鉴定、选择和生产南方玉米锈病抗性作物的方法与流程

鉴定、选择和生产南方玉米锈病抗性作物的方法
1.相关申请的交叉引用本技术要求2019年3月11日提交的pct国际申请号pct/cn2019/077594的优先权，该申请的内容通过引用以其整体并入本技术。
2.领域该领域涉及植物育种以及鉴定和选择具有对南方玉米锈病的抗性的植物的方法。提供了鉴定编码提供植物对南方玉米锈病的抗性的蛋白的新型基因的方法及其用途。这些疾病抗性基因可用于通过育种、转基因修饰或基因组编辑而产生抗性植物。
3.对经由efs
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web作为文本文件提交的序列表的引用序列表的正式拷贝作为文本文件与说明书同时经由efs
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web提交，其符合美国信息交换标准码(ascii)，且文件名为rts21631_seq_list.txt，创建日期为2019年2月25日，且大小为24kb。经由efs
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web提交的序列表是说明书的一部分，且在此通过引用以其整体并入本文。
4.背景玉米南方锈病(scr)，一种由多堆柄锈菌(pucciniapolysoraunderw)引起的真菌病，是热带地区以及美国和中国的南部地区的主要疾病。如果scr在生长季节的关键点到达温带地区(例如美国中西部)，并且如果条件有利于锈病发展，则疾病强度可以非常快速达到流行病水平，导致严重的产量损失。温带玉米种质通常易受scr的影响。在育种程序中对抗性品系和qtl的鉴定和利用以开发对scr的抗性品种代表控制scr的一种经济有效的方式。或者，可以通过转基因或基因组编辑技术来开发携带负责scr抗性的基因的品种。抗性qtl和基因的鉴定将加速对scr抗性的产品开发。已经鉴定了抗性品系(例如brewbaker,j.l.,等人"generalresistanceinmaizetosouthernrust(pucciniapolysoraunderw.)."cropscience51,no.4(2011):1393
‑
1409)或qtl(例如jines,m.p.,等人"mappingresistancetosouthernrustinatropicalbytemperatemaizerecombinantinbredtopcrosspopulation."theoreticalandappliedgenetics114,no.4(2007):659
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667.zhang,y.,等人"mappingofsoutherncornrust
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resistantgenesinthew2dinbredlineofmaize(zeamaysl.)."molecularbreeding25,no.3(2010):433
‑
439.zhoucj,等人(2007)characterizationandfinemappingofrppq,aresistancegenetosoutherncornrustinmaize.molgenetgenomics278:723
–
728.holland,j.b.,等人"inheritanceofresistancetosoutherncornrustintropical
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by
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corn
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beltmaizepopulations."theoreticalandappliedgenetics96,no.2(1998):232
‑
241.)。然而，尚未鉴定和表征负责scr抗性的因果基因。持续需要疾病抗性植物和发现疾病抗性基因的方法。
5.概述本文提供了可用于鉴定和选择植物疾病抗性基因或“r基因”的组合物和方法。所述组合物和方法可用于选择疾病抗性植物，产生转基因抗性植物和/或产生抗性基因组编辑的植物。本文还提供了与对照植物相比具有新赋予或增强的对各种植物疾病的抗性的植
物。在一些实施方案中，所述组合物和方法可用于选择南方玉米锈病(scr)疾病抗性植物，产生转基因scr抗性植物和/或产生scr抗性基因组编辑的植物。
6.scr抗性植物可以与第二植物杂交以获得具有抗性基因等位基因的子代植物。相对于不具有有利等位基因的对照植物，可以新赋予或增强疾病抗性。scr r基因等位基因可以进一步精细至由定义的标记限定并包括定义的标记的染色体区间。在一些实施方案中，呈现用于鉴定和/或选择对scr具有抗性的植物的方法。在这些方法中，针对染色体10上与scr抗性关联的抗性基因等位基因的存在分析植物的dna，其中所述抗性基因等位基因包含mza9535
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6 (参考序列seq id no: 18的位置186)处的“t”和c06836
‑
1 (参考序列seq id no: 19的位置201)处的“a”，且如果检测到所述抗性基因等位基因，则将植物鉴定和/或选择为具有scr抗性。在一些实施方案中，用于鉴定和/或选择对scr具有抗性的植物的方法包括检测或选择包含seq id no:1的基因组区域。相对于不具有有利等位基因的对照植物，可以新赋予或增强scr抗性。在一个进一步实施方案中，scr抗性区域包含编码赋予或增强对scr的抗性的nlr03多肽的基因(“nlr03基因”)。在一些实施方案中，所述nlr03多肽包含如seq id no:2中所示的氨基酸序列。
7.在另一个实施方案中，提供了鉴定和/或选择具有scr抗性的植物的方法，其中在植物中检测到与以下中任一者连锁且关联的一个或多个标记等位基因：mza9535
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6 (参考序列seq id no: 18的位置186)处的“t”和c06836
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1 (参考序列seq id no: 19的位置201)处的“a”，且选择具有一个或多个标记等位基因的植物。所述一个或多个标记等位基因可以在基于单次减数分裂的遗传图谱上，以10 cm、9 cm、8 cm、7 cm、6 cm、5 cm、4 cm、3 cm、2 cm、1 cm、0.9 cm、0.8 cm、0.7 cm、0.6 cm、0.5 cm、0.4 cm、0.3 cm、0.2 cm或0.1 cm或更少连锁。选择的植物可以与第二植物杂交以获得具有与以下中的任一者连锁且关联的一个或多个标记等位基因的子代植物：mza9535
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6 (参考序列seq id no: 18的位置186)处的“t”和c06836
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1 (参考序列seq id no: 19的位置201)处的“a”。
8.在另一个实施方案中，本文呈现渗入与scr抗性关联的基因等位基因的方法。在这些方法中，用一个或多个标记筛选植物的群体以确定任何植物是否具有与scr抗性关联的基因等位基因，且从该群体选择至少一个具有与scr抗性关联的基因等位基因的植物。所述基因等位基因包含：mza9535
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6 (参考序列seq id no: 18的位置186)处的“t”和c06836
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1 (参考序列seq id no: 19的位置201)处的“a”。
9.在一些实施方案中，scr抗性基因从抗性品系至易感品系的渗入可以通过标记辅助的性状渗入、转基因或基因组编辑方法来实现。
10.实施方案包括分离的多核苷酸，其包含编码能够赋予对scr的抗性的nlr03多肽的核苷酸序列，其中所述nlr03多肽与seq id no:2相比时具有至少50%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性或至少99%同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸包含编码能够赋予对scr的抗性的nlr03多肽的核苷酸序列，其中所述nlr03多肽与seq id no: 2相比时具有至少50%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、和至少95%同一性的氨基酸序列。
11.本公开的额外实施方案包括包含本公开的多核苷酸(例如seq id no:1)的载体，或包含可操作地连接到至少一个调节序列的本文公开的多核苷酸的重组dna构建体。还包括各自包含本文公开的实施方案的重组dna构建体的植物细胞以及植物，以及包含重组dna
构建体的种子。
12.在一些实施方案中，所述组合物和方法涉及具有对疾病的增强的抗性的修饰植物，其中引起增强的疾病抗性的等位基因包含编码nlr03抗性基因的核苷酸序列，其中所述nlr03抗性基因与seq id no:2中所示的序列具有至少50%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%和至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性或至少99%同一性。
13.本公开包括的方法涉及用于转化宿主细胞(包括植物细胞)的方法，其包括用本公开的一个实施方案的多核苷酸转化宿主细胞；用于产生植物的方法，其包括用本公开的一个实施方案的重组dna构建体转化植物细胞，和从转化的植物细胞再生植物；和赋予或增强疾病抗性的方法，其包括用本文公开的重组dna构建体转化植物。
14.在一个实施方案中，提供了改变能够赋予疾病抗性的蛋白在植物或植物细胞中的表达水平的方法，其中所述方法包括(a)用本文公开的重组dna构建体转化植物细胞，和(b)在适合于表达重组dna构建体的条件下使转化的植物细胞生长，其中重组dna构建体的表达导致能够赋予疾病抗性的蛋白在转化的宿主中的产生水平的改变。
15.还提供了使用以上呈现的任何方法鉴定和/或选择的植物。
16.详述如本文所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述/该(the)”包括复数指示物，除非上下文中另有明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白”包括对一种或多种蛋白及其等同物的提及，等等。本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。
17.r
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基因的nbs
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lrr(“nlr”)组是迄今为止发现的最大类的r
‑
基因。在拟南芥中，预计超过150种存在于基因组中(meyers, 等人, (2003), plant cell, 15:809
‑
834; monosi, 等人, (2004), theoretical and applied genetics, 109:1434
‑
1447)，而在水稻中，已经预测了大约500种nlr基因(monosi, (2004) 同上)。r基因的nbs
‑
lrr类别由两个亚类组成。1类nlr基因在其n'末端含有tir
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toll/白介素
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1样结构域；迄今为止其仅在双子叶植物中发现(meyers, (2003)同上；monosi, (2004) 同上)。第二类nbs
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lrr在其n末端含有卷曲螺旋结构域或(nt)结构域(bai, 等人 (2002) genome research, 12:1871
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1884; monosi, (2004) 同上; pan, 等人, (2000), journal of molecular evolution, 50:203
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213)。2类nbs
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lrr在双子叶植物和单子叶植物物种两者中均有发现。(bai, (2002) 同上；meyers, (2003) 同上；monosi, (2004) 同上；pan, (2000)同上)。
