结合PSMA和CD3的双特异性抗原结合分子与4-1BB共刺激组合的用途的制作方法

结合psma和cd3的双特异性抗原结合分子与4-1bb共刺激组合的用途
技术领域
1.本发明涉及结合前列腺特异性膜抗原(psma)和cd3的双特异性抗原结合分子与4-1bb共刺激的组合以及它们的使用方法。
2.对序列表的提及
3.序列表的正式副本以ascii格式的序列表与说明书同时通过efs-web以电子方式提交，文件名为10595wo01_seq_list_st25，创建日期为2020年6月19日，大小为约4,096字节。这个ascii格式化文件中所含的序列表是说明书的一部分并且以全文引用的方式并入本文中。


背景技术：

4.前列腺特异性膜抗原(psma)，也称为叶酸水解酶1(folh1)，是一种完整的非脱落膜糖蛋白，在前列腺上皮细胞中高度表达，并且是前列腺癌的细胞表面标志物。它的表达在去势抵抗性前列腺癌中保持不变，去势抵抗性前列腺癌是一种结局较差并且治疗选择有限的病症。已经研究了通过靶向psma来治疗前列腺癌的方法。例如，钇-90卡罗单抗(capromab)是一种包含针对psma的胞内表位的单克隆抗体的放射治疗剂；j591是一种针对psma的胞外表位的单克隆抗体，是放射治疗剂镥-177j591的一部分；并且mln2704是其中类美登素1(dm1，抗微管剂)缀合至j591的治疗剂。这些疗法与毒性有关。psma还在其他肿瘤(诸如，膀胱癌、肾癌、胃癌和结肠直肠癌)的新血管系统内表达。
5.cd3是与t细胞受体复合物(tcr)相关的在t细胞上表达的同源二聚体或异源二聚体抗原，是t细胞活化所必需的。功能性cd3由四种不同的链中的两种的二聚体缔合形成：ε、ζ、δ和γ。cd3二聚体排列方式包括γ/ε、δ/ε和ζ/ζ。已经显示出针对cd3的抗体使cd3聚集在t细胞上，从而以类似于负载有肽的mhc分子接合tcr的方式引起t细胞活化。因此，已经提出抗cd3抗体用于涉及t细胞活化的治疗目的。此外，已经提出能够结合cd3和靶抗原的双特异性抗体用于涉及使t细胞免疫应答靶向表达靶抗原的组织和细胞的治疗用途。
6.在t细胞活化中，经由tnf受体超家族的共刺激是生存、获得效应子功能和记忆分化的关键。4-1bb(tnfrsf9)，也称为cd137，是tnf受体超家族的成员。受体表达由tcr介导的初免后的淋巴细胞活化诱导，但是其水平可以通过cd28共刺激来增加。向cd8
t细胞上的配体或激动性单克隆抗体(mab)的暴露对4-1bb产生共刺激，这有助于t细胞的克隆扩增、存活和发育、外周单核细胞的诱导增殖、nf-κb的活化、tcr/cd3触发的活化诱导的t细胞凋亡增强、记忆生成以及cd28共刺激的调节(以促进th1细胞应答)。


技术实现要素：

7.本文提供了用于治疗受试者的癌症的方法。在一些方面，所述方法包括将包含抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子或抗psma抗体和药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物施用于所述受试者，以及将抗4-1bb激动剂另外施用于所述受试者。在一些方面，所
述方法包括将包含抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子或抗psma抗体、抗4-1bb激动剂和药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物施用于所述受试者。在一些实施方案中，所述癌症选自由以下各项组成的组：前列腺癌、肾癌、膀胱癌、结肠直肠癌和胃癌。在一些情况下，所述癌症是前列腺癌。在一些情况下，所述前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌。
8.本文还提供了治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法。在一些方面，所述方法包括将治疗有效量的下列中的每一者施用于有需要的受试者：(a)抗psma抗体或其抗原结合片段或者抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子；和(b)抗4-1bb激动剂。
9.本文还提供了靶向/杀死表达psma的肿瘤细胞的治疗方法。在一些方面，所述治疗方法包括将治疗有效量的抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子或抗psma抗体和治疗有效量的抗4-1bb激动剂施用于有需要的受试者。在一些方面，所述抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子或所述抗psma抗体和所述抗4-1bb激动剂单独配制。在一些方面，所述抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子或所述抗psma抗体和所述抗4-1bb激动剂配制在相同的药物组合物中。
10.本文还提供了抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子或抗psma抗体与抗4-1bb激动剂一起在制造用于治疗涉及表达psma的细胞或由表达psma的细胞引起的疾病或障碍的药物中的用途。
11.相对于在不存在抗4-1bb激动剂的情况下的治疗，将抗psma抗体或其抗原结合片段或抗psma/抗cd3双特异性抗体与抗4-1bb激动剂组合施用于有需要的受试者，可以减少肿瘤体积。
12.相对于在不存在抗4-1bb激动剂的情况下的治疗，将抗psma抗体或其抗原结合片段或抗psma/抗cd3双特异性抗体与抗4-1bb激动剂组合施用于有需要的受试者，可以增加无肿瘤存活期。
13.相对于在不存在抗4-1bb激动剂的情况下已施用抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子的受试者的肿瘤中的traf1表达，将抗psma抗体或其抗原结合片段或抗psma/抗cd3双特异性抗体与抗4-1bb激动剂组合施用于有需要的受试者，可以增加所述肿瘤中的traf1表达至少约4倍。
14.相对于在不存在抗4-1bb激动剂的情况下已施用抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子的受试者的肿瘤中的bcl2表达，将抗psma抗体或其抗原结合片段或抗psma/抗cd3双特异性抗体与抗4-1bb激动剂组合施用于有需要的受试者，可以增加所述肿瘤中的bcl2表达至少约2倍。
15.相对于在不存在抗4-1bb激动剂的情况下已施用抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子的受试者的肿瘤中的bfl-1表达，将抗psma抗体或其抗原结合片段或抗psma/抗cd3双特异性抗体与抗4-1bb激动剂组合施用于有需要的受试者，可以增加所述肿瘤中的bfl-1表达至少约3倍。
16.相对于在不存在抗4-1bb激动剂的情况下已施用抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子的受试者的肿瘤中的cd8 t细胞，将抗psma抗体或其抗原结合片段或所述抗psma/抗cd3双特异性抗体与抗4-1bb激动剂组合施用于有需要的受试者，可以增加所述肿瘤中的cd8 t细胞的扩增和/或增加cd8 t细胞的存活期。
17.抗4-1bb激动剂可以是4-1bb的小分子或生物激动剂，并且在一些方面是抗体。示
例性抗4-1bb激动剂包括可商购获得的抗体(例如抗小鼠4-1bb)和治疗性抗体(诸如乌瑞鲁单抗和乌托鲁单抗)。
18.根据本文提供的方法使用结合人psma和人cd3的抗psma抗体或其抗原结合片段和双特异性抗体及其抗原结合片段。所述双特异性抗体尤其可用于靶向表达cd3的t细胞，以及用于刺激t细胞活化，例如在其中t细胞介导的表达psma的细胞的杀死是有利的或所期望的情况下。例如，所述双特异性抗体可以将cd3介导的t细胞活化引导至特定的表达psma的细胞，诸如前列腺肿瘤细胞。
19.结合psma的抗psma抗体或其抗原结合片段可以与抗4-1bb激动剂组合用于治疗涉及表达psma的肿瘤(尤其是更大的和/或更难治疗的肿瘤)或由表达psma的肿瘤引起的疾病和障碍。us 10,179,819中详细描述了示例性抗psma抗体及其抗原结合片段。在一些方面，所述抗psma抗体包含seq id no:66的hcvr和us 10,179,819中提及的seq id no:1386的共同轻链。在一些方面，所述抗psma抗体是us 10,179,819中提及的h1h11810p抗体。
20.结合psma和cd3的双特异性抗原结合分子(例如，抗体)在本文中也称为“抗psma/抗cd3双特异性分子”、“抗cd3/抗psma双特异性分子”、“psmaxcd3bsab”，或简称为“psmaxcd3”。所述抗psma/抗cd3双特异性分子的抗psma部分可用于靶向表达psma的细胞(例如，肿瘤细胞)(例如，前列腺肿瘤)，并且所述双特异性分子的抗cd3部分可用于活化t细胞。psma结合在肿瘤细胞上和cd3结合在t细胞上促进了活化的t细胞对被靶向的肿瘤细胞的定向杀死(细胞裂解)。因此，本文所用的抗psma/抗cd3双特异性分子尤其可用于治疗涉及表达psma的肿瘤或由表达psma的肿瘤引起的疾病和障碍(例如，前列腺癌)。所述抗psma/抗cd3双特异性分子还可以与抗4-1bb激动剂组合用于治疗涉及表达psma的肿瘤(尤其是更大的和/或更难治疗的肿瘤)或由表达psma的肿瘤引起的疾病和障碍。
21.所述双特异性抗原结合分子包含特异性结合人cd3的第一抗原结合结构域和特异性结合psma的第二抗原结合结构域。
22.根据本文提供的方法使用的示例性双特异性抗体是抗cd3/抗psma双特异性分子，其中所述特异性结合cd3的第一抗原结合结构域包含hcvr氨基酸序列中的任一者、lcvr氨基酸序列中的任一者、hcvr/lcvr氨基酸序列对中的任一者、重链cdr1-cdr2-cdr3氨基酸序列中的任一者或轻链cdr1-cdr2-cdr3氨基酸序列中的任一者，如美国公开2014/0088295中所示。
23.根据本文提供的方法使用抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子，其中所述特异性结合cd3的第一抗原结合结构域包含hcvr氨基酸序列中的任一者和/或lcvr氨基酸序列中的任一者或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的它们的基本上相似的序列，如美国专利号10,179,819的表12、14、15、18和20中所示。在一些方面，所述特异性结合cd3的第一抗原结合结构域包含seq id no:2的重链可变区(hcvr-1)氨基酸序列。
24.根据本文提供的方法使用抗cd3/抗psma双特异性分子，其中所述特异性结合psma的第二抗原结合结构域包含hcvr氨基酸序列中的任一者和/或lcvr氨基酸序列中的任一者或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的它们的基本上相似的序列，如美国专利号10,179,819的表1中所示。在一些方面，所述特异性结合psma的第二抗原结合结构域包含seq id no:1的重链可变区(hcvr-2)氨基酸序列。
25.根据本文提供的方法使用抗cd3/抗psma双特异性分子，其中所述特异性结合cd3
的第一抗原结合结构域包含seq id no:2的hcvr-1氨基酸序列，并且其中所述特异性结合psma的第二抗原结合结构域包含seq id no:1的hcvr-2氨基酸序列。在一些方面，所述抗cd3/抗psma双特异性分子包含seq id no:3的共同轻链可变区(lcvr)氨基酸序列。
26.在一个方面，本文提供了包含抗psma抗原结合分子或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子和药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物。在一些方面，所述药物组合物还包含抗4-1bb激动剂。
27.根据本公开的方法使用抗psma抗体及其抗原结合片段以及具有经修饰的糖基化模式的抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子。在一些应用中，去除不希望的糖基化位点的修饰可能是有用的，或缺乏岩藻糖部分的抗体存在于寡糖链上，例如，以增加抗体依赖性细胞毒性(adcc)功能(参见shield等人(2002)jbc 277:26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖基化的修饰，以便修改补体依赖性细胞毒性(cdc)。
28.在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文公开的抗psma抗体或其抗原结合片段或抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子、抗4-1bb激动剂和药学上可接受的载剂。在相关方面，本公开的特征在于一种组合物，所述组合物是抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子、抗4-1bb激动剂和第三治疗剂的组合。在一个实施方案中，所述第三治疗剂是有利地与抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子组合的任何药剂。可以有利地与抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子组合的示例性药剂在本文别处有所详细讨论。
29.在另一个方面，本文提供了用于免疫pet成像的放射性标记的抗psma抗体缀合物和抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子缀合物。所述缀合物包含抗psma抗体或抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子、螯合部分和正电子发射体。
30.本文提供了用于合成所述缀合物的方法和适用于其的合成中间体。
31.本文提供了对表达psma的组织进行成像的方法，所述方法包括将本文所述的放射性标记的抗psma抗体缀合物或抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子缀合物施用于所述组织；以及通过正电子发射断层扫描(pet)成像来使psma表达可视化。
32.本文提供了对包含表达psma的细胞的组织进行成像的方法，所述方法包括将本文所述的放射性标记的抗psma抗体缀合物或抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子缀合物施用于所述组织，以及通过pet成像来使psma表达可视化。
33.本文提供了用于检测组织中的psma的方法，所述方法包括将本文所述的放射性标记的抗psma抗体缀合物或抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子缀合物施用于所述组织，以及通过pet成像来使psma表达可视化。在一个实施方案中，所述组织存在于人类受试者中。在某些实施方案中，所述受试者是非人类哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者患有疾病或障碍，诸如癌症、炎性疾病或感染。
34.本文提供了用于检测组织中的psma的方法，所述方法包括使所述组织与缀合至本文所述的荧光分子的抗psma抗体或抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子接触；以及通过荧光成像来使psma表达可视化。
35.本文提供了用于鉴定适合于抗肿瘤疗法的受试者的方法，所述方法包括选择患有实体瘤的受试者，施用本文所述的放射性标记的抗psma抗体缀合物或抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子缀合物，以及通过pet成像来使所述肿瘤中所施用的放射性标记的抗体缀合物可视化，其中所述放射性标记的抗体缀合物存在于所述肿瘤中将所述受试者鉴定为适
合于抗肿瘤疗法。
36.本文提供了治疗肿瘤的方法，所述方法包括选择患有实体瘤的受试者；确定所述实体瘤是psma阳性的；以及将抗肿瘤疗法施用于所述有需要的受试者。在某些实施方案中，所述抗肿瘤疗法包含pd-1/pd-l1信号传导轴的抑制剂(例如，抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体)，所述抑制剂是检查点抑制剂疗法的实例。在某些实施方案中，给所述受试者施用本文所述的放射性标记的抗psma抗体缀合物或抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子缀合物，以及经由正电子发射断层扫描(pet)成像对所述放射性标记的抗体缀合物的定位进行成像，以确定肿瘤是否为psma阳性的。在某些实施方案中，给所述受试者另外施用放射性标记的抗pd-1抗体缀合物，以及经由正电子发射断层扫描(pet)成像对所述放射性标记的抗体缀合物的定位进行成像，以确定肿瘤是否为pd-1阳性的。
