌剂2略有下降，但其能够进一步降低草莓发病率。