18.该基因的nbs结构域似乎在植物防御机制的信号传导中起作用(van der biezen等人, (1998), current biology: cb, 8:r226
‑
r227)。lrr区域似乎是与病原体avr产物相互作用的区域(michelmore, 等人, (1998), genome res., 8:1113
‑
1130; meyers, (2003) 同上)。与nb
‑
arc (nbs)结构域相比，该lrr区域在大得多的选择压力以实现多样化(michelmore, (1998) 同上；meyers, (2003) 同上；palomino, 等人, (2002), genome research, 12:1305
‑
1315)。lrr结构域也在其他背景下发现；这些20
‑
29个残基的基序以串联阵列存在于许多具有各种功能(例如激素
‑
受体相互作用、酶抑制、细胞粘附和细胞运输)的蛋白中。许多近来研究揭示lrr蛋白参与早期哺乳动物发育、神经发育、细胞极化、基因表
达的调控和凋亡信号传导。
19.当等位基因是dna序列一部分或与之连锁或是影响性状表达的等位基因时，该等位基因与该性状“关联”。等位基因的存在是性状将如何表达的指标。
20.如本文所用，“疾病抗性的”或“具有对疾病的抗性”指与对照植物相比显示对疾病的增加抗性的植物。疾病抗性可以表现为更少和/或更小的病变，增加的植物健康，增加的产量，增加的根质量，增加的植物活力，更少或没有变色，增加的生长，减少的坏死面积或减少的枯萎。在一些实施方案中，等位基因可以显示对一种或多种疾病的抗性。
21.影响玉米植物的疾病包括但不限于细菌性叶枯病和茎杆腐烂；细菌性叶斑病；细菌性条纹病；巧克力斑病；戈斯细菌性萎蔫病和枯萎病；褐斑病；紫叶鞘；种子烂
‑
苗枯萎病；细菌性萎蔫病；玉米矮缩病；炭疽病叶枯病；炭疽病茎腐病；曲霉菌穗仁腐烂；带状的叶和鞘斑；黑束病；黑仁腐烂；白边病(borde blanco)；褐斑病；黑斑病；茎腐病；头孢菌核腐烂；炭腐病；伏革菌穗腐病；弯孢霉叶斑；亚隔孢壳属叶斑病；色二孢属穗腐和茎腐病；色二孢属穗腐病；种子腐烂病；玉米苗枯萎病；色二孢属叶斑或叶条斑病；霜霉病；棕色条纹霜霉病；疯顶霜霉病；绿穗霜霉病；禾本科霜霉病；爪哇霜霉病；菲律宾霜霉病；高粱霜霉病；甜根子草霜霉病；甘蔗霜霉病；干穗腐病；麦角症；马牙病(horse's tooth)；玉米眼斑病；镰刀菌穗和茎腐烂病；镰刀菌枯萎病；幼苗根腐病；赤霉菌属穗和茎腐烂病；灰穗腐病；灰叶斑病；尾孢菌叶斑病；长蠕孢霉根腐病；单孢枝霉菌穗腐病；枝孢属腐烂病；透斑菌叶斑病；晚萎蔫病；北方叶枯病；白瘟病(white blast)；冠茎腐病；玉米条纹病；北方叶斑病；长蠕孢霉穗腐病；青霉菌穗腐病；玉米蓝眼病；蓝霉病；暗色座腔孢茎腐和根腐病；暗球腔菌叶斑病；囊孢菌穗腐病；葡萄座腔菌穗腐病；棘壳孢属茎腐和根腐病；腐霉菌根腐病；腐霉菌茎腐病；红仁病；丝核菌穗腐病；菌核腐病；丝核菌根腐和茎腐病；rostratum叶斑病；常见的玉米锈病；南方玉米锈病；热带玉米锈病；菌核穗腐病；南方枯萎病；壳月孢属叶斑病；鞘腐病；壳腐病；青贮霉病；普通黑穗病；假黑穗病；头黑穗病；南方玉米叶枯病和茎腐病；南方叶斑病；焦油斑点病；木霉属穗腐和根腐病；白色穗腐病；根茎腐烂病；黄叶枯萎病；带状叶斑病；美国小麦条纹病(小麦条纹花叶病)；大麦条纹花叶病；大麦黄矮病；雀麦花叶病；谷物褪绿斑驳病；致命性坏死(玉米致死性坏死病)；黄瓜花叶病；约翰逊草花叶病；玉米丛矮病；玉米褪绿矮缩病；玉米褪绿斑驳病；玉米矮花叶病；玉米叶枯斑病；玉米透明环斑病；玉米雷亚朵非纳病；玉米红叶和红条纹病；玉米红条纹病；玉米环斑病；玉米粗矮病；玉米不育矮化病；玉米斑纹病；玉米条纹病；玉米雄穗败育(maize tassel abortion)；玉米叶脉突起病；玉米鼠耳病；玉米白叶病；玉米白线花叶病；小米红叶病；和北方谷物花叶病。
22.影响植物的疾病包括但不限于细菌性枯萎病；细菌叶条纹病；根腐病；谷物腐烂病；褐鞘病；枯萎；褐斑病；冠鞘腐病；霜霉病；眼斑病；假黑穗病；核黑穗病；叶黑穗病；叶焦病；窄褐叶斑病；根腐病；苗枯萎病；鞘枯萎病；鞘腐病；鞘斑病；链格孢菌叶斑病；和茎腐病。
23.影响大豆植物的疾病包括但不限于链格孢菌叶斑病；炭疽病；黑叶枯萎病；黑根腐病；褐斑病；褐茎腐病；炭腐病；标笄霉叶枯病；霜霉病；内脐蠕孢枯萎病；蛙眼叶斑病；小光壳叶斑病；mycoleptodiscus根腐病；新赤壳属茎腐病；拟茎点霉属种子腐烂；疫霉菌根和茎腐烂；叶点霉叶斑病；瘤梗孢属根腐病；豆荚和茎枯萎病；白粉病；紫斑病；棘壳孢属叶斑病；腐霉属腐病；红冠腐病；疏毛核菌霉属叶斑病；丝核菌气枯病；丝核菌根和茎腐烂病；锈病；痂病；核盘菌茎腐病；菌核枯萎病；茎溃疡病；葡柄霉属叶枯萎病；猝死综合征；靶斑病；酵母
斑病；矛线虫病；病变线虫病；针线虫病；肾形线虫病；环形线虫病；根结线虫病；鞘线虫病；胞囊线虫病；螺旋线虫病；刺线虫病；短根线虫病；矮化线虫病；苜蓿花叶病；菜豆荚斑驳病；豆黄色花叶病；巴西芽枯病；褪绿斑驳病；黄色花叶病；花生斑驳病；花生条纹病；花生矮化病；褪绿斑驳病；皱叶；矮化病；严重矮化病；和烟草环斑病或芽枯病。
24.影响卡诺拉油菜植物的疾病包括但不限于细菌性黑腐病；细菌性叶斑病；细菌性荚腐病；细菌性软腐病；痂病；冠瘿病；链格孢属黑斑病；炭疽病；根朽病；黑霉腐病；黑根病；褐色环剥根腐病；尾孢菌叶斑病；根肿病；霜霉病；镰刀菌萎蔫病；灰霉病；头腐病；叶斑病；轻叶斑病；荚腐病；白粉病；环斑病；根腐病；核盘菌茎腐；种子腐烂，猝倒病；根瘿黑穗病；南方枯萎病；轮枝菌属萎蔫病；白枯病；白叶斑病；枯梢病；枯黄病；皱缩病毒病；花叶病病毒病；黄化病毒病。
25.影响向日葵植物的疾病包括但不限于根尖萎黄病；细菌性叶斑病；细菌性萎蔫病；冠瘿病；欧文氏菌茎腐和头腐病；lternaria叶枯病，茎斑和头腐病；葡萄孢头腐病；炭腐病；霜霉病；镰刀菌茎腐病；镰刀菌萎蔫病；漆斑菌叶和茎斑病；瓶霉菌黄化病；茎点霉菌黑茎病；拟茎点霉棕色茎溃疡病；瘤梗孢属根腐病；疫霉菌茎腐病；白粉病；腐霉属苗枯萎和根腐病；丝核菌苗枯萎病；根霉菌头腐病；向日葵锈病；菌核基茎和根腐病；壳针孢属叶斑病；轮枝孢属萎蔫病；白锈病；黄锈病；dagger；pin；病变；肾形；根结；和褪绿斑驳病。
26.影响高粱植物的疾病包括但不限于细菌性叶斑病；细菌叶斑纹病；细菌性叶条纹病；枝顶孢属萎蔫病；炭疽病；炭腐病；疯顶霜霉病；猝倒和种子腐烂病；麦角症；镰刀菌头枯萎病，根和茎腐病；谷物储存霉变；灰叶斑病；后叶斑病；叶枯病；milo疾病；椭圆形叶斑病；梢腐病(pokkah boeng)；腐霉属根腐病；粗糙叶斑病；锈病；苗枯萎和种子腐烂病；坚核黑穗病；头黑穗病；松核黑穗病；条斑病；霜霉病；焦油斑点病；靶斑病；以及带状叶斑和鞘枯萎病。
27.与对照植物相比，具有疾病抗性的植物的对疾病的抗性可增加5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%。在一些实施方案中，与对照植物相比，植物在疾病存在的情况下可以具有增加5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%的植物健康。
28.如本文所用，术语“染色体区间”指位于植物中单个染色体上的连续线性的基因组dna范围。位于单个染色体区间上的遗传元件或基因是物理上连锁的。染色体区间的大小没有具体限制。在一些方面，位于单个染色体区间内的基因元件在遗传上连锁，遗传重组距离通常为例如小于或等于20cm，或者可替代地小于或等于10cm。即，位于单个染色体区间内的两个基因元件以小于或等于20%或10%的频率经历重组。
29.在本技术中，短语“紧密连锁”意指两个连锁基因座之间重组的发生频率为等于或小于约10%(即在基因图谱上分开不超过10cm)。换句话说，紧密连锁的基因座在至少90%的时间共分离。当标记基因座展示与所需性状(例如对南方玉米锈病的抗性)共分离(连锁)的显著概率时，它们对于本公开的主题而言尤其有用。紧密连锁的基因座如标记基因座和第二基因座可展示10%或更低，优选约9%或更低，仍更优选约8%或更低，又更优选约7%或更低，仍更优选约6%或更低，又更优选约5%或更低，仍更优选约4%或更低，又更优选约3%或更低，且仍更优选约2%或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座展示约1%或更低的重组频率，例如约0.75%或更低，更优选约0.5%或更低，或又更优选约0.25%或
更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10% (例如约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。在一些情况下，两个不同标记可以具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记彼此紧密接近，使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。
30.术语“杂交的”或“杂交”指有性杂交，并且涉及经由授粉产生二倍体子代(例如细胞、种子或植物)的单倍体配子融合。该术语包括一个植物被另一个植物授粉和自交(或自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植物时)二者。
[0031]“优良品系”是源自育种并选择优异农学性能的任何品系。
[0032]“外来品种”、“热带品系”或“外来种质”是来源于不属于可利用优良品系或品种的种质的植物的品种。在两个植物或品种的种质之间的杂交的情况下，外来种质的世系不与它杂交的优良种质密切相关。最常见地，外来种质不来源于任何已知的优良品系，而是选择将新的遗传元件(通常新等位基因)引入育种程序。
[0033]“有利等位基因”是在特定基因座(标记、qtl、基因等)的等位基因，它赋予或有助于农学上所需表型，例如疾病抗性，并允许对具有农学上所需表型的植物的鉴定。标记的有利等位基因是与有利表型一起分离的标记等位基因。
[0034]“遗传标记”是群体中的多态的核酸，并且其中可通过一种或多种分析方法检测并区分它们的等位基因，例如rflp、aflp、同功酶、snp、ssr等。该术语也指与基因组序列互补的核酸序列，如用作探针的核酸。对应于群体成员之间的遗传多态性的标记可以通过本领域充分建立的方法进行检测。这些包括例如基于pcr的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性(rflp)的检测、同功酶标记的检测、通过等位基因特异性杂交的多核苷酸多态性(ash)的检测、植物基因组的扩增可变序列的检测、自我维持序列复制的检测、简单序列重复(ssr)的检测、单核苷酸多态性(snp)的检测、或扩增片段长度多态性(aflp)的检测。充分建立的方法也已知用于检测表达序列标签(est)和来源于est序列的ssr标记以及随机扩增的多态性dna (rapd)。
[0035]“种质”指个体(例如植物)、一组个体(例如植物品系、品种或家族)、或源自品系、品种、物种、或培养物的克隆，或者更具体地，物种内或几种物种(例如，玉米种质保藏中心或andean种质保藏中心)的所有个体的遗传物质，或来自它们的遗传物质。种质可以是生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞分离。种质通常提供具有特异性分子构成的遗传物质，其提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传品质的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植物的细胞、种子或组织，或者植物部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们可以被培养成完整植物。
[0036]“单倍型”是个体在多个基因座上的基因型，即等位基因的组合。通过单倍型描述的基因座通常是物理上和遗传上连锁的，即在相同染色体片段上。
[0037]
术语“异质”用于指明一组内的个体在一个或多个特定基因座的基因型不同。
[0038]
材料的杂种优势反应或“杂种优势”可以通过与其他不同或无关的群杂交时，超过亲本(或高亲本)的平均值的表现来定义。
[0039]“杂种优势群”包含一组基因型，它们在与来自不同杂种优势群的基因型杂交时表现良好(hallauer等人(1998)corn breeding，第463
‑
564页，g.f. sprague和j.w. dudley(编辑)，corn and corn improvement)。将近交系归类为杂种优势群，并且将其进一步细分
为杂种优势群内的家族，所述分类基于几种标准如谱系、基于分子标记的关联、以及在杂交体组合中的性能(smith等人(1990)theor. appl. gen. 80：833
‑
840)。美国两种最广泛使用的杂种优势群称为“爱荷华州坚杆综合种(iowa stiff stalk synthetic)”(本文中也称为“坚杆”)和“lancaster”或“lancaster sure crop”(有时称为nss或非
‑
坚杆)。
[0040]
一些杂种优势群具有需要成为雌性亲本的性状，而其他则具有用于雄性亲本的性状。例如，在玉米中，来自从称为bsss的群体(爱荷华州坚杆综合种群体)释放的公共近交系的产量结果导致这些近交系及其衍生物成为中部玉米带的雌性库。bsss近交系已与其他近交系(例如sd 105和maiz amargo)杂交，并且这种通用的材料群已被称为坚杆综合种(sss)，尽管不是所有的近交系都源自最初的bsss群体(mikel和dudley (2006) crop sci: 46:1193
‑