37.本文提供了用于监测抗肿瘤疗法在受试者中的功效的方法，其中所述方法包括选择患有实体瘤的受试者，其中所述受试者经抗肿瘤疗法治疗；将本文所述的放射性标记的抗psma抗体缀合物或抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子缀合物施用于所述受试者；通过pet成像对肿瘤中所施用的放射性标记的缀合物的定位进行成像；以及确定肿瘤生长，其中所述缀合物或放射性标记的信号的摄取从基线的降低表示所述抗肿瘤疗法的功效。
38.在某些实施方案中，所述抗肿瘤疗法包括pd-1抑制剂(例如，regn2810、bgb-a317、纳武单抗(nivolumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)和帕博利珠单抗(pembrolizumab))、pd-l1抑制剂(例如，阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、mdx-1105和regn3504，以及专利公开号us 2015-0203580中公开的那些)、ctla-4抑制剂(例如，伊匹单抗(ipilimumab))、tim3抑制剂、btla抑制剂、tigit抑制剂、cd47抑制剂、gitr抑制剂、另一种t细胞共抑制剂或配体的拮抗剂(例如，lag3、cd-28、2b4、ly108、lair1、icos、cd160或vista的抗体)、吲哚胺-2,3-双加氧酶(ido)抑制剂、血管内皮生长因子(vegf)拮抗剂[例如，“vegf-陷阱”，诸如阿柏西普或如us 7,087,411中所示的其他vegf抑制性融合蛋白，或抗vegf抗体或其抗原结合片段(例如，贝伐单抗(bevacizumab)或兰尼单抗(ranibizumab))或vegf受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、或帕唑帕尼(pazopanib))]、ang2抑制剂(例如，奈斯伐单抗(nesvacumab))、转化生长因子β(tgfβ)抑制剂、表皮生长因子受体(egfr)抑制剂(例如，厄洛替尼、西妥昔单抗(cetuximab))、cd20抑制剂(例如，抗cd20抗体，诸如利妥昔单抗(rituximab))、肿瘤特异性抗原[例如，ca9、ca125、黑素瘤相关抗原3(mage3)、癌胚抗原(cea)、波形蛋白、肿瘤-m2-pk、前列腺特异性抗原(psa)、粘蛋白-1、mart-1和ca19-9]的抗体、疫苗(例如，卡介苗、癌症疫苗)、增加抗原呈递的佐剂(例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、双特异性抗体(例如，cd3xcd20双特异性抗体或psmaxcd3双特异性抗体)、细胞毒素、化学治疗剂(例如，达卡巴嗪、替莫唑胺、环磷酰胺、多西他赛、多柔比星、柔红霉素、顺铂、卡铂、吉西他滨、氨甲蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、和长春新碱)、环磷酰胺、放射疗法、il-6r抑制剂(例如，沙利鲁单抗(sarilumab))、il-4r抑制剂(例如，度普利尤单抗(dupilumab))、il-10抑制剂、细胞因子(诸如il-2、il-7、il-21和il-15)以及抗体-药物缀合物(adc)(例如，抗cd19-dm4adc和抗ds6-dm4adc)。
[0039]
本文提供了增加肿瘤组织中的cd8 t细胞的扩增的方法。在一些方面，所述方法包括将治疗有效量的下列中的每一者施用于有需要的受试者：(a)抗cd3/抗psma双特异性
抗原结合分子；和(b)抗4-1bb激动剂。
[0040]
本文提供了引发和/或增强对肿瘤的t细胞应答的方法。在一些方面，所述方法包括将治疗有效量的下列中的每一者施用于有需要的受试者：(a)抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子；和(b)抗4-1bb激动剂。
[0041]
在一些方面，相对于在不存在抗4-1bb激动剂的情况下已施用抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子的受试者中的肿瘤组织中的cd8 t细胞与treg的比率，肿瘤组织中的cd8 t细胞与treg的比率有所增加。在一些方面，在存在抗4-1bb激动剂的情况下，随后暴露于肿瘤细胞在用抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子治疗的受试者中引发记忆应答。
[0042]
通过参阅接下来的详细说明，其他实施方案将变得显而易见。
附图说明
[0043]
图1a-1g显示了psmaxcd3双特异性抗体可以结合至低抗原表达和高抗原表达的细胞系，并且展示了psmaxcd3双特异性抗体能够诱导靶标依赖性、cd3介导的t细胞活化，从而杀死表达psma的肿瘤细胞。所示的数据来自两个孔的组合并且代表三个独立的实验。
[0044]
图2a-2b展示了作为用psmaxcd3双特异性抗体处理的结果的异种肿瘤模型中的人前列腺癌细胞的生长抑制。在图2a中，nsg小鼠皮下共移植有22rv1细胞和人pbmc。在第0、3和7天给予小鼠0.1、1mg/kgpsmaxcd3或1mg/kg cd3结合对照。在图2b中，nsg小鼠皮下共移植有c4-2细胞和人pbmc。在第0、3和7天给予小鼠0.01、0.1mg/kgpsmaxcd3或0.1mg/kg cd3结合对照。平均肿瘤体积以sem(n＝5，3个重复)显示。****p《0.0001。通过双因素anova来测量相对于cd3结合对照的统计学显著性。
[0045]
图3a-3d显示了在hut小鼠的表达psma的组织中的psma表达和psmaxcd3双特异性抗体积聚以及药物清除。图3a通过rt-pcr显示了hut小鼠的组织中的相对psma表达。图3b和3c显示了在第6天测量的离体组织生物分布，所述生物分布以每克组织的注射剂量百分比(％id/g)和组织与血液的比率表示。数据以平均值
±
sd显示。图3d显示了在用1mg/kgpsmaxcd3治疗的小鼠中测量的随时间推移的psmaxcd3药物清除。
[0046]
图4a-4c展示了psmaxcd3双特异性抗体治疗在移植有小鼠前列腺腺癌细胞系(在小于200mm3的肿瘤中表达人psma)的hut小鼠中能够有效预防肿瘤生长或生长延迟。在较大的肿瘤中，观察到短暂而瞬时的抗肿瘤反应。在图4a中，在第0、4、7和11天用5mg/kg cd3结合对照(圆形)或psmaxcd3(正方形)治疗小鼠。5/5只小鼠无肿瘤。平均肿瘤体积以sem(n＝7，3个重复)显示。****p《0.0001。在图4b中，在第8、12、15和19天用5mg/kg cd3结合对照(圆形)或psmaxcd3(正方形)治疗50mm3肿瘤。2/5只小鼠无肿瘤。平均肿瘤体积以sem(n＝5，3个重复)显示。****p《0.0001。在图4c中，在第9、12、16和19天用5mg/kg cd3结合对照(圆形)或psmaxcd3(正方形)治疗200mm3肿瘤。0/5只小鼠无肿瘤。平均肿瘤体积以sem(n＝5，3个重复)显示。**p＝0.0014。
[0047]
图5a-5d展示了相对侧具有两个不同大小的肿瘤的hut小鼠的psmaxcd3双特异性抗体治疗的结果。数据显示，双特异性抗体靶向肿瘤，无论肿瘤大小如何，但是其功效仅限于较小的肿瘤。图5a显示了小肿瘤的平均体积，该平均体积以sem(n＝5，三个重复)显示。***p《0.001。图5b显示了大肿瘤的平均体积，该平均体积以sem(n＝5，3个重复)显示。*p＝0.01。通过双因素anova来测量相对于cd3结合对照的所有统计学显著性。图5c和5d显示
了在将1mg/kg 89zr-psmaxcd3或
89
zr-cd3结合对照施用于携带小肿瘤和大肿瘤的小鼠之后，在第6天测量的
离体
组织生物分布，所述生物分布以每克组织的注射剂量百分比(％id/g)和组织与血液的比率表示。数据以平均值
±
sd显示。
[0048]
图6a-6d展示了psmaxcd3双特异性抗体与抗4-1bb共刺激在大tramp-c2hpmsa肿瘤(200mm3)中的抗肿瘤功效。图6a显示了在5mg/kg cd3结合对照或psmaxcd3(n＝5)的施用后48小时，肿瘤和脾脏cd4和cd8 t细胞中的4-1bb表达的代表性流式细胞图和mfi。图6b显示了在第9天用5mg/kg cd3结合对照(空心圆形)、2.5mg/kg抗4-1bb(实心圆形)、1mg/kg psmaxcd3(空心三角形)、5mg/kg psmaxcd3(实心三角形)、1mg/kg psma 2.5mg/kg抗4-1bb(空心正方形)或5mg/kgpsmaxcd3 2.5mg/kg抗4-1bb(实心正方形)处理已建立的200mm3tramp-c2-hpmsa肿瘤一次。平均肿瘤体积以sem(n＝10，3个重复)显示。****p《0.0001。通过双因素anova来测量相对于cd3结合对照的统计学显著性。图6c提供了无肿瘤存活曲线，该曲线表示对携带》2000mm3肿瘤的小鼠实施安乐死。通过gehan-breslow-wilcoxon检验来测量相对于cd3结合对照的显著性。****p《0.0001。无肿瘤(tf)小鼠的数量如下：cd3结合对照0/10只；5mg/kg psmaxcd3 0/10只；1mg/kg psmaxcd3 1/10只；抗4-1bb对照2/10只；1mg/kg psma 2.5mg/kg抗4-1bb 6/10只；5mg/kgpsmaxcd3 2.5mg/kg抗4-1bb 5/10只。图6d提供了在治疗施用后72小时肿瘤中的4-1bb通路基因的相对表达。(n＝6)****p《0.0001，***p《0.009，*p《0.05。通过单因素anova来测量统计学显著性。
[0049]
图7a-7b显示了在psmaxcd3和抗4-1bb的组合疗法后肿瘤中的cd8 t细胞增加以及免疫记忆。图7b显示了已清除50mm3肿瘤的小鼠受到tramp-c2-hpsma肿瘤细胞的再次挑战，并且免受继发性肿瘤的影响，这表明肿瘤特异性免疫记忆可以用cd3双特异性抗体来诱导。
具体实施方式
[0050]
在描述本发明前，应当理解，本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不旨在进行限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限定。
[0051]
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指所述值可以从列举的值变动不大于1％。举例来说，如本文所用，表述“约100”包括99和101以及它们之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0052]
尽管与本文中描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用于本公开的实践或检验，但现在描述优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物全文以引用的方式并入本文中。
[0053]
如实施例所示，观察到psmaxcd3对小肿瘤的抗肿瘤功效，虽然对较大肿瘤的抗肿瘤功效大大降低，更真实地反映了临床治疗实体瘤的挑战。
[0054]
如下文所示，psmaxcd3双特异性抗体导致cd8 t细胞浸润、活化和增殖，这在较小的肿瘤中有效，但在较大的肿瘤中无效。本发明人试图通过使用抗4-1bb激动剂提供共刺激信号来增强和延长psmaxcd3诱导的t细胞活性。4-1bb信号传导通路可以通过促进t细胞存活来增强t细胞应答的幅度和持续时间，逆转t细胞无反应性，并随后产生记忆t细胞以促进有效的抗肿瘤活性。
[0055]
如本文所示，将psmaxcd3双特异性抗体与抗4-1bb共刺激组合导致cd8 t细胞浸润、活化和增殖增强，从而在较大的肿瘤中以单剂量产生显著的抗肿瘤功效。这种组合还可以诱导肿瘤特异性t细胞记忆。
[0056]
本文展示了抗psma抗体和psmaxcd3双特异性抗体活化肿瘤内t细胞的能力以及4-1bb共刺激增强t细胞应答的幅度和持续时间从而产生显著的抗肿瘤功效的能力。将抗psma抗体和psmaxcd3双特异性抗体与4-1bb共刺激组合，可用于治疗已建立的实体瘤的方法，以实现更好的总体存活期。
[0057]
抗原结合分子的治疗用途
[0058]
本公开包括这样的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用抗psma抗体或其抗原结合片段、或特异性结合cd3和psma的双特异性抗原结合分子以及抗4-1bb激动剂。根据本文的方法使用的治疗组合物可以包含抗psma抗体或psmaxcd3双特异性抗原结合分子和药学上可接受的载剂或稀释剂。如本文所用，表述“有需要的受试者”是指表现出一种或多种癌症症状或标志的人类或非人类动物(例如，表达肿瘤或患有本文下文提及的任何癌症的受试者)，或否则将受益于psma活性的抑制或降低或psma 细胞(例如，前列腺癌细胞)的消耗。
[0059]
本文公开的抗体和双特异性抗原结合分子(以及包含它们的治疗组合物)尤其可以与抗4-1bb激动剂组合用于治疗其中刺激、活化和/或靶向免疫应答将是有益的任何疾病或障碍。具体而言，抗psma抗体和抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子与抗4-1bb激动剂组合可用于治疗、预防和/或改善涉及或由psma表达或活性或psma 细胞的增殖介导的任何疾病或障碍。实现本文公开的治疗方法的作用机制包括在效应细胞存在下杀死表达psma的细胞，例如通过cdc、细胞凋亡、adcc、吞噬作用，或通过这些机制中的两种或更多种的组合。可以使用抗体或双特异性抗原结合分子抑制或杀死的表达psma的细胞包括例如前列腺肿瘤细胞。通过4-1bb共刺激实现另外的治疗效果，包括促进t细胞的克隆扩增、存活和发育，诱导外周单核细胞增殖，活化nf-κb，增强由tcr/cd3触发的活化诱导的t细胞凋亡和记忆生成。
[0060]
抗原结合分子(包括抗psma抗体和抗psma/抗cd3双特异性抗体)与抗4-1bb激动剂组合可用于治疗例如胃肠道、前列腺、肾和/或膀胱中的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施方案中，抗体或双特异性抗原结合分子用于治疗一种或多种以下癌症：透明细胞肾细胞癌、嫌色肾细胞癌、(肾)嗜酸细胞瘤、(肾)移行细胞癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、尿路上皮癌、(膀胱)腺癌或(膀胱)小细胞癌。根据本公开的某些实施方案，抗psma抗体和抗psma/抗cd3双特异性抗体与抗4-1bb激动剂组合可用于治疗患有去势抵抗性前列腺癌的患者。根据本文公开的其他相关实施方案，提供的方法包括向患有去势抵抗性前列腺癌的患者施用与抗4-1bb激动剂组合的抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子。
[0061]
本公开还包括用于治疗受试者中已建立的肿瘤的方法，其中已建立被定义为可测量的肿瘤，即，可以以适合给定癌症的方式进行测量。
[0062]
本公开还包括用于治疗受试者中的残留癌症的方法。如本文所用，术语“残留癌症”是指在用抗癌疗法治疗后受试者中的一种或多种癌细胞的存在或持续存在。
[0063]
根据某些方面，本公开提供了治疗与psma表达相关的疾病或障碍(例如，前列腺癌)的方法，所述方法包括在已确定受试者患有前列腺癌(例如，去势抵抗性前列腺癌)之
后，将一种或多种在别处描述的双特异性抗原结合分子与抗4-1bb激动剂组合施用于受试者。例如，本公开包括用于治疗前列腺癌的方法，所述方法包括在受试者接受激素疗法(例如，抗雄激素疗法)后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更长时间，向患者施用抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子。
[0064]
定义
[0065]
如本文所用，表述“cd3”是指作为多分子t细胞受体(tcr)的一部分在t细胞上表达并且由四个受体链中的两个结合形成的同源二聚体或异源二聚体组成的抗原：cd3-ε、cd3-δ、cd3-ζ和cd3-γ。除非明确指出是来自非人物种，否则本文对蛋白质、多肽和蛋白质片段的所有提及均旨在指相应的蛋白质、多肽或蛋白质片段的人型式。因此，除非指出是来自非人类物种，例如，“小鼠cd3”、“猴cd3”等，否则表述“cd3”意指人类cd3。
[0066]
如本文所用，“结合cd3的抗体”或“抗cd3抗体”包括特异性识别单个cd3亚基(例如，ε、δ、γ或ζ)的抗体及其抗原结合片段，以及特异性识别两个cd3亚基的二聚体复合物(例如，γ/ε、δ/ε和ζ/ζcd3二聚体)的抗体及其抗原结合片段。本文所用的抗体和抗原结合片段可结合可溶性cd3和/或细胞表面表达的cd3。可溶性cd3包括天然cd3蛋白以及重组cd3蛋白变体，例如单体和二聚体cd3构建体，它们缺乏跨膜结构域或者与细胞膜无关。
[0067]
如本文所用，表述“细胞表面表达的cd3”意指在体外或体内细胞表面上表达，以使得cd3蛋白的至少一部分暴露于细胞膜的胞外侧，并且可接近抗体的抗原结合部分的一种或多种cd3蛋白。“细胞表面表达的cd3”包括含有在细胞膜中功能性t细胞受体范围内的cd3蛋白。表述“细胞表面表达的cd3”包括作为细胞表面上的同源二聚体或异源二聚体的一部分表达的cd3蛋白(例如，γ/ε、δ/ε和ζ/ζcd3二聚体)。表述“细胞表面表达的cd3”还包括在细胞表面上自身表达的cd3链(例如，cd3-ε、cd3-δ或cd3-γ)，不存在其他cd3链类型。“细胞表面表达的cd3”可以包括在通常表达cd3蛋白的细胞表面上表达的cd3蛋白或由这种cd3蛋白组成。或者，“细胞表面表达的cd3”可以包括在通常在表面上不表达人cd3、但是已经被人工工程化为在表面上表达cd3的细胞表面上表达的cd3蛋白或由这种cd3蛋白组成。
[0068]
如本文所用，表述“psma”是指前列腺特异性膜抗原，也称为叶酸水解酶1(folh1)。psma是一种完整的非脱落膜糖蛋白，在前列腺上皮细胞中高度表达，并且是前列腺癌的细胞表面标志物。psma是晚期恶性肿瘤的一个有吸引力的细胞表面靶标。它还在透明细胞肾癌、膀胱癌、结肠癌和乳腺癌的新血管系统中表达。
[0069]
如本文所用的表述“4-1bb”，也称为cd137，是指活化诱导的共刺激分子。4-1bb是免疫应答的重要调节因子，是tnf受体超家族的成员。表述“抗4-1bb激动剂”是结合4-1bb并活化受体的任何配体。示例性抗4-1bb激动剂包括乌瑞鲁单抗(bms-663513)和乌托鲁单抗(pf-05082566)，以及商购获得的抗小鼠4-1bb抗体。此外，术语“4-1bb激动剂”是指部分或完全促进、诱导、增加和/或活化4-1bb生物学活性的任何分子。合适的激动剂分子具体包括激动剂抗体或抗体片段，包括双特异性抗体，例如包含结合免疫细胞上的4-1bb的一个臂以及结合例如肿瘤靶标上的抗原的另一个臂的双特异性抗体。该术语还包括天然多肽、肽、反义寡核苷酸、有机小分子等的片段或氨基酸序列变体。在一些实施方案中，以剂量依赖性方式观察到激动剂存在下的活化。在一些实施方案中，测量的信号(例如，生物学活性)比在类似条件下用阴性对照测得的信号高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少
约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。激动剂的功效也可以使用功能测定法来确定，诸如激动剂活化或促进多肽功能的能力。例如，功能测定法可以包括将多肽与候选激动剂分子接触并测量通常与多肽相关的一种或多种生物学活性的可检测变化。激动剂的效力通常由其ec
50
值(活化50％的激动剂反应所需的浓度)定义。ec
50
值越低，激动剂的效力越大，活化最大生物学反应所需的浓度越低。4-1bb激动剂还可以包括含有4-1bb配体的分子或4-1bb配体的片段，例如包含含有4-1bbl或其片段的一个臂和结合至例如肿瘤上的抗原的另一个臂的双特异性分子。这些片段可以包括fc区。
[0070]
术语“抗原结合分子”包括抗体和抗体的抗原结合片段，包括例如双特异性抗体。
[0071]
如本文所用，术语“抗体”意指包含与特定抗原(例如，psma或cd3)特异性结合或相互作用的至少一个互补决定区(cdr)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含四条多肽链(即通过二硫键相互连接的两条重(h)链和两条轻(l)链)的免疫球蛋白分子，以及它们的多聚体(例如，igm)。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为hcvr或vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为lcvr或v
l
)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(c
l
1)。vh区和v
l
区可以进一步再划分为高变区，称为互补性决定区(cdr)，其间插有更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和v
l
由从氨基末端到羧基末端按照以下次序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本文公开的不同实施方案中，抗psma抗体或抗cd3抗体(或其抗原结合部分)的fr可以与人种系序列相同，或者可以是经天然或人工修饰的。可以基于两个或更多个cdr的并行分析来定义氨基酸共有序列。
[0072]
如本文所用，术语“抗体”还包括全抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成性或基因工程化的多肽或糖蛋白。可以例如使用任何合适的标准技术(诸如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变结构域和任选地抗体恒定结构域的dna的操作和表达的重组基因工程技术)从全抗体分子衍生出抗体的抗原结合片段。这种dna是已知的和/或可从例如商业来源、dna文库(包括例如噬菌体-抗体文库)容易地获得，或者可以是合成的。可以对所述dna进行测序并且通过化学方式或通过使用分子生物学技术来操纵所述dna，例如以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域布置成合适的构型，或者引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
[0073]
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段；和(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补决定区(cdr)，诸如cdr3肽)，或约束性fr3-cdr3-fr4肽。如本文所用，其他经工程化的分子(诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、cdr移植抗体、双体、三体、四体、微体、纳米体(例如，单价纳米体、二价纳米体等)、小模块免疫药物(smip)和鲨鱼可变ignar结构域)也被涵盖在表述“抗原结合片段”内。
[0074]
抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何尺寸或氨基酸组成并且通常将包含与一个或多个框架序列毗邻或符合读框的至少一个cdr。在具有vh结构域与v
l
结构域缔合的抗原结合片段中，vh和v
l
结构域可相对于彼此以任
何合适的布置定位。例如，可变区可以是二聚体并且含有v
h-vh、v
h-v
l
或v
l-v
l
二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可含有单体vh或v
l
结构域。
[0075]
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以存在于本文所用的抗体的抗原结合片段内的可变结构域和恒定结构域的非限制性、示例性构型包括：(i)v
h-ch1；(ii)v
h-ch2；(iii)v
h-ch3；(iv)v
h-ch1-ch2；(v)v
h-ch1-ch2-ch3；(vi)v
h-ch2-ch3；(vii)v
h-c
l
；(viii)v
l-ch1；(ix)v
l-ch2；(x)v
l-ch3；(xi)v
l-ch1-ch2；(xii)v
l-ch1-ch2-ch3；(xiii)v
l-ch2-ch3；和(xiv)v
l-c
l
。在可变结构域和恒定结构域的任何构型，包括上文所列的任何例示性构型中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以由完整或部分的铰链区或接头区连接。铰链区可以由在单个多肽分子中邻近的可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性连接的至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成。此外，本文所用的抗体的抗原结合片段可以包含具有上文所列的可变结构域和恒定结构域构型中的任一个的彼此和/或与一个或多个单体vh或v
l
结构域(例如，通过二硫键)呈非共价缔合的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。
[0076]
正如全抗体分子那样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域都能够特异性结合至单独的抗原或相同抗原上的不同表位。使用本领域可用的常规技术，可以使任何多特异性抗体形式，包括本文公开的示例性双特异性抗体形式，适用于本文所用的抗体的抗原结合片段的语境中。
[0077]
本文所用的抗体可以通过补体依赖性细胞毒性(cdc)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)起作用。“互补依赖性细胞毒性”(cdc)是指在补体的存在下通过本文公开的抗体裂解表达抗原的细胞。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(adcc)是指其中表达fc受体(fcr)的非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并由此导致靶细胞的裂解的细胞介导的反应。可以使用本领域熟知且可获得的测定来测量cdc和adcc。(参见例如，美国专利号5,500,362和5,821,337，以及clynes等人(1998)proc.natl.acad.sci.(usa)95:652-656)。抗体的恒定区对于抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力很重要。因此，可以根据抗体介导细胞毒性是否需要抗体来选择抗体的同种型。
[0078]
在某些实施方案中，本文所用的抗psma/抗cd3双特异性抗体是人抗体。如本文所用，术语“人抗体”意图包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可以包括例如在cdr中以及特别是在cdr3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括已经将衍生自另一个哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的cdr序列植入到人框架序列上的抗体。
[0079]
在一些实施方案中，根据本文公开的方法使用的抗体可以是重组人抗体。如本文所用，术语“重组人抗体”意在包括通过重组手段所制备、表达、产生或分离的全部人抗体，如使用转染至宿主细胞(在下文进一步描述)中的重组表达载体表达的抗体、从重组人抗体组合文库(在下文进一步描述)分离的抗体、从相对于人免疫球蛋白基因而言转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如，taylor等人，(1992)nucl.acids res.20:6287-6295)
或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他dna序列的任何其他手段所制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体经历体外诱变(或，使用就人ig序列而言为转基因的动物时，经历体内体细胞诱变)并且因此重组抗体的vh和v
l
区的氨基酸序列是尽管源自人种系vh和v
l
序列并且与之相关，但可能在体内人抗体种系库内部不天然存在的序列。
[0080]
人抗体能够以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含大约150-160kda的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不经由链间二硫键连接，并且约75-80kda的分子由共价偶联的轻链和重链(半抗体)构成。即使在亲和纯化之后，这些形式也极难分离。
[0081]
第二种形式在各种完整igg同种型中的出现频率是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人igg4铰链的铰链区中的单个氨基酸置换可以显著减少第二种形式的出现(angal等人(1993)molecular immunology 30:105)至通常使用人igg1铰链观察到的水平。本公开涵盖在铰链、ch2或ch3区中具有一个或多个突变的抗体，这例如在产生中可以是所需的，以提高所需的抗体形式的产率。
[0082]
本文所用的抗体可以是分离的抗体。如本文所用，“分离的抗体”意指已经从天然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，出于本公开的目的，已经从生物体的至少一种组分中、或者从抗体天然存在或天然产生的组织或细胞中分离或移除的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
[0083]
与衍生出抗体的对应种系序列相比，根据本文公开的方法使用的抗psma抗体和抗psma/抗cd3双特异性抗体可以在重链和轻链可变结构域的框架区和/或cdr区中包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定此类突变。本公开包括来源于本文所公开的氨基酸序列中的任一个的抗体和其抗原结合片段，其中一个或多个框架和/或cdr区内的一个或多个氨基酸突变成得到所述抗体的种系序列的对应残基，或另一人类种系序列的对应残基，或对应种系残基的保守氨基酸置换(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本领域的普通技术人员从本文所公开的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地产生多种抗体和抗原结合片段，其包含一个或多个个别种系突变或其组合。在某些实施方案中，vh和
/或vl
结构域内的所有框架和/或cdr残基突变回衍生出抗体的原始种系序列中的残基。在其他实施方案中，仅某些残基被突变回原始种系序列，例如，仅存在于fr1的前8个氨基酸内或fr4的后8个氨基酸内的突变残基，或仅存在于cdr1、cdr2或cdr3内的突变残基。在其他实施方案中，框架和/或一个或多个cdr残基中的一个或多个被突变为不同的种系序列(即，与最初衍生出所述抗体的种系序列不同的种系序列)的一个或多个对应残基。此外，本文所用的抗体可以含有框架和/或cdr区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个别残基突变为特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基得以保持或突变为不同种系序列的对应残基。在获得含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段后，可以容易地测试所述抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特性，如结合特异性的改善、结合亲和力的增加、拮抗性或激动性生物特性(视具体情况而定)的改善或
增强、免疫原性降低等。以这种通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本公开内。
[0084]
根据本文提供的方法使用抗psma/抗cd3抗体，所述抗psma/抗cd3抗体包含具有一个或多个保守置换的本文公开的hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列中的任一者的变体。例如，本公开包括具有hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的抗psma/抗cd3抗体，相对于本文的表1所示的hcvr或lcvr氨基酸序列组中的任一者，所述hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等等的保守氨基酸置换。
[0085]
术语“表位”是指与抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点(称为互补位)发生相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有超过一个表位。因此，不同抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的氨基酸在空间上并列而产生。线性表位由多肽链中的邻近氨基酸残基来产生。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基基团或磺酰基基团部分。
[0086]
当提及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本相同”指示当通过适当的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)最佳对齐时，如通过下文所论述的任何众所周知的序列同一性算法如fasta、blast或gap所测量，至少约95％，并且更优选地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基存在核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参考核酸分子具有大体一致性的核酸分子可以编码与参考核酸分子所编码的多肽具有相同或大体上类似的氨基酸序列的多肽。