1205)。在默认情况下，与sss近交系良好组合的所有其他近交系都已分配至雄性库，由于缺乏更好的名称，因此将其指定为nss，即非
‑
坚杆。该群包括几个主要的杂种优势群，例如lancaster surecrop、iodent和leaming corn。
[0041]
术语“同质”指一个组的成员在一个或多个特定基因座具有相同基因型。
[0042]
术语“杂交体”指至少两个基因相异的亲本之间杂交获得的子代。
[0043]
术语“近交系”指已经进行育种以获得遗传同质性的品系。
[0044]
术语“插入缺失(indel)”指插入或缺失，其中可将一个品系称为相对于第二品系具有插入的核苷酸或dna片段，或者可将第二品系称为相对于第一品系具有缺失的核苷酸或dna片段。
[0045]
术语“渗入”指基因座的所需等位基因从一种遗传背景到另一种遗传背景的传递。例如，在特定基因座的所需等位基因的渗入可以经由相同物种的两个亲本之间的有性杂交传递到至少一个子代，其中至少一个亲本在其基因组中具有所需等位基因。或者，例如等位基因的传递能够通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中至少其中一个供体原生质体在其基因组中具有所需等位基因。所需等位基因可以例如通过与表型相关的标记，在qtl处，转基因等检测。可以将包含所需等位基因的子代与具有所需遗传背景的品系反复回交并选择所需等位基因以产生变得固定在选择遗传背景中的等位基因。
[0046]
当重复“渗入”的过程两次或更多次时，该过程常被称为“回交”。
[0047]“品系”或“品种”是一组具有相同亲本的个体，它们一般是某种程度的近交系，并且一般在大多数基因座处是纯合的和同质的(同基因的或接近同基因的)。“亚系”指子代的近交系亚群，它们与相同祖先来源的其他相似近交系亚群在遗传上不同。
[0048]
如本文所用，术语“连锁”用于描述一个标记基因座与另一个标记基因座或一些其他基因座关联的程度。分子标记和影响表型的基因座之间的连锁关系用“概率”或“调整概率”表示。连锁可以表示为所需限度或范围。例如，在一些实施方案中，当标记以单次减数分裂图谱(基于已经经历一轮减数分裂的群体、如诸如f2的遗传图谱；ibm2图谱由多次减数分裂组成)的小于50、40、30、25、20、或15图谱单位(或cm)分离时，任何标记与任何其他标记连锁(基因上和物理上)。在一些方面，限定加括号的连锁范围是有利的，例如10cm和20cm之间，10cm和30cm之间，或者10cm和40cm之间。标记与第二基因座的连锁越紧密，标记对第二基因座的指示越好。因此，“紧密连锁的基因座”，如标记基因座和第二基因座展示10%或更低，优选约9%或更低，仍更优选约8%或更低，又更优选约7%或更低，仍更优选约6%或更低，又
更优选约5%或更低，仍更优选约4%或更低，又更优选约3%或更低，且仍更优选约2%或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座展示约1%或更低的重组频率，例如约0.75%或更低，更优选约0.5%或更低，或又更优选约0.25%或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10% (例如约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。因为1cm是显示1%的重组频率的两个标记之间的距离，任何标记与紧密接近(例如在10cm或小于10cm的距离)的任何其他标记紧密连锁(基因上和物理上)。在相同染色体上的两个紧密连锁的标记可定位在彼此相距9cm、8cm、7cm、6cm、5cm、4cm、3cm、2cm、1cm、0.75cm、0.5cm或0.25cm或更小。
[0049]
术语“连锁不平衡”指遗传基因座或性状(或两者)的非随机分离。在任一情况下，连锁不平衡暗示相关的基因座沿着一定长度的染色体在物理上足够接近，使得它们以大于随机(即非随机)的频率一起分离。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁基因座在超过50%的时间、例如约51%至约100%的时间下共分离。换句话说，共分离的两个标记具有小于50%的重组频率(并且根据定义，在相同连锁群上分离小于50cm)。如本文所用，连锁可以在两个标记之间或者可替代地在标记和影响表型的基因座之间。标记基因座可以与性状相“关联”(连锁)。测量标记基因座和影响表型性状的基因座的连锁程度，例如分子标记与表型共分离的统计学概率(例如f统计学或lod评分)。
[0050]
连锁不平衡最常见地使用量度r2评价，所述量度r2通过hill，w.g.和robertson，a，theor. appl. genet. 38：226
‑
231(1968)所述的公式计算。当r2=1时，两个标记基因座间存在完全的ld，意味着标记还未通过重组分离并且具有相同的等位基因频率。r2值将取决于使用的群体。r2值大于1/3指示ld足够强，从而可用于作图(ardlie等人，nature reviews genetics 3：299
‑
309(2002))。因此，当成对标记基因座之间的r2值大于或等于0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0时，等位基因处于连锁不平衡。
[0051]
如本文所用，“连锁平衡”描述其中两个标记独立地分离的情况，即，在子代中随机分选。显示连锁平衡的标记被认为不连锁(无论它们是否位于相同染色体上)。
[0052]“基因座”是例如其中核苷酸、基因、序列或标记位于染色体上的位置。
[0053]“优势对数(lod)值”或“lod评分”(risch，science 255：803
‑
804(1992))用于遗传区间作图以描述两个标记基因座之间的连锁程度。两个标记之间的lod评分为三，指示连锁概率比不连锁的概率高1000倍，而lod评分为二，指示连锁概率比不连锁的概率高100倍。大于或等于二的lod评分可用于检测连锁。lod评分也可以用于显示“数量性状基因座”作图中标记基因座和数量性状之间的关联强度。在这种情况下，lod评分的大小取决于标记基因座与影响数量性状的基因座的接近程度以及数量性状效应的大小。
[0054]
术语“植物”包括：完整植物、植物细胞、植物原生质体、可从其中再生植物的植物细胞或组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中的完整的植物团块和植物细胞，如种子、花、子叶、叶、茎、芽、根、根尖等。如本文所用，“修饰植物”意指由于人为干预而具有遗传变化的任何植物。修饰植物可能具有通过植物转化、基因组编辑或常规植物育种引入的遗传变化。
[0055]“标记”是发现遗传或物理图谱上的位置或标记和性状基因座(影响性状的基因座)间的连锁的手段。标记所检测的位置可通过检测多态性等位基因及其基因作图而获知，
或通过对已经进行物理作图的序列进行杂交、序列匹配或扩增而获知。标记可以是dna标记(检测dna多态性)、蛋白(检测所编码多肽的变异)或简单遗传的表型(诸如“蜡质”表型)。可从基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如，剪接的rna或cdna)开发dna标记。根据dna标记技术，所述标记可以由侧接所述基因座的互补引物和/或与该基因座处的多态性等位基因杂交的互补探针组成。dna标记，或遗传标记，还可以被用于描述染色体自身上的基因、dna序列或核苷酸(而不是用于检测基因或dna序列的组分)，并且当该dna标记与人类遗传学中的特定性状关联时经常被使用(例如，针对乳腺癌的标记)。术语标记基因座是标记所检测的基因座(基因、序列或核苷酸)。
[0056]
标记可由其所检测的多态性的类型以及用于检测所述多态性的标记技术所限定。标记类型包括但不限于，例如，限制性片段长度多态性(rflp)的检测、同功酶标记的检测、随机扩增的多态性dna (rapd)、扩增片段长度多态性检测(aflp)、简单序列重复(ssr)的检测、植物基因组的扩增可变序列的检测、自我维持序列复制的检测或单核苷酸多态性(snp)的检测。snp可例如经由以下检测：dna测序、基于pcr的序列特异性扩增方法、通过等位基因特异性杂交(ash)对多核苷酸多态性的检测、动态等位基因特异性杂交(dash)、分子信标、微阵列杂交、寡核苷酸连接酶测定、flap内切核酸酶、5'内切核酸酶、引物延伸、单链构象多态性(sscp)或温度梯度凝胶电泳(tgge)。dna测序(诸如焦磷酸测序技术)具有能够检测组成单倍型的一系列连锁的snp等位基因的优点。单倍型倾向于比snp更具信息性(检测更高水平的多态性)。
[0057]“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指群体中在标记基因座处发现的多个多态性核苷酸序列之一。
[0058]
(mas的)“标记辅助的选择”是一种基于标记基因型选择个别植物的方法。
[0059]“标记辅助的反选择”是一种通过其将标记基因型用于鉴定植物的方法，所述植物将不被选择，使得它们被从育种程序或种植中除去。
[0060]“标记单倍型”指在标记基因座处的等位基因的组合。
[0061]“标记基因座”是物种的基因组中的特定染色体位点，其中可发现特定标记。标记基因座可用于追踪第二连锁基因座、例如影响表型性状的表达的连锁基因座的存在。例如，标记基因座可用于监测等位基因在遗传上或在物理上连锁的基因座处的分离。
[0062]
术语“分子标记”可用于指在鉴定连锁基因座时用作参照点的遗传标记(如上文所定义)，或其编码产物(例如，蛋白)。标记可以来源于基因组核苷酸序列或来源于表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的rna、cdna等)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或侧接标记序列的核酸序列，如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是可用于鉴定标记基因座的存在的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。或者，在一些方面，分子探针指能够区别(即基因分型)存在于标记基因座处的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性杂交时，核酸是“互补的”。当位于插入缺失区域，例如本文所述的非共线区域时，本文所述的一些标记也称为杂交标记。这是因为，根据定义，插入区域是相对于无插入的植物的多态性。因此，标记仅需要指示插入缺失区域是否存在。任何合适的标记检测技术都可用于鉴定这样的杂交标记，例如snp技术用于本文提供的实例中。
[0063]
当等位基因与性状连锁时，以及当等位基因的存在是所需性状或性状形式将不发
生在包含等位基因的植物中的指标时，等位基因与性状“负”相关。
[0064]
术语“表型”、“表型性状”或“性状”可以指基因或一系列基因的可观察到的表达。该表型可以由肉眼，或通过任何其他评估方式，例如称重、计数、测量(长度、宽度、角度等)、显微镜检查、生化分析或机电测定法，观察到。在一些情况下，表型直接被单个基因或遗传基因座控制，即“单一基因性状”或“简单遗传性状”。在没有高水平的环境变化的情况下，单个基因性状可以在群体中分离，以产生“定性”或“离散”分布，即表型落入离散类别。在其他情况下，表型是几种基因的结果，并且可以被视为“多基因性状”或“复杂性状”。多基因性状在群体中分离以产生“定量”或“连续”分布，即表型不能分为离散类别。单基因和多基因性状两者均可以受到所在的表达环境的影响，但多基因性状倾向于具有较大的环境成分。
[0065]
基因组的“物理图谱”是显示染色体dna上可鉴定的界标(包括基因、标记等)的线性顺序的图谱。然而，与基因图谱相比，界标之间的距离是绝对的(例如以碱基对测量的或分离的或重叠的邻接基因片段)并且不基于基因重组(其在不同群体中可以变化)。
[0066]“多态性”是群体内的两个或更多个个体之间的dna中的变化。多态性在群体中优选具有至少1%的频率。有用多态性可以包括单核苷酸多态性(snp)、简单序列重复(ssr)或插入/缺失多态性，所述插入/缺失多态性本文也称为“插入缺失”。
[0067]“生产标记”或“生产snp标记”是已经为高通量目的而开发的标记。生产snp标记被开发用于检测特异性多态性，并且被设计用于多种化学反应和平台。
[0068]
术语“数量性状基因座”或“qtl”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种群体中)，与数量表型性状的差异表达关联的dna区域。qtl的区域涵盖影响所讨论的性状的一个或多个基因或与之紧密连锁。
[0069]“参考序列”或“共有序列”是用作序列比较的基础的限定序列。标记的参考序列通过对多个品系进行在该基因座的测序、在序列比对程序(例如sequencher)中比对核苷酸序列、且然后获得比对的最共同核苷酸序列而获得。在各个序列间发现的多态性在共有序列内注释。参考序列通常不是任何单个dna序列的精确拷贝，而是代表可用序列的混合物，并且可用于针对序列内多态性设计引物和探针。
[0070]
标记的“不利等位基因”是与不利植物表型一起分离的标记等位基因，因此提供鉴定可以从育种程序或种植中移除的植物的有益效果。
[0071]
术语“产量”指具有商业价值的特定植物产品的每单位面积的生产率。产量受遗传和环境因素二者的影响。“农学”、“农学性状”和“农学性能”指给定植物品种的性状(以及基础的遗传元件)，所述性状促成经生长季节的过程的产量。单个农学性状包括出苗活力、营养活力、胁迫耐受性、疾病抗性或耐受性、除草剂抗性、分枝、开花、结实率、种子大小、种子密度、抗倒伏性、脱粒率等等。因此，产量是所有农学性状的最终结果。