[0087]
当应用于多肽时，术语“基本上相似性”或“基本上相似”意指当两个肽序列诸如通过程序gap或bestfit使用默认空位权重进行最佳比对时，共有至少95％序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置的差异在于保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是氨基酸残基被含有具有类似的化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(r基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸置换。通常，保守氨基酸置换大体上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列的保守置换彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度以校正置换的保守性质。用于进行该调整的手段是本领域的技术人员熟知的。参见例如，pearson(1994)methods mol.biol.24:307-331，该文献以引用的方式并入本文。含有具有相似的化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括：(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链，即半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在以下文献中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的任何变化：gonnet等人(1992)science 256:1443-1445中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的任何改变，该文献以引用的方式并入本文。“适度保守”替换是在pam250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
[0088]
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列相似性，所述序列相似性也称为序列同一性。蛋白质分析软件使用关于指定到各种置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)的相似性度量来匹配相似序列。例如，gcg软件含有诸如gap和bestfit的程序，这些程序可以以默认参数使用，以确定紧密相关的多肽(诸如来自不同物种的生物体的同源多肽)之
间，或野生型蛋白及其突变型蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，gcg 6.1版。还可以使用fasta(gcg 6.1版中的程序)使用默认或推荐参数对多肽序列进行比较。fasta(例如，fasta2和fasta3)提供查询与搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比(pearson(2000)同上)。当将本文公开的序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一优选的算法是使用默认参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。参见例如altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschul等人(1997)nucleic acids res.25:3389-402，每个文献均以引用的方式并入本文。
[0089]
序列变体
[0090]
与衍生出抗体的对应种系序列相比，本文所用的双特异性抗体在重链可变结构域的框架和/或cdr区域中包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失。
[0091]
本文还使用来源于本文所公开的氨基酸序列中的任一个的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架和/或cdr区内的一个或多个氨基酸突变成得到所述抗体的种系序列的对应残基，或另一人类种系序列的对应残基，或对应种系残基的保守氨基酸置换(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)，并且具有弱的或不可检测的抗原结合。
[0092]
此外，本文所用的抗体可以含有框架和/或cdr区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个别残基突变为特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基得以保持或突变为不同种系序列的对应残基。在获得含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段后，可以测试一个或多个所期望的性质，诸如改善的结合特异性、减弱或减少的结合亲和力、改善或增强的药代动力学性质、降低的免疫原性等。以本公开的指导给出的这种通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明内。
[0093]
根据本公开使用包含本文提供的具有一个或多个保守置换的hcvr或lcvr氨基酸序列中的任一者的变体的双特异性抗体。与衍生单独抗原结合结构域的相应的种系序列相比，本文使用的抗体和双特异性抗原结合分子在hcvr和lcvr的框架和/或cdr区中包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失，同时维持或改善所期望的抗原结合特征。“保守氨基酸置换”是氨基酸残基被含有具有类似的化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(r基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸置换。通常，保守氨基酸置换大体上不会改变蛋白质的功能特性。含有具有相似的化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括：(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链，即半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守性替代是在以下文献中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的任何变化：gonnet等人(1992)《科学(science)》256:1443-1445。“适度保守”替换是在pam250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
[0094]
本公开还包括包含抗原结合结构域的抗原结合分子，所述抗原结合结构域具有与本文所公开的hcvr和/或cdr氨基酸序列中的任一个基本上相同的hcvr和/或cdr氨基酸序列，同时维持或改善所期望的抗原亲和力。当应用于氨基酸序列时，术语“基本同一性”或“基本上相同”意指当两个氨基酸序列，诸如通过程序gap或bestfit使用默认空位权重进行
最佳比对时，共有至少95％序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置的差异在于保守氨基酸置换。在两个或更多个氨基酸序列的保守置换彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度以校正置换的保守性质。用于进行该调整的手段是本领域的技术人员熟知的。参见例如，pearson(1994)methods mol.杂志》24:307-331。
[0095]
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列相似性，所述序列相似性也称为序列同一性。蛋白质分析软件使用关于指定到各种置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)的相似性度量来匹配相似序列。例如，gcg软件含有诸如gap和bestfit的程序，这些程序可以以默认参数使用，以确定紧密相关的多肽(诸如来自不同物种的生物体的同源多肽)之间，或野生型蛋白及其突变型蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，gcg 6.1版。还可以使用fasta(gcg 6.1版中的程序)使用默认或推荐参数对多肽序列进行比较。fasta(例如，fasta2和fasta3)提供查询与搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比(pearson(2000)同上)。当将本文公开的序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一优选的算法是使用默认参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。参见例如altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschul等人(1997)nucleic acids res.25:3389-402。
[0096]
在获得后，使用一种或多种体外测定法来测试含有一个或多个种系突变的抗原结合结构域的结合亲和力降低。虽然通常通过测试对抗原的高(即强)结合亲和力来筛选识别特定抗原的抗体，但是本文使用的抗体表现出弱结合或不可检测的结合。包含以这种一般方式获得的一个或多个抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子也涵盖在本公开内并且被发现作为亲合力驱动的肿瘤疗法是有利的。
[0097]
意想不到的好处，例如，改善的药代动力学特性和对患者的低毒性可以从本文所述的方法中实现。
[0098]
抗体的结合特性
[0099]
如本文所用，术语“结合”在抗体、免疫球蛋白、抗体结合片段或含fc蛋白与例如预定抗原(诸如细胞表面蛋白)或其片段结合的上下文中，通常是指两个实体或分子结构之间的相互作用或关联，诸如抗体-抗原相互作用。
[0100]
例如，当通过例如表面等离子体共振(spr)技术在biacore 3000仪器中使用抗原作为配体，抗体、ig、抗体结合片段或含fc蛋白作为分析物(或抗配体)测定时，结合亲和力通常对应的kd值为约10-7
m或更小，诸如约10-8
m或更小，诸如约10-9
m或更小。基于细胞的结合策略，诸如荧光活化细胞分选(facs)结合测定法也经常使用，并且facs数据与其他方法(诸如放射性配体竞争结合和spr)很好地关联(benedict,ca,j immunol methods.1997,201(2):223-31；geuijen,ca等人,j immunol methods.2005,302(1-2):68-77)。
[0101]
因此，本文公开的抗体或抗原结合蛋白与预定的抗原或细胞表面分子(受体)结合，其亲和力对应于kd值比其结合至非特异性抗原(例如，bsa、酪蛋白)的亲和力低至少十倍。根据本公开，对应于kd值等于或小于非特异性抗原十倍的抗体的亲和力可以被认为是不可检测的结合，然而这样的抗体可以与用于产生本文公开的双特异性抗体的第二抗原结合臂配对。
[0102]
术语“k
d”(m)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，或抗体或抗体结合片
段与抗原结合的解离平衡常数。kd与结合亲和力之间存在反比关系，因此kd值越小，亲和力越高，即越强。因此，术语“较高亲和力”或“较强亲和力”涉及较高的形成相互作用的能力，因此kd值较小，相反，术语“较低亲和力”或“较弱亲和力”涉及较低的形成相互作用的能力，因此kd值更大。在某些情况下，与分子(例如抗体)与另一个相互作用配偶体分子(例如抗原y)的结合亲和力相比，特定分子(例如抗体)与其相互作用配偶体分子(例如抗原x)的更高的结合亲和力(或kd)可以表示为通过将较大的kd值(较低或较弱的亲和力)除以较小的kd(较高或较强的亲和力)而确定的结合比率，例如表示为结合亲和力大5倍或10倍，视情况而定。
[0103]
术语“k
d”(秒-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数，或抗体或抗体结合片段的解离速率常数。所述值也称为k
off
值。
[0104]
术语“k
a”(m-1
·
秒-1或1/m)是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数，或抗体或抗体结合片段的结合速率常数。
[0105]
术语“k
a”(m-1或1/m)是指特定抗体-抗原相互作用的结合平衡常数，或抗体或抗体结合片段的结合平衡常数。结合平衡常数通过将ka除以kd来获得。
[0106]
术语“ec50”或“ec
50”是指半最大有效浓度，其包括在特定暴露时间后诱导在基线和最大值之间的反应一半的抗体浓度。ec
50
基本上代表了观察到最大作用的50％时的抗体浓度。在某些实施方案中，ec
50
值等于本文公开的抗体对表达cd3或肿瘤相关抗原的细胞产生半最大结合的浓度，如通过例如facs结合测定法所测定。因此，随着ec
50
或半最大效应浓度值的增加，观察到结合减少或减弱。
[0107]
在一个实施方案中，结合降低可定义为能够结合至半数最大量的靶细胞的ec
50
抗体浓度增加。
[0108]
在另一个实施方案中，ec
50
值代表通过t细胞毒活性引起靶细胞半数最大消耗的抗体浓度。因此，随着ec50或半最大效应浓度值降低，观察到细胞毒性活性增加(例如，t细胞介导的肿瘤细胞杀死)。
[0109]
双特异性抗原结合分子
[0110]
本文所用的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同表位具有特异性，或者可以含有对多于一种靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如，tutt等人,1991,j.immunol.147:60-69；kufer等人.,2004,trends biotechnol.22:238-244。本文所用的抗psma/抗cd3双特异性抗体可以连接至另一个功能分子(例如另一个肽或蛋白质)或者与另一个功能分子共表达。例如，抗体或其片段可以功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他分子实体(诸如另一个抗体或抗体片段)，以产生具有第二或另外的结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
[0111]
本文使用的表述“抗cd3抗体”或“抗psma抗体”旨在包括单特异性抗cd3或抗psma抗体以及包含cd3结合臂和psma结合臂的双特异性抗体。因此，本公开包括结合psma的单特异性抗体，例如us 10,179,819中描述的那些抗psma抗体。示例性抗psma抗体包括h1h11810p抗体和在h1h11810抗体内包含cdr的抗体，如us 10,179,819中所公开。此外，本公开包括这样的双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂结合人cd3，而免疫球蛋白的另一个臂对人psma具有特异性。根据本文提供的方法使用的双特异性抗体的示例性序列显示于
表1中。
[0112]
在某些实施方案中，cd3结合臂结合至人cd3并诱导人t细胞活化。在某些实施方案中，cd3结合臂与人cd3弱结合并诱导人t细胞活化。在其他实施方案中，cd3结合臂与人cd3弱结合并在双特异性或多特异性抗体的情况下诱导肿瘤相关抗原表达细胞杀死。在其他实施方案中，cd3结合臂与人和食蟹猕猴(猴)cd3结合或弱结合，但结合相互作用不能通过本领域已知的体外测定法来检测。
[0113]
根据某些示例性实施方案，本公开包括特异性地结合cd3和psma的双特异性抗原结合分子。此类分子在本文中可称为例如“抗cd3/抗psma”或“抗cd3xpsma”或“cd3xpsma”双特异性分子，或其他类似术语(例如，抗psma/抗cd3)。
[0114]
如本文所用，术语“psma”是指人psma蛋白，除非指定为来自非人类物种(例如，“小鼠psma”、“猴psma”等)。
[0115]
上述特异性结合cd3和psma的双特异性抗原结合分子可以包括以弱结合亲和力结合至cd3的抗cd3抗原结合分子，诸如表现出kd大于约40nm，如通过体外亲和结合测定法所测量。
[0116]
如本文所用，表述“抗原结合分子”意指包含或由与特定抗原特异性地结合的单独或与一个或多个另外的cdr和/或框架区(fr)组合的至少一个互补决定区(cdr)组成的蛋白质、多肽或分子复合物。在某些实施方案中，抗原结合分子是抗体或抗体片段，如本文别处定义的那些术语。
[0117]