[0072]
本文提供了标记基因座，其展示了与赋予针对特定的一种或多种疾病的广泛抗性的疾病抗性状在统计学上显著的共分离。这些基因座或额外连锁基因座和抗性基因的检测可以在标记辅助选择中用作育种程序的一部分，以产生具有对一种或多种疾病的抗性的植物。
[0073]
基因作图在很长一段时间里，已经认识到可以在生物的基因组中对与特定表型(例如疾病抗性)关联的特定基因座作图。有利地，植物育种人员可使用分子标记，通过检测标记等位
基因鉴定所需个体，所述标记等位基因显示与所需表型共分离的统计学显著的概率，表现为连锁不平衡。通过鉴定与目的性状共分离的分子标记或分子标记簇，育种人员能够通过选择适当的分子标记等位基因来迅速选择所需表型(该过程称为标记辅助选择或mas)。
[0074]
多种方法可用于检测与目的性状(例如疾病抗性性状)共分离的分子标记或分子标记簇。这些方法的基本思想是检测其替代基因型(或等位基因)具有显著不同的平均表型的标记。因此，比较标记基因座之间的替代基因型(或等位基因)之间的差异的幅度或该差异的显著性水平。推断性状基因定位于最靠近如下标记，所述标记具有最大的关联的基因型差异。两种用于检测目的性状基因座的这样的方法是：1)基于群体的关联分析(即关联作图)和2)传统的连锁分析。
[0075]
关联作图了解基因组中的连锁不平衡(ld)的程度和模式是开发有效的关联方法以鉴定和作图数量性状基因座(qtl)的先决条件。连锁不平衡(ld)指个体集合中等位基因的非随机关联。当在连锁基因座处的等位基因中观察到ld时，将其测量为跨染色体的特定区域的ld衰减。ld的程度反映该区域的重组历史。基因组中的ld衰减的平均速率可以帮助预测进行全基因组关联研究所需的标记的数量和密度，并提供可以预期的分辨率估计。
[0076]
关联或ld作图目的在于鉴定重要的基因型
‑
表型关联。它已被用作用于在异型杂交物种、例如人类(corder等人 (1994)
ꢀ“
protective effect of apolipoprotein
‑
e type
‑
2 allele for late
‑
onset alzheimer
‑
disease,
”ꢀ
nat genet 7:180
‑
184; hastbacka等人 (1992)
ꢀ“
linkage disequilibrium mapping in isolated founder populations: diastrophic dysplasia in finland,
”ꢀ
nat genet 2:204
‑
211; kerem等人 (1989)
ꢀ“
identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis,
”ꢀ
science 245:1073
‑
1080)和玉米(remington等人, (2001)
ꢀ“
structure of linkage disequilibrium and phenotype associations in the maize genome,
”ꢀ
proc natl acad sci usa 98:11479
‑
11484; thornsberry等人 (2001)
ꢀ“
dwarf8 polymorphisms associate with variation in flowering time,”nat genet 28:286
‑
289; 由flint
‑
garcia等人 (2003)
ꢀ“
structure of linkage disequilibrium in plants,
”ꢀ
annu rev plant biol. 54:357
‑
374综述)中的精细作图的有力工具，其中杂合子间的重组是频繁的，并且导致ld的迅速衰减。在其中无法基因检测到纯合基因型间的重组的近交物种中，ld的程度更大(即，更大块的连锁标记被一起遗传)，并且这急剧增强关联作图的检测能力(wall和pritchard (2003)“haplotype blocks and linkage disequilibrium in the human genome,
”ꢀ
nat rev genet 4:587
‑
597)。
[0077]
群体的重组和突变历史取决于交配习惯以及群体的有效大小和年龄。大群体大小提供了增强的检测重组的可能性，而较老群体通常与更高水平的多态性关联，这两者均促成观察到的加速的ld衰减速率。另一方面，较小的有效群体大小，例如已经历最近的遗传瓶颈的群体，倾向于显示较慢的ld衰减速率，导致更广泛的单倍型保守性(flint
‑
garcia等人 (2003)
ꢀ“
structure of linkage disequilibrium in plants,
”ꢀ
annu rev plant biol. 54:357
‑
374)。
[0078]
优良的育种品系为关联分析提供了宝贵的起点。关联分析在分析中使用数量表型评分(例如，每个品系的疾病耐受性等级为1至9)(与在群间等位基因分布类型的分析中仅
查看耐受性和抗性等位基因频率分布相反)。通过育种程序在多年和环境中收集的大量优良品系的详细表型表现数据的可用性为遗传标记关联作图分析提供了宝贵的数据集。这为研究和应用之间的无缝整合铺平了道路，并利用历史积累的数据集。但是，了解多态性和重组之间的关系对于开发有效地从这些资源提取最大信息的适当策略是有用的。
[0079]
这种类型的关联分析既不生成也不需要任何图谱数据，而是与图谱位置无关。该分析将植物的表型评分与各个基因座处的基因型进行比较。随后，可以任选地使用任何合适的图谱(例如，复合图谱)，使用先前确定的标记的图谱位置来帮助观察鉴定的qtl标记的分布和/或qtl标记聚类。
[0080]
传统的连锁分析传统的连锁分析的基本原理相同；然而，ld通过从少量创始者产生群体生成。选择创始者以使构建的群体内的多态性水平最大化，并且评价多态性位点与给定表型的共分离水平。许多统计学方法已经用于鉴定显著的标记
‑
性状关联。一种这样的方法是区间作图方法(lander和botstein，genetics 121：185
‑
199(1989)，其中对沿基因图谱(如1cm的区间)的许多位点中的每一个，测试控制目的性状的基因位于该位点的概率。基因型/表型数据用于计算每个测试位点的lod评分(概率比率的对数)。当lod评分大于阈值时，存在控制目的性状的基因位于基因图谱上的该位点上的显著证据(它将位于两个特定标记基因座之间)。
[0081]
本文提供了标记基因座，其展示了统计学显著的与疾病抗性性状的共分离，如通过传统的连锁分析和通过全基因组关联分析所确定。对这些基因座或额外连锁基因座的检测可以用于标记辅助的育种程序中，以产生具有疾病抗性的植物。
[0082]
标记辅助育种程序中的活动可能包括但不限于：基于历史基因型和农学性状关联，在新的育种群体中进行选择，以鉴定哪个群体具有有利核酸序列的最高频率，在育种群体中在子代间选择有利的核酸序列，基于子代表现的预测在亲本品系中进行选择，和基于有利核酸序列的存在推进种质改良活动中的品系。
[0083]
染色体区间提供了与疾病抗性性状关联的染色体区间。多种方法可用于鉴定染色体区间。拖拉这样的染色体区间的边界以涵盖将与控制目的性状的基因连锁的标记。换句话说，拖拉染色体区间使得位于该区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)能够被用作疾病抗性性状的标记。
[0084]
相反地，例如如果非常接近的两个标记显示与所需表型性状共分离，有时分不清楚是否那些标记中的每一个鉴定相同基因或两个不同的基因或多个基因。无论如何，在特定物理/基因组区间中有多少基因的知识，对于进行或实施本公开中呈现的内容不是必要的。
[0085]
染色体10区间可能涵盖本文鉴定为与scr抗性关联的任何标记，包括mza9535
‑
6 (参考序列seq id no: 18的位置186)处的“t”和c06836
‑
1 (参考序列seq id no: 19的位置201)处的“a”。位于这些区间内的任何标记可以用作scr抗性的标记，并且可以在本文呈现的方法的背景中用于鉴定和/或选择具有对scr的抗性的植物，无论是新授予的还是与对照植物相比是增强的。在某些实施方案中，位于nlr03基因位置的上游和下游的标记在遗传和物理上非常紧密地连锁，并且因此可以用于选择nlr03基因用于性状渗入和产物开发。
[0086]
染色体区间也可以通过与疾病抗性基因连锁(显示连锁不平衡)的标记限定，并且
r2是关联性研究的背景中连锁不平衡(ld)的常见量度。如果目的区间中的染色体7标记基因座和邻近的另一个染色体7标记基因座之间ld的r2值大于1/3(ardlie等人，nature reviews genetics 3：299
‑
309(2002))，则所述基因座与彼此是连锁不平衡的。
[0087]
标记和连锁关系连锁的常见量度是性状共分离的频率。这可以表示为共分离百分比(重组频率)，或者厘摩(cm)。cm是基因重组频率的量度单位。1cm等于在单一世代中，由于交换导致的在一个基因座上的性状将与在另一个基因座上的性状分离的概率为1%(意味着性状99%的时间下共分离)。因为染色体距离与性状间交换事件的频率近似成比例，存在与重组频率关联的近似物理距离。
[0088]
标记基因座本身是性状，并且能够通过在分离期间跟踪标记基因座、根据标准连锁分析进行评估。因此，1cm等于在单一世代中，由于交换标记基因座将与另一个基因座分离的1%的概率。
[0089]
标记距离控制目的性状的基因越近，则标记作为期望性状的指标越有效和有利。紧密连锁的基因座展示约10%或更低，优选约9%或更低，仍更优选约8%或更低，又更优选约7%或更低，仍更优选约6%或更低，又更优选约5%或更低，仍更优选约4%或更低，又更优选约3%或更低，且仍更优选约2%或更低的基因座间交换频率。在高度优选的实施方案中，相关基因座(例如标记基因座和靶基因座)展示约1%或更低的重组频率，例如约0.75%或更低，更优选地约0.5%或更低，或又更优选地约0.25%或更低的重组频率。因此，所述基因座分开约10cm、9cm、8cm、7cm、6cm、5cm、4cm、3cm、2cm、1cm、0.75cm、0.5cm或0.25cm或更低。换句话说，位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10%(例如约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、或更低)的两个基因座称为彼此“接近”。
[0090]
尽管特定标记等位基因可以与疾病抗性性状共分离，但重要的是注意到标记基因座不一定负责表达疾病抗性表型。例如，不要求标记多核苷酸序列是负责疾病抗性表型的基因的部分(例如是基因开放阅读框的部分)。特定标记等位基因和疾病抗性性状之间的关联，是由于在等位基因从中起源的祖先品系中，标记等位基因和等位基因之间最初的“耦合”连锁相。最后，通过反复重组，标记和基因座之间的交换事件可以改变这种取向。由于这个原因，有利标记等位基因可根据存在于具有疾病抗性的亲本中的连锁相发生改变，所述具有疾病抗性的亲本用于产生分离群体。这不改变可使用标记监测表型的分离的事实。它仅仅改变认为哪个标记等位基因在给定分离群体中是有利的。
[0091]
本文呈现的方法包括检测植物中的与疾病抗性相关联的一个或多个标记等位基因的存在，且然后鉴定和/或选择在那些标记基因座处具有有利等位基因的植物。标记已在本文中鉴定为与疾病抗性状关联，并且因此可用于预测植物中的疾病抗性。50 cm、40 cm、30 cm、20 cm、15 cm、10 cm、9 cm、8 cm、7 cm、6 cm、5 cm、4 cm、3 cm、2 cm、1 cm、0.75 cm、0.5 cm或0.25 cm内的任何标记(根据基于单次减数分裂的遗传图谱)也可以用于预测植物中的疾病抗性。
[0092]
标记辅助的选择分子标记可用于多种植物育种应用(如参见staub等人(1996)hortscience 31：729
‑
741；tanksley(1983)plant molecular biology reporter. 1：3
‑
8)。主要目的领域之
一是使用标记辅助选择(mas)增加回交和渗入基因的效率。展示与影响所需表型性状的基因座连锁的分子标记提供了在植物群体中选择性状的有用工具。当表型难以测定时，尤其如此。由于dna标记测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定大得多的群体，增加了发现具有从供体品系移动至受体品系的靶区段的重组体的概率。连锁越紧密，标记越有用，这是因为重组不太可能发生于标记和引起性状的基因之间，所述重组可导致假阳性。由于需要双重组事件，侧接标记减少假阳性选择将发生的概率。理想情况是基因本身中具有标记，使得标记和基因之间的重组不能发生。在一些实施方案中，本文公开的方法在疾病抗性基因中产生标记，其中通过从保守结构域的聚类或聚类分析推断基因组位置来鉴定该基因。
[0093]
当通过mas渗入基因时，不仅引入了基因而且引入了侧接区域(gepts.(2002)crop sci；42：1780
‑
1790)。这称为“连锁累赘”。在供体植物与受体植物高度不相关的情况下，这些侧接区域携带可编码农学上不良性状的附加基因。该“连锁累赘”也可导致产量减少或其他负面农学特性，即便在与优良品系多轮回交之后。这有时也称为“产量累赘”。侧接区域的大小可通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为育种人员不能控制该区域的大小或重组断点(young等人(1998)genetics 120：579
‑
585)。在经典育种中，通常只是单凭偶然因素选择有助于减小供体区段大小的重组(tanksley等人(1989) biotechnology 7：257
‑
264)。即使在这种类型的回交中20次回交后，可预期找到仍与所选的基因连锁的供体染色体的相当大的片段。然而，使用标记则有可能选择那些在目的基因附近经历重组的稀有个体。在150个回交植物中，有95%的概率至少一个植物将在基因的1cm (基于单次减数分裂图谱距离)内经历交换。标记将允许明确鉴定那些个体。对于300个植物的一次附加回交，在基因的另一侧的1cm单次减数分裂图谱距离内有95%的交换概率，从而产生在靶基因附近小于2cm (基于单次减数分裂的图谱距离)的片段。使用标记可以在两代中实现这一点，而不用标记则需要平均100代(参见tanksley等人，同上)。当已知基因的确切位置时，围绕基因的侧接标记可用于在不同的群体大小中选择重组。例如，在更小的群体大小中，可以预期重组进一步远离基因，因此需要更远端的侧接标记来检测重组。
[0094]
实施mas的关键组分是：(i) 限定将在其中测定标记
‑
性状关联的群体，其可以是分离群体、或随机的或结构化的群体；(ii)监测多态性标记相对于性状的分离或关联，并使用统计学方法确定连锁或关联；(iii)基于统计学分析的结果限定一组所需标记，和(iv)使用和/或外推该信息至当前组的育种种质，以使得能够作出基于标记的选择决定。本公开中描述的标记，以及其他标记类型、例如ssr和flp，可用于标记辅助的选择方案。
[0095]
ssr可以被定义为相对少量的长度为6bp或更短的串联重复的dna(tautz (1989) nucleic acid research 17: 6463
‑
6471; wang等人 (1994) theoretical and applied genetics, 88:1
‑
6)。多态性由于重复单元数量的变化而增加，可能是由dna复制期间的滑移导致的(levinson和gutman (1987) mol biol evol 4: 203
‑
221)。重复长度的变化可通过对保守的非重复侧接区域设计pcr引物来检测(weber和may (1989) am j hum genet. 44:388
‑
396)。ssr非常适于作图和mas，因为它们是多等位基因的、共显性的、可再现的，并且适合高通量自动化(rafalski等人 (1996) generating and using dna markers in plants. 于: non
‑
mammalian genomic analysis: a practical guide. academic press. pp 75
‑
135)。
[0096]
可生成各种类型的ssr标记，并且ssr概况可通过扩增产物的凝胶电泳获得。标记基因型的评分基于扩增片段的大小。
[0097]
也可生成各种类型的flp标记。最常见地，扩增引物用于生成片段长度多态性。这样的flp标记在很多方面类似于ssr标记，不同的是由引物扩增的区域通常不是高度重复区域。通常由于插入或缺失，扩增区域或扩增子在种质间还具有足够的可变性，使得由扩增引物产生的片段可以在多态性个体间区分开，并且已知这样的插入缺失频繁发生于玉米中(bhattramakki等人(2002). plant mol biol 48, 539
‑
547; rafalski (2002b), 同上)。
[0098]
snp标记检测单碱基对核苷酸取代。在所有分子标记类型中，snp是最丰富的，因此具有提供最高基因图谱分辨率的潜能(bhattramakki等人2002 plant molecular biology 48:539
‑
547)。snp可以在甚至比ssr更高的通量水平上进行检测，即以所谓的“超高通量”模式进行检测，因为snp不需要大量dna，并且可直接进行自动化检测。snp也具有成为相对低成本系统的前景。这三个因素一起使得snp对在mas中的应用具有高度吸引力。几种方法可用于snp基因分型，包括但不限于杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶切割、微测序和编码球。这样的方法已经综述于：gut (2001) hum mutat 17 pp. 475
‑
492; shi (2001) clin chem 47, pp. 164
‑
172; kwok (2000) pharmacogenomics 1, pp. 95
‑
100; 以及bhattramakki和rafalski (2001) discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants. 于: r. j. henry, ed, plant genotyping: the dna fingerprinting of plants, cabi publishing, wallingford。各种各样市售的技术利用这些和其他方法来检查snp，包括masscode.tm. (qiagen)、invader
®
. (third wave technologies)和invader plus
®
, snapshot
®
. (applied biosystems)、taqman
®
. (applied biosystems)和beadarrays
®
. (illumina)。
[0099]
许多一起在序列内、或跨越连锁序列的snp可用于描述任何特定基因型的单倍型(ching等人 (2002), bmc genet. 3:19 pp gupta等人 2001, rafalski (2002b), plant science 162:329
‑
333)。单倍型可以比单个snp提供更多信息，并且是对任何特定基因型更具有描述性的。例如，单个snp对于具有疾病抗性的特定品系或品种可以是等位基因“t”，但是等位基因“t”也可以发生在用于轮回亲本的育种群体中。在这种情况下，单倍型例如在连锁snp标记处的等位基因组合可提供较多的信息。一旦已经将唯一的单倍型分配给供体染色体区域，该单倍型可用于该群体或其任何亚群中以确定个体是否具有特定基因。参见例如wo2003054229。使用自动化高通量标记检测平台使得该方法高效和有效。
[0100]
本文呈现的许多标记可以容易地用作单核苷酸多态性(snp)标记，以选择nlr03基因。使用pcr，引物用于扩增来自代表目的群体中的多样性的个体(优选近交系)的dna区段。pcr产物直接在一个或两个方向上测序。比对所得序列并鉴定多态性。多态性不限于单核苷酸多态性(snp)，而且还包括插入缺失、caps、ssr和vntr(可变数目的串联重复)。具体地，关于本文所述的精细图谱信息，可以容易地使用本文提供的信息来在由本文公开的引物扩增的区域内获得额外的多态性snp(和其他标记)。可以将所述的图谱区域内的标记与bac或其他基因组文库杂交，或与基因组序列进行电子比对，以在与所描述的标记相同的近似位置中找到新序列。
[0101]
除了如上所述的ssr、flp和snp以外，也广泛使用其他类型的分子标记，包括但不限于表达序列标签(est)、来源于est序列的ssr标记、随机扩增多态性dna(rapd)、以及其他
基于核酸的标记。
[0102]
在一些情况下，同功酶概况和连锁的形态学特征也可以间接用作标记。尽管它们不直接检测dna差异，它们通常也受特定的遗传差异影响。然而，检测dna变异的标记远远多于同功酶或形态学标记并且更具多态性(tanksley (1983) plant molecular biology reporter 1:3
‑
8)。
[0103]
序列比对或重叠群也可用于发现本文列出的特定标记的上游或下游的序列。靠近本文所述的标记的这些新序列然后被用于发现和开发功能等同的标记。例如将不同的物理和/或基因图谱进行比对以定位等同标记，所述标记没有在本公开中描述，但是位于相似区域内。这些图谱可在物种中，或者甚至跨越已经进行遗传上或物理上比对的其他物种。
[0104]
通常，mas使用经鉴定具有与性状(如scr疾病抗性性状)共分离的显著概率的多态性标记。推测这样的标记被作图在赋予植物其疾病抗性表型的一个或多个基因接近，并且认为这样的标记是期望性状的指示、或标记。测试植物在标记中存在所需等位基因，并且预期在一个或多个基因座处含有所需基因型的植物将所需基因型与所需表型一起转移至它们的子代。因此，可以通过检测一个或多个标记等位基因来选择具有scr疾病抗性的植物，并且此外，还可以选择源自那些植物的子代植物。因此，获得在给定的染色体区域中含有所需基因型(即与疾病抗性关联的基因型)的植物，且然后与另一植物杂交。然后将使用一种或多种标记在基因型上评估这种杂交的子代，且然后将在给定的染色体区域中具有相同基因型的子代植物选择为具有疾病抗性。
[0105]
snp可以单独使用或组合使用(即snp单倍型)以选择与scr疾病抗性关联的有利的抗性基因等位基因。例如，如下的snp单倍型：在mza9535
‑
6 (参考序列seq id no: 18的位置186)处的“t”和在c06836
‑
1 (参考序列seq id no: 19的位置201)处的“a”，或其组合。
[0106]
技术人员将预期可能在通过本文所述的方法鉴定的染色体标记中以及周围的标记基因座处存在附加的多态性位点，其中一个或多个多态性位点与单倍型中的一个或多个多态性位点的等位基因处于连锁不平衡(ld)，并且因此可用于标记辅助的选择程序中以渗入目的基因等位基因或基因组片段。如果在所述位点之一处存在等位基因倾向于预测在相同染色体上的另一位点处存在等位基因，则在不同多态性位点处的两个特定等位基因被称作处于ld，(stevens, mol. diag. 4:309
‑
17 (1999))。标记基因座可位于疾病抗性性状qtl的5 cm、2 cm或1 cm(在基于单次减数分裂的遗传图谱)内。
[0107]
技术人员将理解，等位基因频率(和因此，单倍型频率)可以从一个种质库到另一个种质库不同。种质库由于成熟度差异、杂种优势分组、地理分布等而不同。因此，在一些种质库中，snp和其他多态性可能无法提供信息。
[0108]
植物组合物通过上述任何方法鉴定、修饰和/或选择的植物也是令人感兴趣的。
[0109]
蛋白及其变体和片段本公开涵盖nlr03多肽。如本文所用的“nlr03多肽”和“nlr03蛋白”可互换地指具有scr抗性活性的多肽且与seq id no:2的nlr03多肽具有足够的同一性。考虑多种nlr03多肽。
[0110]
本文使用“足够的同一性”来指具有至少约70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，序列同一性针对多肽的全长序列。当在本文中与序列同一性百分比一起使用时，术语“约”意指 /
‑ꢀ
1.0%。
[0111]
本文使用“重组蛋白”来指不再处于其天然环境中、例如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中的蛋白；从已从其天然版本编辑的多核苷酸表达的蛋白；或从相对于天然序列不同的基因组位置中的多核苷酸表达的蛋白。
[0112]
如本文所用的“基本上不含细胞材料”指多肽，包括蛋白的制剂，其具有少于约30%、20%、10%或5%(以干重计)的非靶标蛋白(在本文中也称为“污染蛋白”)。
[0113]“片段”或“生物活性部分”包括多肽或多核苷酸片段，其包含分别与nlr03多肽或多核苷酸具有足够的同一性的序列，并且当在植物中表达时表现出疾病抗性。
[0114]
如本文所用的“变体”指具有如下氨基酸序列的蛋白或多肽，该氨基酸序列与亲本氨基酸序列具有至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性。
[0115]
在一些实施方案中，nlr03多肽包含与seq id no:2的氨基酸序列的全长或片段具有至少约40%、45%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性的氨基酸序列，其中所述nlr03多肽当在植物中表达时具有scr抗性。
[0116]
这样的操作的方法在本领域中是普遍已知的。例如，可以通过dna中的突变来制备nlr03多肽的氨基酸序列变体。这还可以通过几种诱变形式(例如位点特异性双链断裂技术)之一和/或在定向进化中来完成。在一些方面，在氨基酸序列中所编码的变化将基本上不影响该蛋白的功能。这样的变体将具有所需活性。然而，应当理解，可以通过在本公开的组合物上使用这样的技术改进nlr03多肽赋予疾病抗性的能力。
[0117]
核酸分子及其变体和片段提供了包含编码nlr03多肽或其生物活性部分的核酸序列的分离或重组的核酸分子，以及足以用作杂交探针以鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白的核酸分子的核酸分子。如本文所用，术语“核酸分子”指dna分子(例如，重组dna、cdna、基因组dna、质粒dna、线粒体dna)和rna分子(例如，mrna)以及使用核苷酸类似物而产生的dna或rna的类似物。该核酸分子可以是单链的或双链的，但优选地是双链的dna。
[0118]
在本文中使用“分离的”核酸分子(或dna)来指不再处于其天然环境中，例如处于体外的核酸序列(或dna)。在本文中使用“重组”核酸分子(或dna)来指在重组细菌或植物宿主细胞中；已经从其天然序列编辑；或位于与天然序列不同的位置中的核酸序列(或dna)。在一些实施方案中，“分离的”或“重组的”核酸是不含在衍生出该核酸的生物体的基因组dna中天然地侧接该核酸的序列(即，位于该核酸的5'和3'末端的序列)(优选编码蛋白的序列)。出于本公开的目的，“分离的”或“重组的”当用于指核酸分子时排除分离的染色体。例如，在各个实施方案中，编码nlr03多肽的重组核酸分子可以包含小于约5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb或0.1 kb的核酸序列，该核酸序列在衍生出该核酸的细胞的基因组dna中天然地侧接该核酸分子。