如本文所用，表述“双特异性抗原结合分子”是指至少包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的蛋白质、多肽或分子复合物。双特异性抗原结合分子内的每个抗原结合结构域包含至少一个特异性结合特定抗原的单独或与一个或多个另外的cdr和/或fr组合的cdr。在本公开的上下文中，第一抗原结合结构域特异性结合第一抗原(例如，cd3)，并且第二抗原结合结构域特异性结合第二不同的抗原(例如，psma)。
[0118]
在某些示例性实施方案中，双特异性抗原结合分子是双特异性抗体。双特异性抗体的每个抗原结合结构域包含重链可变结构域(hcvr)和轻链可变结构域(lcvr)。在包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)的情况下，第一抗原结合结构域的cdr可以用前缀“a1”表示，并且第二抗原结合结构域的cdr可以用前缀“a2”表示。因此，第一抗原结合结构域的cdr在本文中可以称为a1-hcdr1、a1-hcdr2和a1-hcdr3；并且第二抗原结合结构域的cdr在本文中可以称为a2-hcdr1、a2-hcdr2和a2-hcdr3。
[0119]
第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以彼此直接或间接连接，以形成本文所用的双特异性抗原结合分子。可替代地，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以各自连接至分开的多聚结构域。一个多聚结构域与另一个多聚结构域的结合促进两个抗原结合结构域之间的结合，从而形成双特异性抗原结合分子。如本文使用的，“多聚结构域”是任何大分子、蛋白质、多肽、肽或氨基酸，其具有与相同或相似结构或构造的第二多聚结构域结合的能力。例如，多聚结构域可以是包含免疫球蛋白ch3结构域的多肽。多聚组分的非限制性实例是免疫球蛋白的fc部分(包含ch2-ch3结构域)，例如选自同种型igg1、igg2、igg3和igg4以及每个同种型组内的任何同种异型的igg的fc结构域。
[0120]
本文所用的双特异性抗原结合分子通常包含两个多聚结构域，例如两个fc结构
域，其各自个别地是分开的抗体重链的部分。第一多聚结构域和第二多聚结构域可以具有相同的igg同种型，例如igg1/igg1、igg2/igg2、igg4/igg4。可替代地，第一多聚结构域和第二多聚结构域可以具有不同的igg同种型，例如igg1/igg2、igg1/igg4、igg2/igg4等。
[0121]
在某些实施方案中，多聚结构域是fc片段或长度为1至约200个氨基酸的氨基酸序列，其包含至少一个半胱氨酸残基。在其他实施方案中，多聚结构域是半胱氨酸残基或含半胱氨酸的短肽。其他多聚化结构域包括：包含亮氨酸拉链、螺旋-环基序、或卷曲螺旋基序的肽或多肽，或者由亮氨酸拉链、螺旋-环基序、或卷曲螺旋基序组成的肽或多肽。
[0122]
任何双特异性抗体形式或技术都可以用于制备本文所用的双特异性抗原结合分子。例如，具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可以与一种或多种其他分子实体，例如具有第二抗原结合特异性的另一种抗体或抗体片段功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)，以产生双特异性抗原结合分子。可以在本公开的语境中使用的特定示例性双特异性形式包括但不限于例如基于scfv的或双体双特异性形式、igg-scfv融合体、双可变结构域(dvd)-ig、四源杂交瘤、钮入孔、共同轻链(例如，具有钮入孔的共同轻链等)、crossmab、crossfab、(seed)体、亮氨酸拉链、duobody、igg1/igg2、双重作用fab(daf)-igg和mab2双特异性形式(关于前述形式的综述，参见例如，klein等人,2012,mabs 4:6,1-11，以及其中引用的参考文献)。
[0123]
在本文所用的双特异性抗原结合分子的背景下，与野生型、天然存在的形式的fc结构域相比，多聚化结构域(例如，fc结构域)可以包含一个或多个氨基酸改变(例如，插入、缺失或取代)。例如，本公开包括在fc结构域中包含一个或多个修饰的双特异性抗原结合分子，其导致经修饰的fc结构域在fc和fcrn之间具有经修饰的结合相互作用(例如，增强或减弱)。在一个实施方案中，双特异性抗原结合分子在ch2或ch3区中包含修饰，其中所述修饰在酸性环境下(例如，在ph范围为从约5.5至约6.0的胞内体中)增加了fc结构域与fcrn的亲和力。此类fc修饰的非限制性实例包括例如，位置250(例如，e或q)；250和428(例如，l或f)；252(例如，l/y/f/w或t)、254(例如，s或t)和256(例如，s/r/q/e/d或t)处的修饰；或位置428和/或433(例如，l/r/s/p/q或k)和/或434(例如，h/f或y)处的修饰；或位置250和/或428处的修饰；或位置307或308(例如，308f、v308f)和434处的修饰。在一个实施方案中，修饰包括428l(例如m428l)和434s(例如n434s)修饰；428l、259i(例如v259i)和308f(例如v308f)修饰；433k(例如h433k)和434(例如434y)修饰；252、254和256(例如252y、254t和256e)修饰；250q和428l修饰(例如t250q和m428l)；以及307和/或308修饰(例如308f或308p)。
[0124]
本公开还包括包含第一ig ch3结构域和第二ig ch3结构域的双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第二ig ch3结构域的至少一个氨基酸彼此不同，并且其中至少一个氨基酸差异与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比减少了双特异性抗体与蛋白a的结合。在一个实施方案中，第一ig ch3结构域结合蛋白a，并且第二ig ch3结构域含有减少或消除蛋白a结合的突变，诸如h95r修饰(按照imgt外显子编号；按照eu编号为h435r)。第二ch3还可以包含y96f修饰(按照imgt；按照eu的y436f)。参见，例如，美国专利号8,586,713。可以存在于第二ch3内的其他修饰包括：在igg1抗体的情况下，d16e、l18m、n44s、k52n、v57m和v82i(按照imgt；按照eu的d356e、l358m、n384s、k392n、v397m和v422i)；在igg2抗体的情况下，n44s、k52n和v82i(imgt；按照eu的n384s、k392n和v422i)；以及在igg4抗体的情况下，q15r、n44s、k52n、v57m、r69k、e79q和v82i(按照imgt；按照eu的q355r、n384s、k392n、v397m、
r409k、e419q和v422i)。
[0125]
在某些实施方案中，fc结构域可以是嵌合的，其组合了源自多于一种免疫球蛋白同种型的fc序列。例如，嵌合fc结构域可以包含来源于人igg1、人igg2或人igg4 ch2区的ch2序
列
的部分或全部，以
及
来源于人igg1、人igg2或人igg4的ch3序列的部分或全部。嵌合fc结构域也可以含有嵌合铰链区。例如，嵌合铰链可以包含源自人igg1、人igg2或人igg4铰链区的“上铰链”序列，其与源自人igg1、人igg2或人igg4铰链区的“下铰链”序列组合。可以包括在本文所述的任何抗原结合分子中的嵌合fc结构域的特定例子从n末端到c末端包含：[igg4 ch1]-[igg4上铰链]-[igg2下铰链]-[igg4 ch2]-[igg4 ch3]。可以包括在本文所述的任何抗原结合分子中的嵌合fc结构域的另一个例子从n末端到c末端包含：[igg1 ch1]-[igg1上铰链]-[igg2下铰链]-[igg4 ch2]-[igg1 ch3]。可包含在本文所用的任何抗原结合分子中的嵌合fc结构域的这些和其他实例描述于2014年8月28日公开的美国公开2014/0243504中，该公开整体并入本文。具有这些一般结构安排的嵌合fc结构域及其变体可以具有改变的fc受体结合，其依次又影响fc效应子功能。
[0126]
ph依赖性结合
[0127]
本公开包括具有ph依赖性结合特征的抗psma抗体和抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子。例如，与中性ph相比，本文所用的双特异性抗原结合分子的抗psma臂在酸性ph下可表现出与psma的结合降低。或者，与中性ph相比，本文所用的抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子在酸性ph下可表现出与psma的结合增强。表述“酸性ph”包括小于约6.2，例如约6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更小的ph值。如本文所用，表述“中性ph”意指约7.0至约7.4的ph。表述“中性ph”包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4的ph值。
[0128]
在某些情况下，“与中性ph相比在酸性ph下结合减少”以在酸性ph下抗体与其抗原结合的kd值与在中性ph下抗体与其抗原结合的kd值的比率来表述(反之亦然)。例如，出于本公开的目的，如果抗体或其抗原结合片段表现出酸性/中性kd比率为约3.0或更大，则抗体或其抗原结合片段可被视为表现出“与中性ph相比在酸性ph下结合至psma减少”。在某些示例性实施方案中，抗体或抗原结合片段的酸性/中性kd比率可以为约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更高。
[0129]
可以例如通过就与中性ph相比在酸性ph与特定抗原结合减少(或增强)而筛选抗体群体，来获得具有ph依赖性结合特征的抗体。另外，在氨基酸水平修饰抗原结合结构域可以产生具有ph依赖性特征的抗体。例如，通过将抗原结合结构域的一个或多个氨基酸(例如，在cdr内部)置换为组氨酸残基，可以获得相对于中性ph在酸性ph时抗原结合作用减少的抗体。
[0130]
包含fc变体的抗体
[0131]
根据本文所用的某些实施方案，提供这样的抗psma抗体和抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子：它们包含fc结构域，所述fc结构域包含例如在酸性ph下与中性ph相比，增强或减弱与fcrn受体的抗体结合的一个或多个突变。例如，本公开包括这样的抗体：所述抗体在fc结构域的ch2或ch3区中包含突变，其中一个或多个突变在酸性环境下(例如，在ph范围为从约5.5至约6.0的胞内体中)增加了fc结构域与fcrn的亲和力。当向动物施用时，此类突
变可以导致抗体的血清半衰期增加。此类fc修饰的非限制性实例包括例如，位置250(例如，e或q)；250和428(例如，l或f)；252(例如，l/y/f/w或t)、254(例如，s或t)和256(例如，s/r/q/e/d或t)处的修饰；或位置428和/或433(例如，h/l/r/s/p/q或k)和/或434(例如，h/f或y)处的修饰；或位置250和/或428处的修饰；或位置307或308(例如，308f、v308f)和434处的修饰。在一个实施方案中，修饰包括428l(例如m428l)和434s(例如n434s)修饰；428l、259i(例如v259i)和308f(例如v308f)修饰；433k(例如h433k)和434(例如434y)修饰；252、254和256(例如252y、254t和256e)修饰；250q和428l修饰(例如t250q和m428l)；以及307和/或308修饰(例如308f或308p)。
[0132]
例如，本公开包括包含fc结构域的抗psma抗体和抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子，所述fc结构域包含一对或多对或一组或多组选自由以下组成的组的突变：250q和248l(例如，t250q和m248l)；252y、254t和256e(例如，m252y、s254t和t256e)；428l和434s(例如，m428l和n434s)；以及433k和434f(例如，h433k和n434f)。前述fc结构域突变的所有可能组合和本文公开的抗体可变结构域内的其他突变都涵盖在本公开的范围内。
[0133]
抗体和双特异性抗原结合分子的生物学特特征
[0134]
根据本公开使用以高亲和力(例如，亚纳摩尔kd值)结合表达cd3的人t细胞和/或人psma的单特异性和双特异性抗体及其抗原结合片段。此类抗体及其特性在美国专利号10,179,819中有所公开，该专利以引用的方式并入本文。这种双特异性抗体与抗4-1bb激动剂组合治疗肿瘤特别有用。
[0135]
本文使用抗psma抗体和抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子，它们表现出一个或多个选自由以下各项组成的组的特征：(a)抑制携带人前列腺癌异种移植物的免疫受损小鼠的肿瘤生长；(b)抑制带人前列腺癌异种移植物的免疫健全小鼠的肿瘤生长；(c)抑制携带人前列腺癌异种移植物的免疫受损小鼠的肿瘤生长；以及(d)减少携带人前列腺癌异种移植物的免疫健全小鼠中已建立的肿瘤的肿瘤生长(参见，例如，美国专利号10,179,819，实施例8)。
[0136]
本文使用抗体及其抗原结合片段，它们以中等或低亲和力结合人cd3，这取决于治疗背景和所需的特定靶向特性。例如，在双特异性抗原结合分子的情况下，其中一个臂结合cd3，另一臂结合靶抗原(例如，psma)，可以需要靶抗原结合臂以高亲和力结合靶抗原，而抗cd3臂仅以中等或低亲和力结合cd3。以这种方式，可以实现抗原结合分子对表达靶抗原的细胞的优先靶向，同时避免一般/非靶向cd3结合以及随之而来的与之相关的不良副作用。
[0137]
本文所用的双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)能够同时结合至人cd3和人psma。与表达cd3的细胞相互作用的结合臂在合适的体外结合测定法中可以具有弱的或不可检测的结合。双特异性抗原结合分子结合表达cd3和/或psma的细胞的程度可以通过荧光活化细胞分选(facs)来评估，如美国专利号10,179,819实施例5中所示。
[0138]
例如，本文使用特异性结合表达cd3但不表达psma的人t细胞系(例如，jurkat)、灵长类t细胞(例如，食蟹猕猴外周血单核细胞[pbmc])和/或表达psma的细胞的双特异性抗体。本文使用双特异性抗原结合分子，它们以约1.8
×
10-8
(18nm)至约2.1
×
10-7
(210nm)或更高的ec
50
值(即，较弱的亲和力)结合任何上述t细胞和t细胞系或ec
50
不可检测的，如使用美国专利号10,179,819实施例5所述的facs结合测定法，或基本上相似的测定法所测定。本文还使用结合至表达psma的细胞和细胞系的双特异性抗体，它们的ec
50
值小于或等于5.6nm
(5.6
×
10-9
)，如使用美国专利号10,179,819实施例5所述的facs结合测定法，或基本上相似的测定法所测定。
[0139]
在一些方面，双特异性抗体以弱(即低)或甚至不可检测的亲和力结合人cd3。根据某些实施方案，本公开包括以大于约11nm的kd结合人cd3(例如，在37℃下)的抗体和抗体的抗原结合片段，如通过表面等离子体共振所测量。
[0140]
在一些方面，双特异性抗体以弱(即低)或甚至不可检测的亲和力结合猴(即食蟹猕猴)cd3。
[0141]
在一些方面，双特异性抗体结合人cd3并诱导t细胞活化。例如，某些抗cd3抗体以小于约113pm的ec
50
值诱导人t细胞活化，如通过体外t细胞活化测定法所测量。
[0142]
本文所用的双特异性抗体可以结合人cd3并诱导t细胞介导的肿瘤抗原表达细胞的杀死。例如，本公开包括诱导t细胞介导的肿瘤细胞杀死的双特异性抗体，其ec
50
小于约1.3nm，如体外t细胞介导的肿瘤细胞杀死测定法所测量。
[0143]
如在25℃或37℃下通过表面等离子共振所测量，本文所用的双特异性抗体可以以小于约10分钟的解离半衰期(t1/2)结合cd3。
[0144]
本文所用的抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子可以另外表现出一个或多个选自由以下各项组成的组的特征：(a)体外诱导pbmc增殖；(b)通过诱导人全血中的ifn-γ释放和cd25上调来活化t细胞；以及(c)在抗psma抗性细胞系上诱导t细胞介导的细胞毒性。
[0145]