[0119]
在一些实施方案中，与天然或基因组核酸序列相比，编码nlr03多肽的分离的核酸分子在核酸序列中具有一个或多个变化。在一些实施方案中，天然或基因组核酸序列中的
变化包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列的变化；与天然或基因组序列相比，由于氨基酸取代、插入、缺失和/或添加造成的核酸序列的变化；一个或多个内含子的除去；一个或多个上游或下游调节区域的缺失；和与基因组核酸序列相关的5'和/或3'非翻译区域的缺失。在一些实施方案中，编码nlr03多肽的核酸分子是非基因组序列。
[0120]
考虑了编码nlr03多肽或相关蛋白的多种多核苷酸。当可操作地连接至合适的启动子、转录终止和/或聚腺苷酸化序列时，这样的多核苷酸可用于在宿主细胞中生产nlr03 k多肽。这样的多核苷酸还可用作用于分离编码nlr03多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸的探针。
[0121]
在一些实施方案中，编码nlr03多肽的核酸分子是具有seq id no:2中所示的序列及其变体、片段和互补序列的多核苷酸。在本文中使用“互补序列”来指与给定核酸序列充分互补的核酸序列，使得其可以与该给定核酸序列杂交从而形成稳定的双链体。在本文中使用“多核苷酸序列变体”来指除遗传密码的简并性之外编码相同多肽的核酸序列。
[0122]
在一些实施方案中，编码nlr03多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。如本文所用，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”指与天然或基因组核酸序列相比，具有核酸序列的一个或多个变化的核酸分子。在一些实施方案中，天然或基因组核酸分子的变化包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列的变化；用于在植物中表达的核酸序列的优化；与天然或基因组序列相比，引入至少一个氨基酸取代、插入、缺失和/或添加的核酸序列的变化；除去与该基因组核酸序列相关的一个或多个内含子；插入一个或多个异源内含子；缺失与该基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下游调节区；插入一个或多个异源上游或下游调节区；缺失与该基因组核酸序列相关的5'和/或3'非翻译区；插入异源5'和/或3'非翻译区；和聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施方案中，非基因组核酸分子是合成的核酸序列。
[0123]
在一些实施方案中，编码本文公开的nlr03多肽的核酸分子是非基因组多核苷酸，其具有与seq id no:2的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的核苷酸序列，其中所述nlr03多肽当在植物中表达时具有scr抗性活性。
[0124]
在一些实施方案中，所述核酸分子编码nlr03多肽变体，其包含对seq id no:2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代。
[0125]
实施方案也涵盖作为编码nlr03多肽的这些核酸序列的片段的核酸分子。如本文所用的“片段”指编码nlr03多肽的核酸序列的一部分。核酸序列的片段可以编码nlr03多肽的生物活性部分，或者它可以是可以使用下文公开的方法用作杂交探针或pcr引物的片段。作为编码nlr03多肽的核酸序列的片段的核酸分子包含至少约150、180、210、240、270、300、330、360、400、450或500个连续核苷酸或高达存在于编码通过本文公开的方法鉴定的nlr03多肽的全长核酸序列中的核苷酸数目，这取决于预期用途。在本文中使用“连续核苷酸”来指彼此紧邻的核苷酸残基。实施方案的核酸序列的片段将编码保留nlr03多肽的生物学活性并因此保留疾病抗性的蛋白片段。在本文中使用“保留疾病抗性”来指具有如seq id no:2中所示的全长nlr03多肽的疾至少约10%、至少约30%、至少约50%、至少约70%、80%、90%、95%
或更高的病抗性的多肽。
[0126]
相对于参考序列(主题)的“百分比(%)序列同一性”被确定为，在比对序列并引入空位(如果必要)以实现最大的百分比序列同一性并且不考虑将任何氨基酸保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列(查询)中与参考序列中的各个氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。用于确定百分比序列同一性的比对可以以多种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，例如blast、blast
‑
2。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置数目的函数(例如，查询序列的百分比同一性 = 查询和主题序列之间的相同位置数目/查询序列的位置总数
ꢀ×
100)。
[0127]
在一些实施方案中，nlr03多核苷酸编码包含与跨seq id no:2的氨基酸序列的整个长度具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的nlr03多肽。
[0128]
所述实施方案还涵盖编码nlr03多肽变体的核酸分子。编码nlr03多肽的核酸序列的“变体”包括编码通过本文公开的方法鉴定的nlr03多肽、但是由于遗传密码的简并性而存在保守差异的那些序列，以及如上所述的具有足够的同一性的那些序列。通过使用众所周知的分子生物学技术，例如聚合酶链式反应(pcr)和如下文概述的杂交技术，可以鉴定天然存在的等位基因变体。变体核酸序列还包括经合成衍生的核酸序列，该核酸序列已经例如通过使用定点诱变而产生，但是仍然编码本文公开的nlr03多肽。
[0129]
技术人员将进一步了解，可以通过核酸序列的突变来引入变化，从而导致编码的nlr03多肽的氨基酸序列的改变，而不改变这些蛋白的生物活性。因此，变体核酸分子可以通过以下产生：将一个或多个核苷酸取代、添加和/或缺失引入本文所公开的相应的核苷酸序列中，这样使得将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入所编码的蛋白中。可以通过标准技术引入突变，例如定点诱变和pcr介导的诱变。本公开也涵盖这样的变体核酸序列。
[0130]
或者，可以通过沿编码序列的全部或部分随机引入突变(例如通过饱和诱变)来制备变体核酸序列，并且可以筛选所得突变体赋予活性的能力，以鉴定保留活性的突变体。在诱变之后，经编码的蛋白可以进行重组地表达，并且可以使用标准的测定技术来确定蛋白的活性。
[0131]
除了例如ausubel、berger和sambrook中所述的标准克隆方法之外，本公开的多核苷酸及其片段任选用作各种重组和递归(recursive)重组反应的底物，即，以产生具有所需特性的另外的多肽同源物及其片段。各种这样的反应是已知的。用于生产在此列出的任何核酸的变体的方法(其包括将这样的多核苷酸与第二(或更多)多核苷酸递归重组，从而形成变体多核苷酸文库)也是本公开的实施方案，所产生的文库、包含所述文库的细胞和通过这样的方法产生的任何重组多核苷酸也是如此。另外，这样的方法任选地包括基于活性从这些文库中选择变体多核苷酸，正如其中这样的递归重组在体外或体内进行。
[0132]
各种多样性产生方案，包括核酸递归重组方案是可获得的。该程序可以单独和/或组合使用以产生核酸或核酸集合的一种或多种变体，以及所编码蛋白的变体。单独地或整体地，这些程序提供了产生多样化的核酸和核酸集合(包括例如核酸文库)的稳健且广泛适用的方式，所述方式可用于，例如，具有新的和/或改进的特征的核酸、蛋白、途径、细胞和/或生物体的工程化或快速进化。
[0133]
虽然为了清楚起见，在随后的讨论过程中作出了区分和分类，但是应当理解，这些技术通常不是相互排斥的。实际上，各种方法可以单独使用或组合、平行或串联使用，以便取得不同的序列变体。
[0134]
本文所述的任何多样性产生程序的结果可以是一种或多种核酸的产生，其可以选择或筛选具有或赋予所需特性的核酸或编码具有或者赋予所需特性的蛋白的核酸。通过本领域技术人员可以在本文或以其他方式获得的一种或多种方法进行多样化之后，可以针对所需活性或特性，例如，在所需ph下的这种活性等选择所产生的任何核酸。这可以包括通过本领域任何测定来鉴定可以例如以自动化或可自动化形式检测的任何活性。各种相关(或甚至不相关)的特性可以由执业者酌情串联或平行评估。
[0135]
实施方案的核苷酸序列还可以用于从不同来源分离相应的序列。以这种方式，可以使用如pcr、杂交等方法来鉴定这样的序列(基于其与通过本文公开的方法鉴定的序列的序列同源性)。实施方案涵盖基于其与本文阐明的全部序列或其片段的序列同一性选择的序列。这样的序列包括作为该序列的直系同源物的序列。术语“直系同源物”指衍生自共同祖先基因并且由于物种形成而在不同物种中发现的基因。当其核苷酸序列和/或其编码的蛋白序列共有如本文其他地方所定义的实质同一性时，在不同物种中发现的基因被认为是直系同源物。
[0136]
在pcr方法中，可以设计寡核苷酸引物用于pcr反应，以从由任何目的生物体提取的cdna或基因组dna扩增相应的dna序列。用于设计pcr引物以及pcr克隆的方法公开于sambrook等人, (1989) molecular cloning: a laboratory manual (第2版, cold spring harbor laboratory press), plainview , new york))，以下为“sambrook”中。还参见，innis等人编辑, (1990) pcr protocols: a guide to methods and applications (academic press，new york)；innis和gelfand编辑, (1995) pcr strategies (academic press, new york)；和innis和gelfand编辑, (1999) pcr methods manual (academic press , new york)。已知的pcr方法包括但不限于：使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
[0137]
在杂交方法中，全部或部分核酸序列可用于筛选cdna或基因组文库。用于构建这样的cdna和基因组文库的方法公开于sambrook和russell，(2001)，同上。所谓的杂交探针可以是基因组dna片段、cdna片段、rna片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团(如32p或任何其他可检测的标记，如其他放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)进行标记。用于杂交的探针可以通过标记合成寡核苷酸来制备，所述合成寡核苷酸基于本文公开的编码已知多肽的核酸序列。可以另外使用简并引物，所述简并引物是基于在核酸序列或所编码的氨基酸序列中的保守性核苷酸或氨基酸残基而设计的。所述探针典型地包含以下核酸序列的区域，该核酸序列区域在严格条件下与编码多肽的核酸序列或其片段或变体的至少约12个、至少约25个、至少约50、75、100、125、150、175或200个连续核苷酸杂交。用于制备用于杂交的探针的方法和严格条件公开于sambrook和russell, (2001), 同上。
[0138]
核苷酸构建体、表达盒和载体本文使用术语“核苷酸构建体”并不旨在将实施方案限制为包含dna的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到，核苷酸构建体，特别是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合构成的多核苷酸和寡核苷酸也可用于本文公开的方法中。实施方案
60:217
‑
25)、camv 35s增强子(参见，例如，benfey等人, (1990) embo j. 9:1685
‑
96)和也可以使用的美国专利号7,803,992的增强子。以上转录增强子的列表并不意指是限制性的。任何适当转录增强子都可用于实施方案中。
[0145]
终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的目的dna序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可以衍生自另一种来源(即，对于启动子、目的序列、植物宿主、或其任何组合而言是外源的或异源的)。
[0146]
方便的终止区可获自根癌农杆菌(a. tumefaciens)的ti质粒，诸如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见，guerineau, 等人, (1991) mol. gen. genet. 262:141
‑
144; proudfoot, (1991) cell 64:671
‑
674; sanfacon, 等人, (1991) genes dev. 5:141
‑