本公开包括能够消耗受试者中的表达肿瘤抗原的细胞的抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子(参见例如，美国专利号10,179,819，实施例8)。例如，根据某些实施方案，提供了抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子，其中每名患者1μg、或10μg、或100μg、或1mg、3mg、5mg、10mg、30mg、50mg、100mg、300mg、或500mg双特异性抗原结合分子向受试者的单次施用(例如，剂量为约5mg/kg、约2.5mg/kg、约1mg/kg、约0.1mg/kg、约0.08mg/kg、约0.06mg/kg、约0.04mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg或更少)导致受试者中表达psma的细胞的数量降低至(例如，受试者中的肿瘤生长受到抑制或压制)低于可检测的水平。在某些实施方案中，以约0.4mg/kg的剂量单次施用抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子导致受试者的肿瘤生长在将双特异性抗原结合分子施用于受试者后约第7天、约第6天、约第5天、约第4天、约第3天、约第2天或约第1天降低至低于可检测的水平。根据某些实施方案，以至少约0.01mg/kg的剂量单次施用本文公开的抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子，导致表达psma的肿瘤细胞的数量保持低于可检测的水平直到施用后至少约7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天或更长时间。如本文所用，表述“低于可检测的水平”是指使用本文的标准卡尺测量方法，不能直接或间接检测到在受试者皮下生长的肿瘤细胞，例如如美国专利号10,179,819实施例8所述。
[0146]
还根据本文提供的方法使用抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子，它们表现出一个或多个选自由以下各项组成的组的特征：(a)抑制携带人前列腺癌异种移植物的免疫受损小鼠的肿瘤生长；(b)抑制带人前列腺癌异种移植物的免疫健全小鼠的肿瘤生长；(c)抑制携带人前列腺癌异种移植物的免疫受损小鼠中的肿瘤的肿瘤生长；以及(d)减少携带人前列腺癌异种移植物的免疫健全小鼠中已建立的肿瘤的肿瘤生长(参见，例如，美国专利号10,179,819，实施例8)。示例性抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子可以另外表现出一个或多个选自由以下各项组成的组的特征：(a)诱导循环细胞因子的瞬时剂量依赖性增加，以
及(b)诱导循环t细胞的瞬时减少。
[0147]
表位作图和相关技术
[0148]
本文所用的抗原结合分子结合的cd3和/或psma上的表位可以由3个或更多个(例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)cd3或psma蛋白的氨基酸的单个邻接序列组成。或者，表位可以由多个cd3或psma的非邻接氨基酸(或氨基酸序列)组成。根据本文公开的方法使用的抗体可以与包含在单个cd3链内的氨基酸(例如，cd3-ε、cd3-δ或cd3-γ)相互作用，或可以与两个或更多个不同的cd3链上的氨基酸相互作用。如本文所用，术语“表位”是指与抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点(称为互补位)发生相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有超过一个表位。因此，不同抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的氨基酸在空间上并列而产生。线性表位由多肽链中的邻近氨基酸残基来产生。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基基团或磺酰基基团部分。
[0149]
本领域普通技术人员已知的各种技术可以用于确定抗体的抗原结合结构域是否在多肽或蛋白质内“与一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规交叉阻断测定法(诸如antibodies,harlow and lane(cold spring harbor press,cold spring harb.,ny)所述)、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(reineke,2004,methods mol biol 248:443-463)和肽切割分析。此外，可以采用诸如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(tomer,2000,protein science 9:487-496)。可以用于鉴定与抗体的抗原结合结构域相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般来说，氢/氘交换法涉及所关注的蛋白质的氘标记，接着是抗体与氘标记的蛋白质的结合。然后，将蛋白质/抗体复合物转移至水中，以允许氢-氘交换在除抗体保护的残基(仍然是氘标记的)之外的所有残基处发生。在抗体解离后，对靶蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，从而揭示氘标记的残基，这些残基对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见例如，ehring(1999)analytical biochemistry 267(2):252-259；engen和smith(2001)anal.chem.73:256a-265a。抗原/抗体复合物的x射线晶体学也可用于表位作图目的。
[0150]
本文所用的示例性双特异性抗原结合分子可以包含以低的或可检测的结合亲和力特异性结合人cd3和/或食蟹猕猴cd3的第一抗原结合结构域，和特异性结合人psma的第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域结合与本文所述的任何特定示例性cd3特异性抗原结合结构域相同的cd3上的表位，和/或其中所述第二抗原结合结构域结合与本文所述的任何特定示例性psma特异性抗原结合结构域相同的psma上的表位。
[0151]
同样，本文所用的双特异性抗原结合分子可以包含特异性结合人cd3的第一抗原结合结构域和特异性结合人psma的第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域与表1中的本文所述的任何特定示例性cd3特异性抗原结合结构域竞争cd3的结合，和/或其中所述第二抗原结合结构域与表1中的本文所述的任何特定示例性psma特异性抗原结合结构域竞争psma的结合。
[0152]
通过使用本领域已知的常规方法，可以容易地确定特定抗原结合分子(例如，抗体)或其抗原结合结构域是否结合至与本公开的参考抗原结合分子相同的表位或与本公开的参考抗原结合分子竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否结合至与本公开的参考双特
异性抗原结合分子相同的psma(或cd3)上的表位，首先允许参考双特异性分子结合至psma蛋白(或cd3蛋白)。然后，评估测试抗体结合至psma(或cd3)分子的能力。如果测试抗体在与参考双特异性抗原结合分子饱和结合后能够结合至psma(或cd3)，则可以得出以下结论：测试抗体结合至与参考双特异性抗原结合分子不同的psma(或cd3)的表位。在另一个方面，如果测试抗体在与参考双特异性抗原结合分子饱和结合后不能结合至psma(或cd3)分子，则测试抗体可以结合至与参考双特异性抗原结合分子所结合的表位相同的psma(或cd3)的表位。然后可以进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)，以确认所观察到的测试抗体结合的缺乏事实上是否是由于结合至与参考双特异性抗原结合分子相同的表位，或者空间阻断(或另一个现象)是否是造成所观察的结合缺乏的原因。可以使用elisa、ria、biacore、流式细胞术或者本领域可用的任何其他定量或定性抗体结合测定法来进行这类实验。根据本公开的某些实施方案，如果例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的一种抗原结合蛋白抑制另一种抗体的结合至少50％，但优选地75％、90％或甚至99％，如在竞争性结合测定法中所测量，则两种抗原结合蛋白结合至相同的(或重叠)表位(参见例如，junghans等人,cancer res.1990:50:1495-1502)。或者，如果抗原中的减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的基本上所有氨基酸突变都减少或消除另一种抗原结合蛋白的结合，则认为两种抗原结合蛋白结合至相同的表位。如果只有减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一种抗原结合蛋白的结合，则认为两种抗原结合蛋白具有“重叠表位”。
[0153]
为了确定抗体或其抗原结合结构域是否与参考抗原结合分子竞争结合，在两个方向上进行上述结合方法：在第一方向上，使参考抗原结合分子在饱和条件下结合至psma蛋白(或cd3蛋白)，然后评估测试抗体与psma(或cd3)分子的结合。在第二方向上，使测试抗体在饱和条件下结合至psma(或cd3)，然后评估参考抗原结合分子与psma(或cd3)分子的结合。如果在两个方向上只有第一(饱和)抗原结合分子能够结合至psma(或cd3)分子，则可以得出以下结论：测试抗体和参考抗原结合分子竞争psma(或cd3)的结合。如本领域的普通技术人员所理解，竞争与参考抗原结合分子的结合的抗体可能未必结合至与参考抗体相同的表位，但是可能通过重叠或邻近表位的结合来在空间上阻断参考抗体的结合。
[0154]
抗原结合结构域的制备和双特异性分子的构建
[0155]
可以通过本领域已知的任何抗体产生技术制备对特定抗原具有特异性的抗原结合结构域。一旦获得，对两种不同抗原(例如，cd3和psma)具有特异性的两种不同的抗原结合结构域可以彼此相对适当地排列以使用常规方法产生双特异性抗原结合分子。(可用于构建本公开的双特异性抗原结合分子的示例性双特异性抗体形式的讨论在本文别处提供)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合分子的一种或多种单独组件(例如，重链和轻链)来源于嵌合、人源化或完全人抗体。制备此类抗体的方法是本领域熟知的。例如，可以使用velocimmune
tm
技术来制备本文所用的双特异性抗原结合分子的重链和/或轻链中的一者或多者。使用velocimmune
tm
技术(参见，例如，us 6,596,541，regeneron pharmaceuticals,或产生任何其他人抗体的技术)，最初分离出具有人可变区和小鼠恒定区的针对特定抗原(例如，cd3或psma)的高亲和力嵌合抗体。针对期望特征，包括亲和力、选择性、表位等表征并且选择抗体。小鼠恒定区被所需的人恒定区替换以产生可掺入本文所用的双特异性抗原结合分子中的完全人重链和/或轻链。
[0156]
基因工程动物可用于制备人双特异性抗原结合分子。例如，可以使用不能重排和
表达内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变序列的经遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠仅表达一个或两个由人免疫球蛋白序列编码的人轻链可变结构域，所述人免疫球蛋白序列可操作地连接至内源性小鼠κ基因座处的小鼠κ恒定基因。此类经遗传修饰的小鼠可用于产生包含两条不同重链的完全人双特异性抗原结合分子，所述重链与包含来源于两个不同的人轻链可变区基因区段之一的可变结构域的相同轻链相关联。(参见，例如，us 10,143,186对此类工程化小鼠及其用于产生双特异性抗原结合分子的用途的详细讨论)。
[0157]
生物等效物
[0158]
本公开的方法考虑使用具有与本文公开的示例性分子的氨基酸序列不同但保留结合cd3和/或psma的能力的氨基酸序列的抗原结合分子。当与亲本序列相比时，此类变体分子可以包含一个或多个氨基酸添加、缺失或置换，但是表现出基本上相当于所描述的双特异性抗原结合分子的生物学活性。
[0159]
本文使用与表1所述的示例性抗原结合分子中的任一者生物等效的抗原结合分子。如果两种抗原结合蛋白或抗体是药物等效物或药物替代物，并且当在相似的实验条件下以相同的摩尔剂量的单剂量和多剂量给药时，所述药物等效物或药物替代物未显示出吸收速率和程度的显著差异，则它们被视为生物等效物。如果一些抗原结合蛋白在吸收程度上是等效的，但是在吸收速率上不是等效的，则它们将被视为等效物或药物替代物，但是因为吸收速率的这种差异是有意的并且反映在标记中，所以可以被视为生物等效物，这些抗体对于例如在长期使用中达到有效体内药物浓度不是必需的，并且被认为对于所研究的特定药品不具有临床意义。
[0160]
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和效力方面不存在有临床意义的差异，则它们是生物等效物。
[0161]
在一个实施方案中，如果与不进行参考产品和生物产品之间的切换的连续疗法相比，患者可以进行此类切换一次或多次，而没有预期的不良反应风险的增加，包括免疫原性的临床上显著的变化、或减少的有效性，则两种抗原结合蛋白是生物等效的。
[0162]
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白都通过针对一个或多个使用条件的一种或多种共同作用机制来发挥作用，以达到此类机制是已知的程度，则所述两种抗原结合蛋白是生物等效的。
[0163]
生物等效性可以通过体内和体外方法来展示。生物等效性度量包括，例如，(a)在人或其他哺乳动物中的体内试验，其中测量了随时间推移的血液、血浆、血清或其他生物流体中的抗体或其代谢物的浓度；(b)与人体内生物利用率数据相关联并且可以合理地预测人体内生物利用率数据的体外试验；(c)在人或其他哺乳动物中的体内试验，其中测量了随时间推移的抗体(或其靶标)的适当急性药理作用；以及(d)建立抗原结合蛋白的安全性、功效、或者生物利用率或生物等效性的良好对照的临床试验。
[0164]
可以通过例如进行残基或序列的各种置换或使生物学活性不需要的末端或内部残基或序列缺失来构建本文所阐述的抗原结合分子的示例性双特异性抗原结合分子的生物等效变体。举例来说，可以缺失不是生物学活性必需的半胱氨酸残基或用其他氨基酸替换，以防止在复性时形成不必要的或不正确的分子内二硫桥键。在其他语境中，生物等效抗原结合蛋白可以包括本文所阐述的示例性双特异性抗原结合分子的包含修改所述分子的糖基化特征的氨基酸变化(例如消除或去除糖基化的突变)的变体。
[0165]
物种选择性和物种交叉反应性
[0166]
根据某些实施方案，本文所用的双特异性抗原结合分子结合至人cd3但不结合至来自其他物种的cd3。本文还使用结合至人psma但不结合至来自其他物种的psma的抗原结合分子。本公开的方法还考虑使用结合人cd3和来自一种或多种非人类物种的cd3的双特异性抗原结合分子；和/或与人psma和来自一种或多种非人类物种的psma结合的双特异性抗原结合分子。
[0167]
根据某些示例性实施方案，本文所用的抗原结合分子结合至人cd3和/或人psma并且可以结合或不结合(视情况而定)至小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、奶牛、马、骆驼、食蟹猕猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩cd3和/或psma中的一者或多者。例如，在本公开的特定示例性实施方案中，提供了这样的双特异性抗原结合分子：所述双特异性抗原结合分子包含结合人cd3和食蟹猕猴cd3的第一抗原结合结构域和特异性结合人psma的第二抗原结合结构域。
[0168]
用于免疫pet成像的抗psma/抗cd3抗原结合分子的放射性标记的免疫缀合物
[0169]
本文提供了结合抗psma抗体或抗psma/抗cd3抗原结合分子的放射性标记的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，放射性标记的抗原结合蛋白包含共价键合至正电子发射体的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，放射性标记的抗原结合蛋白包含共价键合至一种或多种螯合部分的抗原结合蛋白，所述螯合部分是能够螯合正电子发射体的化学部分。
[0170]
合适的放射性标记的抗原结合蛋白，例如放射性标记的抗体，包括在暴露于放射性标记的抗原结合蛋白后不损害或基本上不损害t细胞功能的那些。在一些实施方案中，结合抗psma/抗cd3抗原结合分子的放射性标记的抗原结合蛋白是cd3t细胞功能的弱阻断剂，即在暴露于放射性标记的抗体后，t细胞功能不受损或基本上不受损。根据本文提供的方法使用对cd3介导的t细胞功能具有最小影响的放射性标记的抗cd3结合蛋白，确保用所述分子治疗的受试者不因其t细胞无法清除感染而不利。
[0171]
在一些实施方案中，提供了抗psma抗体或抗psma/抗cd3抗原结合分子，例如双特异性抗体，其中所述抗原结合蛋白共价键至一个或多个具有以下结构的部分：
[0172]-l-mz[0173]
其中l是螯合部分；m是正电子发射体；并且z在每次出现时独立地是0或1；并且其中z中的至少一个是1。
[0174]
在一些实施方案中，放射性标记的抗原结合蛋白是式(i)化合物：
[0175]
m-l-a-[l-mz]k[0176](i)[0177]
a是抗psma抗体或抗psma/抗cd3抗原结合分子；l是螯合部分；m是正电子发射体；z为0或1；并且k为0-30的整数。在一些实施方案中，k是1。在一些实施方案中，k是2。
[0178]
在某些实施方案中，放射性标记的抗原结合蛋白是式(ii)化合物：
[0179]
a-[l-m]k[0180]
ii.
[0181]
其中a是抗psma抗体或抗psma/抗cd3抗原结合分子；l是螯合部分；m是正电子发射体；并且k为1-30的整数。
[0182]
在一些实施方案中，本文提供了包含具有以下结构的缀合物的组合物：
[0183]
a-lk[0184]
其中a是抗psma抗体或抗psma/抗cd3抗原结合分子；l是螯合部分；并且k为1-30的整数；其中所述缀合物与正电子发射体以足以提供适用于临床pet成像的比活度的量螯合。
[0185]
下文提供了合适的螯合部分和正电子发射体。
[0186]
正电子发射体和螯合部分
[0187]
合适的正电子发射体包括但不限于与螯合部分形成稳定复合物，并且具有适于免疫pet成像目的的物理半衰期的正电子发射体。示例性正电子发射体包括但不限于
89
zr、
68
ga、
64
cu、
44
sc和
86
y。合适的正电子发射体还包括与抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子直接键合的那些正电子发射体，包括但不限于
76
br和
124
i，以及通过辅基引入的那些正电子发射体，例如
18
f。
[0188]
本文所述的螯合部分是与抗psma/抗cd3抗原结合分子共价连接的化学部分，并且包含能够螯合正电子发射体(即，能够与正电子发射体反应以形成配位螯合复合物)的部分。合适部分包括允许高效负载特定金属，并且形成对于诊断用途(例如，免疫pet成像)来说在体内足够稳定的金属-螯合剂复合物的部分。说明性螯合部分包括使正电子发射体的解离和在矿物骨、血浆蛋白和/或骨髓沉积中的累积减到最少，直到适于诊断用途的程度的螯合部分。
[0189]
螯合部分的实例包括但不限于与正电子发射体
89
zr、
68
ga、
64
cu、
44
sc和/或
86
y形成稳定复合物的那些螯合部分。说明性螯合部分包括但不限于以下中所描述的螯合部分：nature protocols,5(4):739,2010；bioconjugate chem.,26(12):2579(2015)；chem commun(camb),51(12):2301(2015)；mol.pharmaceutics,12:2142(2015)；mol.imaging biol.,18:344(2015)；eur.j.nucl.med.mol.imaging,37:250(2010)；eur.j.nucl.med.mol.imaging(2016).doi:10.1007/s00259-016-3499-x；bioconjugate chem.,26(12):2579(2015)；wo 2015/140212a1；以及us 5,639,879，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
[0190]
示例性螯合部分还包括但不限于包含以下部分的那些：去铁敏(dfo)、1,4,7,10-四乙酸(dota)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、乙二胺四乙酸(edta)、(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸)酸(dotp),1r,4r,7r,10r)-α'α”α”'-四甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dotma)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(dota)、h4octapa、h6phospa、h2dedpa、h5decapa、h2azapa、hopo、do2a、1,4,7,10-四(氨基甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(dotam)、1,4,7-三氮杂环壬烷-n,n',n
”‑
三乙酸(nota)、1,4,7,10-四(氨基甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(dotam)、1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸(cb-te2a)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(cyclen)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(cyclam)、八齿螯合剂、八齿双官能螯合剂(例如，dfo*)、六齿螯合剂、基于膦酸盐的螯合剂、大环螯合剂、包含大环对苯二甲酰胺配体的螯合剂、双官能螯合剂、镰刀霉氨酸c和镰刀霉氨酸c衍生物螯合剂、三乙酰镰刀霉氨酸c(tafc)、铁草铵e(foxe)、铁草铵b(foxb)、铁色素a(fcha)等等。
[0191]
在一些实施方案中，螯合部分通过接头部分共价键合至抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子，所述接头部分将螯合部分的螯合部与结合蛋白共价连接。在一些实施方案中，这些接头部分由以下反应部分之间的反应形成：双特异性抗原结合分子的反应部分(例如，
抗体的半胱氨酸或赖氨酸)和连接至螯合剂的反应部分(包括例如对异硫氰酸根合苯甲基和下文缀合方法中提供的反应部分)。此外，此类接头部分任选地包含用于调节极性、溶解度、空间相互作用、刚性和/或螯合部分与抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子之间的长度的目的化学基团。
[0192]
放射性标记的抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子缀合物的制备
[0193]
放射性标记的抗psma抗体缀合物和抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子缀合物可以通过(1)使抗原结合分子与包含正电子发射体螯合剂和对双特异性结合蛋白的所期望的缀合位点具有反应性的部分的分子反应，以及(2)负载上所期望正电子发射体来制备。
[0194]
合适的缀合位点包括但不限于赖氨酸和半胱氨酸，其两者可以是例如天然或工程化的，并且可以例如存在于抗体的重链或轻链上。半胱氨酸缀合位点包括但不限于从抗体二硫键突变、插入或减少获得的位点。用于制造半胱氨酸工程化抗体的方法包括但不限于wo2011/056983中所公开的方法。位点特异性缀合方法也可以用于将缀合反应引导到抗体的特定位点、达成期望的化学计量和/或达成期望的螯合剂与抗体的比率。此类缀合方法是本领域普通技术人员已知的，并且包括但不限于半胱氨酸工程化和酶促和化学酶促方法，包括但不限于谷氨酰胺缀合、q295缀合和谷氨酰胺转氨酶介导的缀合，以及描述于j.clin.immunol.,36:100(2016)中的方法，所述文献以全文引用的方式并入本文中。对所期望的缀合位点具有反应性的合适的部分一般能够实现抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)与正电子发射体螯合剂的高效和便捷偶联。对赖氨酸和半胱氨酸位点具有反应性的部分包括普通技术人员已知的亲电子基团。在某些方面，当所需的缀合位点是赖氨酸时，反应性部分是异硫氰酸酯，例如对异硫氰酸根合苯甲基或反应性酯。在某些方面，当所需缀合位点是半胱氨酸时，反应部分是马来酰亚胺。
[0195]
当螯合剂是去铁敏(dfo)时，合适的反应部分包括但不限于对异硫氰酸根合苯甲基、正羟基琥珀酰亚胺酯、2,3,5,6四氟苯酚酯、正琥珀酰亚胺基-s-乙酰基硫代乙酸酯，以及描述于biomed research international,第2014卷,文章编号203601中的部分，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在某些实施方案中，包含正电子发射体螯合剂和对缀合位点具有反应性的部分的分子是对异硫氰酸根合苯甲基-去铁敏(p-scn-bn-dfo)：
[0196][0197]
正电子发射体负载通过以下步骤实现：将抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子螯合剂缀合物与正电子发射体一起温育，持续足以允许所述正电子发射体与螯合剂配位的时间，例如通过进行本文提供的实例中所描述的方法或基本上类似的方法。
[0198]
缀合物的示例性实施方案
[0199]
本公开包括放射性标记的抗体缀合物，其包含抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子和正电子发射体。本公开还包括放射性标记的抗体缀合物，其包含抗psma
抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子、螯合部分和正电子发射体。
[0200]
在一些实施方案中，螯合部分包含能够与
89
zr形成复合物的螯合剂。在某些实施方案中，螯合部分包含去铁敏。在某些实施方案中，螯合部分是对异硫氰酸根合苯甲基-去铁敏。
[0201]
在一些实施方案中，正电子发射体是
89
zr。在一些实施方案中，小于1.0％的抗抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子与正电子发射体缀合，小于0.9％的抗抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子与正电子发射体缀合，小于0.8％的抗抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子与正电子发射体缀合，小于0.7％的抗抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子与正电子发射体缀合，小于0.6％的抗抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子与正电子发射体缀合，小于0.5％的抗抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子与正电子发射体缀合，小于0.4％的抗抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子与正电子发射体缀合，小于0.3％的抗抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子与正电子发射体缀合，小于0.2％的抗抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子与正电子发射体缀合，或者小于0.1％的抗抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子与正电子发射体缀合。
[0202]
在一些实施方案中，缀合物的螯合部分与抗体的比率是1.0至2.0。如本文所用，“螯合部分与抗体的比率”是螯合剂部分与抗体的平均比率并且是每抗体螯合剂负载的量度。这种比率类似于由本领域技术人员使用以测量抗体-药物缀合物(adc)的每抗体药物负载的“dar”，即药物-抗体比率；在本文针对ipet成像所述的缀合物的情形下，可以使用本文所述的方法和本领域中已知用于测定dar的其他方法，例如wang等人,antibody-drug conjugates,the 21
st century magic bullets for cancer(2015)中所述的方法确定螯合部分与抗体的比率。在一些实施方案中，螯合部分与抗体的比率是约1.7。在一些实施方案中，螯合部分与抗体的比率是1.0至2.0。在一些实施方案中，螯合部分与抗体的比率是约1.7。
[0203]
在一个特定实施方案中，螯合部分是对异硫氰酸根合苯甲基-去铁敏，并且正电子发射体是
89
zr。在另一个特定实施方案中，螯合部分是对异硫氰酸根合苯甲基-去铁敏，并且正电子发射体是
89
zr，并且缀合物的螯合部分与抗体的比率是1到2。
[0204]
在一些实施方案中，本文提供了抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子，其中所述抗原结合分子共价键合至一个或多个具有以下结构的部分：
[0205]-l-mz[0206]
其中l是螯合部分；m是正电子发射体；并且z在每次出现时独立地是0或1；并且其中z中的至少一个是1。在某些实施方案中，放射性标记的抗原结合蛋白是式(i)化合物：
[0207]
m-l-a-[l-mz]k[0208](i)[0209]
a是抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子；l是螯合部分；m是正电子发射体；z为0或1；并且k为0-30的整数。在一些实施方案中，k是1。在一些实施方案中，k是2。
[0210]
在一些实施方案中，l是：
[0211][0212]
在一些实施方案中，m是
89
zr。
[0213]
在一些实施方案中，k是1至2的整数。在一些实施方案中，k是1。在一些实施方案中，k是2。
[0214]
在一些实施方案中，-l-m是
[0215][0216]
本公开中还包括合成放射性标记的抗体缀合物的方法，所述方法包括使式(iii)化合物：
[0217][0218]
89
zr，其中a是抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，式(iii)化合物通过使抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子与p-scn-bn-dfo接触而合成。
[0219]
本文还提供了式(iii)化合物与
89
zr之间反应的产物。
[0220]
本文提供了式(iii)化合物：
[0221][0222]
其中a是抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子，并且k是1-30的整数。在一些实施方案中，k是1或2。
[0223]
本文提供了这样的抗体缀合物，所述抗体缀合物包含(i)抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子和(ii)一个或多个螯合部分。
[0224]
在一些实施方案中，螯合部分包含：
[0225][0226]
是与抗体或其抗原结合片段的共价键。
[0227]
在一些方面，抗体缀合物的螯合部分与抗体的比率是约1.0到约2.0。在一些方面，抗体缀合物的螯合部分与抗体的比率是约1.7。
[0228]
在一些实施方案中，本文提供了包含具有以下结构的缀合物的组合物：
[0229]
a-lk[0230]
其中a是抗psma抗体或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子；l是螯合部分；并且k为1-30的整数；所述缀合物与正电子发射体以足以提供适用于临床pet成像的比活度的量螯合。在一些实施方案中，螯合正电子发射体的量是足以提供每1-50mg抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子约1至约50mci的比活度的量。
[0231]
在一些实施方案中，螯合正电子发射体的量是足以提供每1至50mg抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子至多50mci、至多45mci、至多40mci、至多35mci、至多30mci、至多25mci或至多10mci，例如在约5至约50mci、约10至约40mci、约15至约30mci、约7至约25mci、约20至约50mci或约5至约10mci范围内的比活度的量。
[0232]
使用放射性标记的免疫缀合物的方法
[0233]
在某些方面，本公开提供了本公开的放射性标记的抗体缀合物的诊断和治疗使用方法。
[0234]
根据一个方面，本公开提供了检测组织中的psma的方法，所述方法包括将本文提供的放射性标记的抗psma抗体缀合物或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子缀合物施用
于组织；以及通过正电子发射断层扫描(pet)成像来使psma表达可视化。在某些实施方案中，组织包含细胞或细胞系。在某些实施方案中，组织存在于受试者中，其中受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人类受试者。在某些实施方案中，受试者患有选自由以下各项组成的组的疾病或障碍：表达psma抗原的癌症，诸如前列腺癌、肾癌、膀胱癌、结肠直肠癌和胃癌。在一个实施方案中，受试者患有前列腺癌。
[0235]
根据一个方面，本公开提供了对表达psma的组织进行成像的方法，所述方法包括将本公开的放射性标记的抗psma抗体缀合物或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子缀合物施用于组织；以及通过正电子发射断层扫描(pet)成像来使psma表达可视化。在一个实施方案中，组织包含在肿瘤中。在一个实施方案中，组织包含在肿瘤细胞培养物或肿瘤细胞系中。在一个实施方案中，组织包含在受试者中的肿瘤病灶中。在一个实施方案中，组织是组织中的瘤内淋巴细胞。在一个实施方案中，组织包含表达psma的细胞。
[0236]
根据一个方面，本公开提供了用于确定患有肿瘤的受试者是否适于抗肿瘤疗法的方法，所述方法包括施用本公开的放射性标记的抗体缀合物，和通过pet成像将所施用的放射性标记的抗体缀合物在肿瘤中定位，其中肿瘤中放射性标记的抗体缀合物的存在将受试者鉴定为适于抗肿瘤疗法。
[0237]
根据一个方面，本公开提供了用于预测患有实体瘤的受试者对抗肿瘤疗法的反应的方法，所述方法包括确定肿瘤是否为psma阳性的，其中如果肿瘤为psma阳性的，则预测受试者发生阳性反应。在某些实施方案中，通过施用本公开的放射性标记的抗体缀合物并且通过pet成像确定放射性标记的抗体缀合物在肿瘤中定位来确定肿瘤为阳性，其中放射性标记的抗体缀合物在肿瘤中的存在表示肿瘤是psma阳性的。
[0238]
根据一个方面，本公开提供了用于检测受试者的psma阳性肿瘤的方法。根据这一方面，所述方法包括向受试者施用本公开的放射性标记的抗体缀合物；以及通过pet成像确定放射性标记的抗体缀合物的定位，其中放射性标记的抗体缀合物在肿瘤中的存在表示肿瘤是psma阳性的。
[0239]
本文提供了预测对抗肿瘤疗法的阳性反应的方法，所述方法包括：向受试者施用放射性标记的抗psma抗体缀合物或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子缀合物，以确定psma阳性细胞在实体瘤中的存在。psma阳性细胞的存在预测对抗肿瘤疗法发生阳性反应。
[0240]
如本文所用，表述“有需要的受试者”意指展现癌症的一种或多种症状或指征，和/或已诊断患有癌症(包括实体瘤)以及需要对所述癌症进行治疗的人类或非人类哺乳动物。在许多实施方案中，术语“受试者”可以与术语“患者”互换使用。举例来说，人类受试者可以诊断患有原发性或转移性肿瘤和/或具有一种或多种症状或指征，包括但不限于不可解释的重量减轻、全身虚弱、持续疲劳、食欲不振、发热、盗汗、骨疼痛、呼吸急促、腹部肿胀、胸痛/胸闷、脾脏肿大以及癌症相关生物标记物(例如，ca125)水平升高。所述表述包括患有原发性肿瘤或已建立肿瘤的受试者。在具体实施方案中，所述表述包括患有实体瘤和/或需要对实体瘤进行治疗的人类受试者，所述实体瘤例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、骨癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、头颈癌以及脑癌。所述术语包括患有原发性或转移性肿瘤(晚期恶性肿瘤)的受试者。在某些实施方案中，表述“有需要的受试者”包括患有实体瘤的受试者，所述实体瘤对先前疗法(例如，用抗癌剂进行的治疗)具有抗性或难以用先前疗法治疗，或不能由先前疗法充分控制。举例来说，所述表述包括已用一线或多线先前疗
法治疗的受试者，所述先前疗法如用利用化疗(例如，卡铂或多西他赛)的治疗。在某些实施方案中，表述“有需要的受试者”包括患有实体瘤的受试者，所述实体瘤已用一线或多线先前疗法治疗，但其随后复发或转移。在某些实施方案中，本公开的方法用于患有实体瘤的受试者。术语“肿瘤”、“癌症”和“恶性肿瘤”在本文中可互换使用。如本文所用，术语“实体瘤”是指通常不含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性(非癌症)或恶性的(癌症)。出于本公开的目的，术语“实体瘤”意指恶性实体瘤。所述术语包括以形成实体瘤的细胞类型命名的不同类型的实体瘤，即肉瘤、癌瘤和淋巴瘤。
[0241]