149; mogen, 等人, (1990) plant cell 2:1261
‑
1272; munroe, 等人, (1990) gene 91:151
‑
158; ballas, 等人, (1989) nucleic acids res. 17:7891
‑
7903和joshi, 等人, (1987) nucleic acid res. 15:9627
‑
9639。
[0147]
适当时可以优化核酸以增加在宿主生物体中的表达。因此，在宿主生物体是植物的情况下，合成核酸可以使用植物偏好性密码子来合成以改进表达。对于宿主偏好性使用的讨论，参见，例如，campbell和gowri, (1990) plant physiol. 92:1
‑
11。例如，虽然在单子叶和双子叶植物物种中均可以表达实施方案的核酸序列，但是可以修饰序列，以解决单子叶或双子叶植物特异的偏好和gc含量偏好，这是因为这些偏好已经显示差异(murray等人 (1989) nucleic acids res. 17:477
‑
498)。因而，特定氨基酸的植物偏好可以源自来自植物的已知基因序列。
[0148]
已知另外的序列修饰以增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除编码假多腺苷酸化信号、外显子
‑
内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列和得到充分表征的、可能不利于基因表达的其他序列。可以将序列的gc含量调整至给定细胞宿主的平均水平，如参考在该宿主细胞中表达的已知基因而计算的。如本文所用的术语“宿主细胞”指包含载体并支持期望的表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖类或哺乳动物细胞、或单子叶或双子叶植物细胞。单子叶宿主细胞的实例是玉米宿主细胞。当可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mrna结构。
[0149]
在制备表达盒时，可以操作各种dna片段，以提供处于适当取向以及合适时，处于适当阅读框中的dna序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接dna片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制位点、移除多余的dna、移除限制位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再取代(例如转换和颠换)。
[0150]
许多启动子可用于实施所述实施方案。可基于所需结果，选择启动子。核酸可与组成性、组织偏好性、可诱导的或其他启动子组合用于在宿主生物体中的表达。
[0151]
植物转化所述实施方案的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物。如本文所用，“引入”意指以如下方式将多核苷酸或多肽呈递给植物，使得该序列能够进入植物细胞的内部。所述实施方案的方法不取决于用于将多核苷酸或多肽引入植物中的具体方法，只要该多核苷酸或多肽能够进入该植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
[0152]
如本文所用的“稳定转化”意指经引入植物中的核苷酸构建体整合至该植物的基
因组中，并且能够被其子代遗传。如本文所用的“瞬时转化”意指将多核苷酸引入该植物中并且不整合至该植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。如本文所用的“植物”指完整植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、及其胚和子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。
[0153]
转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案可以根据靶向用于转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而变化。将核苷酸序列引入植物细胞中并随后插入植物基因组中的合适方法包括显微注射(crossway等人, (1986) biotechniques 4:320
‑
334)、电穿孔(riggs等人, (1986) proc. natl. acad. sci. usa 83:5602
‑
5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(paszkowski等人, (1984) embo j 3:2717
‑
2722)以及弹道粒子加速(参见例如，美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244和5,932,782；tomes等人, (1995) plant cell, tissue, and organ culture: fundamental methods，gamborg和phillips编辑(springer
‑
verlag，berlin )；和mccabe等人, (1988) biotechnology 6:923
‑
926)；以及lecl转化法(wo 00/28058)。对于马铃薯转化法，参见tu等人, (1998) plant molecular biology 37:829
‑
838和chong等人, (2000) transgenic research 9:71
‑
78。另外的转化程序可见于：weissinger等人, (1988) ann. rev. genet. 22:421
‑
477；sanford等人, (1987) particulate science and technology 5:27
‑
37(洋葱)；christou等人, (1988) plant physiol. 87:671
‑
674(大豆)；mccabe等人, (1988) bio/technology 6:923
‑
926 (大豆)；finer和mcmullen, (1991) in vitro cell dev. biol. 27p:175
‑
182(大豆)；singh等人, (1998) theor. appl. genet. 96:319
‑
324(大豆)；datta等人, (1990) biotechnology 8:736
‑
740 (水稻)；klein等人, (1988) proc. natl. acad. sci. usa 85:4305
‑
4309(玉米)；klein等人, (1988) biotechnology 6:559
‑
563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；klein等人, (1988) plant physiol. 91:440
‑
444(玉米)；fromm等人, (1990) biotechnology 8:833
‑
839(玉米)；hooykaas
‑
van slogteren等人, (1984) nature(伦敦)311:763
‑
764；美国专利号5,736,369(谷类)；bytebier等人, (1987) proc. natl. acad. sci. usa 84:5345
‑
5349(百合科)；de wet等人, (1985) the experimental manipulation of ovule tissues , chapman等人编辑, (longman, new york [纽约]), 第197
‑
209页(花粉)；kaeppler等人, (1990) plant cell reports 9:415
‑
418和kaeppler等人, (1992) theor. appl. genet. 84:560
‑
566 (晶须介导的转化)；d'halluin等人, (1992) plant cell 4:1495
‑
1505(电穿孔)；li等人, (1993) plant cell reports ，12:250
‑
255以及christou和ford, (1995) annals of botany 75:407
‑
413 (水稻)；osjoda等人, (1996) nature biotechnology 14:745
‑
750(经由根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)的玉米)。
[0154]
将基因组编辑技术引入植物的方法在一些实施方案中，可以使用基因组编辑技术将多核苷酸组合物引入植物的基因组中，或者可以使用基因组编辑技术编辑植物基因组中先前引入的多核苷酸。例如，可以通过使用双链断裂技术(如talen、大范围核酸酶、锌指核酸酶、crispr
‑
cas等)将鉴定的多核苷酸引入植物基因组中所需位置。例如，为了位点特异性插入的目的，可以使用crispr
‑
cas
系统将所鉴定的多核苷酸引入基因组中所需位置。植物基因组中所需位置可以是任何对于插入来说所需靶标位点，例如适于育种的基因组区域，或者可以是位于具有现有的目的性状的基因组窗口中的靶标位点。现有的目的性状可以是内生性状或先前引入的性状。
[0155]
在一些实施方案中，在已经在基因组中鉴定nlr03基因等位基因的情况下，可以使用基因组编辑技术来改变或修饰多核苷酸序列。可以将位点特异性修饰引入所需的nlr03基因等位基因多核苷酸的位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的那些修饰，所述方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如talen、大范围核酸酶、锌指核酸酶、crispr
‑
cas等。这样的技术可用于通过在引入的多核苷酸内的核苷酸的插入、缺失或取代来修饰先前引入的多核苷酸。或者，可以使用双链断裂技术向引入的多核苷酸中添加另外的核苷酸序列。可以添加的另外的序列包括另外的表达元件(例如增强子和启动子序列)。在另一个实施方案中，可以使用基因组编辑技术在植物基因组内定位紧邻nlr03多核苷酸组合物的另外的疾病抗性蛋白，以产生疾病抗性蛋白的分子堆叠物。
[0156]“改变的靶标位点”、“改变的靶标序列”、“修饰的靶标位点”和“修饰的靶标序列”在本文中可互换地使用，并且意指如本文公开的靶标序列，当与非改变的靶标序列相比时，该靶标序列包括至少一种改变。这样的“改变”包括，例如：(i) 至少一个核苷酸的替代、(ii) 至少一个核苷酸的缺失、(iii) 至少一个核苷酸的插入、或(iv) (i)
‑
(iii)的任何组合。
[0157]
实施方案在实施方案1中，提供了鉴定具有增加的南方玉米锈病抗性的植物的方法，其中所述方法包括：在植物中检测与增加的南方玉米锈病抗性相关联的抗性基因等位基因，其中所述抗性基因等位基因包含：mza9535
‑
6 (参考序列seq id no: 18的位置186)处的“t”和c06836
‑
1 (参考序列seq id no: 19的位置201)处的“a”；和将包含所述抗性基因等位基因的植物鉴定为具有南方玉米锈病抗性qtl等位基因，其中所述鉴定的植物具有增加的南方玉米锈病抗性。
[0158]
在实施方案2中，提供了实施方案1的方法，其进一步包括从育种程序中反向选择植物。
[0159]
在实施方案3中，提供了鉴定具有增加的南方玉米锈病抗性的植物的方法，其中所述方法包括：在植物的基因组中检测以下中的任一种：i. 编码具有seq id no:2中所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；ii. 编码具有与seq id no:2具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；iii. 包含seq id no:1中所示的序列的多核苷酸；或iv. (i)或(ii)的5 cm内与(i)或(ii)连锁且关联的一个或多个标记等位基因；和如果检测到(i)、(ii)或(iii)中的任一种，则将植物鉴定为具有增加的南方玉米锈病抗性。
[0160]
在实施方案4中，提供了增加植物中南方玉米锈病抗性的方法，其包括在植物中表
达重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码具有与seq id no:2中所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；其中与不包含所述重组多核苷酸的对照植物相比，表达所述重组多肽的植物在所述植物中具有增加的南方玉米锈病抗性。
[0161]
在实施方案5中，提供了实施方案4的方法，其中所述重组多核苷酸还包含异源启动子。
[0162]
在实施方案6中，提供了实施方案1
‑
5中任一项的方法，其进一步包括获得源自表达所述重组多核苷酸的植物的后代植物，其中与不包含所述重组多核苷酸的对照植物相比时，所述后代植物在其基因组中包含所述重组多核苷酸并且表现出增加的南方玉米锈病抗性。
[0163]
在实施方案7中，提供了实施方案1
‑
6中任一项的方法，其中所述植物选自：拟南芥、玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
[0164]
在实施方案8中，提供了实施方案1
‑
7中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。
[0165]
在实施方案9中，提供了实施方案1
‑
8中任一项的方法，其中所述方法鉴定nlr03基因的变体，所述nlr03基因的变体给予植物增加的南方玉米锈病抗性，所述方法包括以下步骤：通过基因改组组合一个或多个编码seq id no:2的一个或多个片段、与seq id no:2具有至少90%同一性的蛋白或其片段的核苷酸序列，以产生nlr03基因的变体；和鉴定表现出增加的南方玉米锈病抗性的变体。
[0166]
在实施方案10中，提供了实施方案1
‑
9中任一项的方法，其中所述方法还包括以下步骤：将包含通过实施方案1
‑
9中任一项的方法鉴定的nlr03基因的变体的重组构建体引入可再生植物细胞中；在步骤(a)之后从所述可再生植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组dna构建体；和选择(b)的转基因植物，其中与不包含所述重组dna构建体的对照植物相比时，所述转基因植物包含所述重组dna构建体并且表现出增加的南方玉米锈病抗性。
[0167]
在实施方案11中，提供了实施方案1
‑
10中任一项的方法，其中所述植物选自：拟南芥、玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
[0168]
在实施方案12中，提供了实施方案1
‑
11中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。
[0169]
在实施方案13中，提供了实施方案1
‑
12中任一项的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍。
[0170]
在实施方案14中，提供了实施方案1
‑
13中任一项的方法，其中提供了鉴定nlr03基因的等位基因变体的方法，其中所述等位基因变体与增加的南方玉米锈病耐受性关联，所述方法包括以下步骤：获得植物的群体，其中所述植物表现出不同水平的南方玉米锈病抗性；
针对编码包含seqidno:2的蛋白的多核苷酸序列或在调节编码所述蛋白的多核苷酸的表达的基因组区域中，评估等位基因变异；将等位基因变异与对南方玉米锈病的增加抗性相关联；和鉴定与增加的南方玉米锈病抗性关联的等位基因变体。
[0171]
在实施方案15中，提供了实施方案1
‑
14中任一项的方法，其还包括检测与增加的南方玉米锈病抗性关联的等位基因变体，和如果检测到所述等位基因变体，则选择植物。
[0172]
在实施方案16中，提供了将nlr03基因的等位基因变体引入植物基因组的方法，其中所述等位基因变体与增加的南方玉米锈病抗性关联，所述方法包括使用锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(talen)、crispr/cas系统或大范围核酸酶在内源性nlr03基因中引入突变，使得所述等位基因变体包含编码与seqidno:2具有至少90%同一性的蛋白的多核苷酸序列。
[0173]
在实施方案17中，提供了重组dna构建体，其包含与至少一个调节序列可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与seqidno:2相比时具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
[0174]
在实施方案18中，提供了实施方案17的重组dna构建体，其中所述至少一个调节序列是在植物细胞中有功能的启动子。
[0175]
在实施方案19中，提供了实施方案17或18的重组dna构建体，其中所述多核苷酸包含与seqidno:1具有至少95%序列同一性的核酸序列。
[0176]
在实施方案19中，提供了转基因植物细胞，其包含实施方案17
‑
19中任一项的重组dna构建体。
[0177]
在实施方案20中，提供了转基因植物，其包含实施方案20的转基因植物细胞。
[0178]
在实施方案21中，实施方案21的转基因植物，其中所述转基因植物选自：拟南芥、玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
[0179]
在实施方案22中，提供了由实施方案20或21的转基因植物产生的转基因种子。
[0180]
在实施方案23中，提供了鉴定和/或选择具有增加的南方玉米锈病抗性的植物的方法，所述方法包括：用位于包含mza9535
‑
6和c06836
‑
1并由mza9535
‑
6和c06836
‑
1侧接的10号染色体上的区间内的标记筛选群体，以确定来自所述群体的一个或多个植物是否包含含有以下的基因等位基因：mza9535
‑
6(参考序列seqidno:18的位置186)处的“t”和c06836
‑
1(参考序列seqidno:19的位置201)处的“a”；和从所述群体选择包含所述基因等位基因的至少一个植物；任选地，其中所述方法进一步包括：将(b)中的植物与第二植物杂交；和获得具有所述基因等位基因的后代植物。
[0181]
实施例提供以下实施例以举例说明但不限制请求保护的主题。应当理解本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性的目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离本公开的精神或所附权利要求范围的情况下可改变多种试剂或参数。
[0182]
实施例1. qtl作图
由生物营养性病原体多堆柄锈菌(puccinia polysora)引起的南方玉米锈病(scr)是许多玉米种植地区的主要疾病。将scr抗性自交系与ph11vr(一种scr易感自交系)杂交以生成f1。对于最初的qtl发现，使用f1创建双单倍体群体。针对scr抗性，对149个f1双单倍体系进行表型分析。在开花后2
‑
4周，使用九分量表，通过目视检查对scr的严重程度进行评级，其中1为高度易感，且9为抗性最高。1
‑
3之间的评分被认为是易感的，其中“2”的评分代表80%叶子损失。4
‑
6之间的评分被认为是中等的，其中“5”的评分代表35%叶子损失。7
‑
9的评分被认为是抗性的，其中“8”的评分代表5%叶子损失。该群体内的表型评分范围为2至8，其中平均评分为5.2。所述双单倍型系中的127个用位于整个基因组的243个snp标记进行基因分型。使用复合区间作图分析，用winqtlcartographer进行qtl作图。在染色体10上发现了一个qtl，其峰在标记c01957
‑
1 (14.4的lod评分)处，其侧接标记c00429
‑
801和c002dc9
‑
001。解释的表型变异(pve%)为37.57%，如使用icimapping软件版本3.2所计算。
[0183]
实施例2. qtl精细作图和候选基因鉴定为了对抗性基因精细作图，将f1与易感亲本ph11vr回交，随后进行更多回交和自交以生成bc2f2和bc3f3作图群体。近似1000个bc2f2和750个bc3f3个体用侧接qtl区间的snp标记进行基因分型，以选择重组个体。将来自约1750个个体的重组体自花授粉。生成固定重组体并进行表型分析。开发qtl区间内的额外snp标记并用于对重组体进行基因分型。使用该方法，将区间缩小至chr10上2,345,245和2,756,875 (b73 v4位置)之间、标记scr_11 (seq id no:3和4；参见表1)之间的411,630 bp区域。源自scr抗性系和ph11vr的额外1500个f2和1100个bc1f1用于进一步缩小qtl区间，方法与之前描述的相同。最后，qtl被定界至chr10上2,643,669和2,757,139 (b73 v4位置)之间，侧接标记scr_2780626的113,504 bp区间(seq id no:5
‑
7；参见表1)。
[0184]
表1. 用于qtl作图的标记的引物和探针
标记名称正向引物(5'
‑
3')反向引物(5'
‑
3')探针类型抗性易感b73v4snp位置scr_11seqidno:3seqidno:4 indel标记
ꢀꢀꢀ
scr_2839516seqidno:5seqidno:6seqidno:7kasp标记ct2756854scr_2780626seqidno:8seqidno:9seqidno:10kasp标记gc2643669scr_2839801seqidno:11seqidno:12seqidno:13kasp标记gc2757138
[0185]
为了鉴定该区间内的候选抗性基因，从近交系ph7wc生成bac文库。ph7wc是scr抗性系的亲本，并且两个系在qtl区域中是相同的。使用在精细作图区域内设计的探针筛选bac文库，并且选择阳性bac用于pacbio测序。将测序的bac组装成两个重叠群。使用fgensh基因预测分析，在组装的重叠群内鉴定三个nlr (nlr01、nlr02和nlr03)。生成表达这些基因中的每一个(使用包括启动子区域的基因组片段)的转基因植物并测试其针对scr病原体的效力。预期nlr03 (seq id no:2)显示赋予抗性，而其他两个nlr则不会。
[0186]
实施例3. cml496中的qtl作图将cml496 (一种scr抗性的近交系)与易感系lx9801杂交。然后将来自该杂交的f1后代与lx9801回交以创建bc1f1群体。将cml496 (30个个体)、lx9801 (30个个体)、f1后代(30个个体)和bc1f1群体(100个个体)针对scr抗性进行表型分析。在授粉后30天使用从1(最抗性表型)至9(最易感表型)的量表评价疾病严重程度。cml496和lx9801的平均评分分别为1.0和8.5，且f1植物对scr高度抗性，其中平均评分为1.5。对于bc1f1群体，存在36个scr评分为1或2的高度抗性植物，和46个scr评分为8或9的高度易感植物。18个剩余植物显
示中等水平的抗性，评分范围为3至7。来自bc1f1群体的36个抗性植物和46个易感植物用于对来自cml496 (rppcml496)的抗性qtl作图。选择染色体10上的ssr标记(箱10.00、10.01和10.02)对bc1f1群体进行基因分型。鉴定抗性qtl rppcml496，其由ssr标记umc1380 (seq id no:14和15)和umc2053 (seq id no:16和17；参见表2)侧接。
[0187]
表2. nlr03 qtl和精细作图标记
标记名称正向引物(5'
‑
3')反向引物(5'
‑
3')探针标记类型b73v4位置b73v4snp位置抗性易感umc1380_forseqidno:14seqidno:15 ssr标记1810080
‑
1809953
ꢀꢀꢀ
umc2053_forseqidno:16seqidno:17 ssr标记4297766
‑
4297689
ꢀꢀꢀ
scr_2636645seqidno:20seqidno:21seqidno:22kasp标记2561572
‑
25615942561694gascr_2839039seqidno:23seqidno:24seqidno:25kasp标记2756352
‑
27563772756377atindel2752077seqidno:26seqidno:27 indel2751932
‑
2752131
ꢀꢀꢀ
[0188]
实施例4. cml496中的qtl精细作图和候选基因鉴定使用2,944个个体的f2群体对rppcml496进行精细作图。通过用侧接标记mza9535
‑
6 (seq id no:18)和c06836
‑
1 (seq id no:19；参见表3)进行基因分型来鉴定237个重组体。将这些重组体自交，并且后代用于确定scr抗性。开发qtl区间内的额外snp标记并用于对重组体进行基因分型。使用标记scr_2636645 (seq id no:20
‑
22；参见表2)将qtl区间缩小至染色体10上2,561,594bp和2,839,039bp (b73v4)之间的约195kb。为了鉴定scr抗性的因果基因，通过pacbio测序生成cml496的全基因组序列。qtl区间的大小，基于b73 v4的约195kb，在cml496中为近似650kb。用来自cml496序列的信息，开发了额外的标记indel2752077 (seq id no:26和27；参见表2)，其进一步将qtl区间定界至cml496基因组中的近似137kb。该区间中存在仅一个注释的nlr基因。该nlr与实施例1的scr抗性系中的nlr03 (scr qtl区间中的候选基因) 100%相同。生成表达该nlr基因(使用包括启动子区域的基因组片段)的转基因植物并测试其针对scr病原体的效力。
[0189]
表3. nlr03单倍型标记标记名称参考序列b73v4位置b73v4snp位置抗性易感mza9535
‑
6seqidno:182364320
‑
23647502364505tac06836
‑
1seqidno:193616302
‑
36167023616502ag
[0190]
表4. nlr03序列seqidno:seqidno:的描述1nlr03cds2nlr03氨基酸序列
[0191]
实施例5. nlr03作为因果基因的转基因验证合成nlr03基因的基因组序列(包括启动子区)并克隆至二元载体中用于ed85e中的转化。将六个单拷贝质量事件自交以生成1:2:1分离的t1种子。对于一个事件，植物与祖先回交以产生1:1分离种子。将所得的t1植物用多堆柄锈菌夏孢子接种并在温室中保存10天。基于孢子形成的高或低水平，通过视觉上进行温室疾病评分，分别为易感(评分=1)或抗性(评分=5)。测试包括28个具有单拷贝或双拷贝转基因的t1植物和17个没有转基因的t1植物；测试总共7个事件。在28个转基因阳性植物中，23个是抗性的，并且在17个无效植物中，15个是易感的；平均而言，无效植物(评分=1.5)比具有转基因的植物(评分=4.3)更易感。