在某些实施方案中，癌症或肿瘤选自由以下各项组成的组：星形细胞瘤、肛门癌、膀胱癌、血癌、血液癌症、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、肾透明细胞癌、结肠直肠癌、微卫星中间型结肠直肠癌、皮肤鳞状细胞癌、弥散性大b细胞淋巴瘤、子宫内膜癌症、食管癌、纤维肉瘤、胃癌、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、白血病、肝癌、平滑肌肉瘤、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、鼻咽癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、原发性和/或复发性癌症、前列腺癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌症、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、胃部癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌、三阴性乳腺癌、子宫癌和维尔姆斯瘤。在一些方面，癌症是原发性癌症。在一些方面，癌症是转移性和/或复发性癌症。
[0242]
在某些实施方案中，癌症或肿瘤选自psma阳性肿瘤，诸如来源于前列腺上皮、十二指肠粘膜、近端肾小管或结肠隐窝神经内分泌细胞的肿瘤。在一些方面，癌症是膀胱癌、肾癌、胃癌或结肠直肠癌。在一些方面，癌症是前列腺癌。在一些方面，癌症是来源于原发性前列腺肿瘤的转移性癌症。
[0243]
如本文所用，术语“治疗(treat/treating)”等意指缓解症状；暂时或永久消除症状的起因；延迟或抑制肿瘤生长；减少肿瘤细胞负载或肿瘤负荷；促进肿瘤消退；引起肿瘤收缩、坏死和/或消失；预防肿瘤复发；预防或抑制癌转移；抑制转移瘤生长；和/或延长受试者的存活持续时间。
[0244]
在某些实施方案中，向受试者静脉内或皮下施用放射性标记的抗psma抗体缀合物或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子缀合物。在某些实施方案中，放射性标记的抗体缀合物瘤内施用。施用后，放射性标记的抗体缀合物在肿瘤中定位。通过pet成像对定位的放射性标记的抗体缀合物进行成像，并且通过本领域中已知的方法测量肿瘤对放射性标记的抗体缀合物的摄取。在某些实施方案中，在施用放射性标记的缀合物后1、2、3、4、5、6或7天进行成像。在某些实施方案中，在施用放射性标记的抗体缀合物后，在同一天进行成像。
[0245]
在某些实施方案中，放射性标记的抗psma抗体缀合物或抗psma/抗cd3双特异性抗原结合分子缀合物可以以约0.1mg/kg受试者体重至约100mg/kg受试者体重，例如约0.1mg/kg至约50mg/kg、或约0.5mg/kg至约25mg/kg、或约0.1mg/kg至约1.0mg/kg体重的剂量施用。
[0246]
治疗制剂和施用
[0247]
根据本公开使用包含本文所用的抗原结合分子的药物组合物。在一些方面，所述药物组合物还包含抗4-1bb激动剂。药物组合物用合适的载剂、赋形剂、和提供改善的转移、递送、耐受性等等的其他药剂来配制。众多的适当配制物可以见于所有医药化学家已知的处方集中：remington'spharmaceutical sciences,mack publishing company,宾夕法尼亚州伊斯顿(easton,pa)。这些制剂包括例如粉末剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含
脂质(阳离子或阴离子)囊泡(诸如lipofectin
tm
,life technologies,carlsbad,ca)、dna缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳剂碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶剂和含有碳蜡的半固体混合物。还参见powell等人“compendium of excipients for parenteral formulations”pda(1998)j pharm sci technol 52:238-311。
[0248]
施用于患者的抗原结合分子的剂量可以根据患者的年龄和大小、目标疾病、病症、施用途径等等而变化。优选的剂量通常根据体重或体表面积来计算。当双特异性抗原结合分子在成年患者中用于治疗目的时，通常以约0.01至约20mg/kg体重、更优选地约0.02至约7、约0.03至约5、或约0.05至约3mg/kg体重的单剂量静脉内施用双特异性抗原结合分子可以是有利的。在一些方面，通常以约50mg、或约75mg、或约100mg、或约150mg、或约200mg、或约250mg、或约300mg、或约350mg、或约400mg的单剂量静脉内施用双特异性抗原结合分子可以是有利的。视病症的严重程度而定，可以调整治疗的频率和持续时间。可以凭经验确定双特异性抗原结合分子施用的有效剂量和排程；例如，可以通过定期评估来监测患者进展，并且相应地调整剂量。此外，可以使用本领域熟知的方法进行剂量的物种间按比例缩放(例如mordenti等人,1991,pharmaceut.res.8:1351)。
[0249]
施用于患者的抗4-1bb激动剂的剂量可以根据患者的年龄和大小、目标疾病、病症、给药途径等等而变化。优选的剂量通常根据体重或体表面积来计算。当抗4-1bb激动剂用于成年患者的治疗目的时，通常以约0.01至约20mg/kg体重、更优选地约0.02至约7、约0.03至约5、或约0.05至约3、或约2.5mg/kg体重的单剂量静脉内施用激动剂可以是有利的。
[0250]
各种递送系统是已知的，并且可以用于施用本文所用的药物组合物，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞体中(参见例如，wu等人,1987,j.biol.chem.262:4429-4432)。引入的方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述组合物可以通过任何便利的途径，例如通过输注或团注、通过经上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收施用，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性或局部的。
[0251]
可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本文所用的药物组合物。此外，对于皮下递送，笔式递送装置易于应用于递送本文所用的药物组合物。这种笔式递送装置可以重复使用或是一次性的。可重复使用的笔式递送装置一般利用含有药物组合物的可更换的筒。一旦筒内的所有药物组合物都已施用并且筒变空时，就可以容易地丢弃空筒并且更换为含有药物组合物的新筒。然后可以再使用笔式递送装置。在一次性笔式递送装置中，没有可更换的筒。实际上，一次性笔式递送装置在装置内的储集器中预填充有药物组合物。一旦清空储集器中的药物组合物，就丢弃整个装置。
[0252]
多种可重复使用的笔式递送装置和自动注射器递送装置应用于皮下递送本文所用的药物组合物。实例包括但不限于autopen
tm
(owen mumford,inc.,woodstock,uk)、disetronic
tm
笔(disetronic medical systems,bergdorf,switzerland),humalog mix 75/25
tm
笔、humalog
tm
笔、humalin 70/30
tm
笔(eli lilly and co.,indianapolis,in)、novopen
tm i、ii和iii(novo nordisk,copenhagen,denmark)、novopen junior
tm
(novo nordisk,copenhagen,denmark)、bd
tm
笔(becton dickinson,franklin lakes,nj)、optipen
tm
、optipen pro
tm
、optipen starlet
tm
和opticlik
tm
(sanofi-aventis,frankfurt,germany)等等。本文所用的药物组合物的皮下递送的一次性笔递送装置的实例包括但不限
于solostar
tm
笔(sanofi-aventis)、flexpen
tm
(novo nordisk)、和kwikpen
tm
(eli lilly)、sureclick
tm
自动注射器(amgen,thousand oaks,ca)、penlet
tm
(haselmeier,stuttgart,germany)、epipen(dey,l.p.)、和humira
tm
笔(abbott labs,abbott park il)等等。
[0253]
在某些情形下，药物组合物可以在控制释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见langer,同上；sefton,1987,crc crit.ref.biomed.eng.14:201)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料；参见medical applications of controlled release,langer和wise(编辑),1974,crc pres.,boca raton,florida。在又一个实施方案中，可以将控释系统放置于组合物靶标附近，因此只需要全身剂量的一小部分(参见例如，goodson,1984,载于medical applications of controlled release,同上,第2卷,第115-138页)。其他控释系统在langer,1990,science 249:1527-1533的综述中有所讨论。
[0254]
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴液输注等的剂型。这些可注射制剂可以通过众所周知的方法制备。举例来说，可注射制剂可以例如将上文所描述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于常规地用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。作为用于注射的水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂等的等渗溶液，其可以与适当的增溶剂组合使用，所述增溶剂如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、hco-50(氢化蓖麻油聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作为油性介质，采用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等组合使用。由此制备的注射剂优选地填充于适当安瓿中。
[0255]
有利地，将用于上文所描述的口服或不经肠使用的药物组合物制备成适合于符合活性成分剂量的单位剂量的剂型。此类呈单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。所含有的前述抗体的量通常为在单位剂量中每剂型约0.5至约500mg；尤其是在注射形式中，对于其他剂型，所含有的前述抗体的量为约5至约100mg和约10至约250mg是优选的。
[0256]
组合疗法和制剂
[0257]
本公开提供了方法，所述方法包括与抗4-1bb激动剂和一种或多种另外的治疗剂组合施用包含本文所述的示例性单特异性或双特异性抗原结合分子中的任一者的药物组合物。可以与抗4-1bb激动剂和本文所用的双特异性抗原结合分子组合或组合施用的示例性另外的治疗剂包括：例如，egfr拮抗剂(例如，抗egfr抗体[例如，西妥昔单抗或帕尼单抗]或小分子egfr抑制剂[例如，吉非替尼或厄洛替尼])、另一个egfr家族成员的拮抗剂诸如her2/erbb2、erbb3或erbb4(例如，抗erbb2、抗erbb3或抗erbb4抗体或者erbb2、erbb3或erbb4活性的小分子抑制剂)、egfrviii的拮抗剂(例如，特异性结合egfrviii的抗体)、cmet激动剂(例如，抗cmet抗体)、igf1r拮抗剂(例如，抗igf1r抗体)、b-raf抑制剂(例如，维罗非尼、索拉非尼、gdc-0879、plx-4720)、pdgfr-α抑制剂(例如，抗pdgfr-α抗体)、pdgfr-β抑制剂(例如，抗pdgfr-β抗体)、vegf拮抗剂(例如，vegf-陷阱，参见，例如，us 7,087,411(本文也称为“vegf抑制性融合蛋白”)、抗egfr抗体(例如，贝伐单抗)、vegf受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼))、dll4拮抗剂(例如，us 2009/0142354中公开的抗dll4抗体，诸如regn421)、ang2拮抗剂(例如，us 2011/0027286中公开的抗ang2抗体，诸如h1h685p)、folh1(psma)拮抗剂、prlr拮抗剂(例如，抗prlr抗体)、steap1或steap2拮抗剂(例如，抗steap1抗体或抗steap2抗体)、tmprss2拮抗剂(例如，抗tmprss2抗体)、msln拮
抗剂(例如，抗msln抗体)、ca9拮抗剂(例如，抗ca9抗体)、尿溶蛋白拮抗剂(例如，抗尿溶蛋白抗体)等。可以与本文提供的组合物组合有利地施用的其他药剂包括细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂和结合至细胞因子或它们各自的受体的抗体，所述细胞因子诸如il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-8、il-9、il-11、il-12、il-13、il-17、il-18。本文所用的药物组合物(例如，包含如本文公开的抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子的药物组合物)也可以作为治疗方案的一部分施用，所述治疗方案包含抗4-1bb激动剂和一个或多个选自以下的治疗组合：“ice”：异环磷酰胺(例如，)、卡铂(例如，)、依托泊苷(例如，泊苷(例如，vp-16)；“dhap”：地塞米松(例如，)、阿糖胞苷(例如，cytosar-胞嘧啶阿拉伯糖苷、ara-c)、顺铂(例如，-aq)；和“eshap”：依托泊苷(例如，vp-16)、甲基泼尼松龙(例如，)、高剂量阿糖胞苷、顺铂(例如，-aq)。
[0258]
本公开还包括治疗组合，所述治疗组合包含本文提及的任何抗原结合分子和以下一者或多者的抑制剂：vegf、ang2、dll4、egfr、erbb2、erbb3、erbb4、egfrviii、cmet、igf1r、b-raf、pdgfr-α、pdgfr-β、prlr、steap1、steap2、tmprss2、msln、ca9、尿溶蛋白或任何上述细胞因子，其中所述抑制剂是适体、反义分子、核酶、sirna、肽体、纳米抗体或抗体片段(例如，fab片段；f(ab')2片段；fd片段；fv片段；scfv；dab片段；或其他经工程化的分子，诸如双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体和最小识别单位)。本文公开的抗原结合分子还可以与抗病毒剂、抗生素、镇痛剂、皮质类固醇和/或nsaid组合施用和/或共同配制。本文公开的抗原结合分子还可以作为另外包含放射治疗和/或常规化疗的治疗方案的一部分施用。
[0259]
一种或多种另外的治疗活性组分可以在本文所用的抗原结合分子的施用之前、同步或之后立即施用；(出于本公开的目的，这种施用方案被视为抗原结合分子与另外的治疗活性组分“组合”施用)。
[0260]
本公开包括药物组合物，其中本文所用的抗原结合分子与如本文别处所述的另外的治疗活性组分一起共同配制。
[0261]
施用方案
[0262]
根据本公开的某些实施方案，可以在限定的时间段内将多剂量的抗原结合分子(例如，抗psma抗体或抗cd3/抗psma双特异性抗原结合分子)施用于受试者。此外，可以在限定的时间段内将多剂量的抗4-1bb激动剂施用于受试者。根据该方面的方法包括向受试者顺序施用一剂或多剂每种治疗剂，即一剂或多剂抗原结合分子和一剂或多剂抗4-1bb激动剂。如本文所用，“按顺序施用”意指每个剂量的治疗剂(例如，抗原结合分子)在不同的时间点，例如在以预定间隔(例如，小时、日、周或月)分开的不同日施用于受试者。本公开包括这样的方法：所述方法包括将单一初始剂量的抗原结合分子(称为负荷剂量)，然后是一个或多个第二剂量的抗原结合分子，以及任选地随后是一个或多个第三剂量的抗原结合分子按顺序施用于患者。本公开包括这样的方法：所述方法包括将单一初始剂量的抗4-1bb激动剂(称为负荷剂量)，然后是一个或多个第二剂量的抗4-1bb激动剂，以及任选地随后是一个或多个第三剂量的抗4-1bb激动剂按顺序施用于患者。
[0263]
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指本文所用的抗原结合分子和/或抗4-1bb激动剂的施用的时间顺序。因此，"初始剂量"为在治疗方案的开始时施用的剂量
(也称为"基础剂量")；"二级剂量"为在初始剂量之后施用的剂量；并且"三级剂量"为在二级剂量之后施用的剂量。初始、第二和第三剂量都可以含有相同量的抗原结合分子(或抗4-1bb激动剂)，但是通常在施用频率方面可以彼此不同。然而，在某些实施方案中，在初始、第二和/或第三剂量中含有的抗原结合分子(或抗4-1bb激动剂)的量在治疗过程中彼此不同(例如，适当上调或下调)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时施用两个或更多个(例如，2、3、4或5个)剂量作为“负荷剂量”，接着以较低频率施用后续剂量(例如，“维持剂量”)。
[0264]
在本公开的一个示例性实施方案中，每个第二和/或第三剂量在紧接前一剂量之后1至26(例如，1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多)周施用。如本文所用，短语“紧接前一剂量”是指在多次施用的顺序中，抗原结合分子(或抗4-1bb激动剂)的剂量在顺序中紧接着的下一剂量施用之前施用于患者，而没有中间剂量。
[0265]
根据本公开的该方面的方法可以包括向患者施用任意数量的第二和/或第三剂量的抗4-1bb激动剂、抗psma抗体或特异性结合psma和cd3的双特异性抗原结合分子。举例来说，在某些实施方案中，仅向患者施用单次二级剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)二级剂量。同样，在某些实施方案中，仅向患者施用单次三级剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)三级剂量。
[0266]
在涉及多个第二剂量的实施方案中，每个第二剂量可以与其他第二剂量相同的频率施用。例如，可以在紧接前一剂量之后1至2周向患者施用每个第二剂量。类似地，在涉及多个第三剂量的实施方案中，每个第三剂量可以与其他第三剂量相同的频率施用。例如，可以在紧接前一剂量之后2至4周向患者施用每个第三剂量。或者，在治疗方案的过程中，向患者施用的第二和/或第三剂量的频率可以变化。在治疗过程中，医生也可以根据临床检查后个别患者的需要来调整施用频率。
[0267]
抗体的诊断用途
[0268]
本公开的双特异性抗体也可以用于检测和/或测量样品中的psma或表达psma的细胞，例如用于诊断目的。例如，抗psma抗体或其片段可以用于诊断以psma的异常表达(例如，过表达、表达不足、表达缺乏等)为特征的病症或疾病。psma的示例性诊断测定法可以包括例如使从患者获得的样品与抗psmaxcd3双特异性抗体接触，其中所述双特异性抗体用可检测标记或报告分子标记。或者，未标记的抗psmaxcd3双特异性抗体可以与本身被可检测标记的二抗组合用于诊断应用。可检测标记或报告分子可以是放射性同位素，诸如3h、
14
c、
32
p、
35
s或
125
i；荧光或化学发光部分，诸如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或者酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。本文所用的抗psmaxcd3双特异性抗体的另一个示例性诊断用途包括
89
zr标记的(诸如
89
zr-去铁敏标记的)抗体，该抗体用于非侵入性识别和跟踪受试者中的肿瘤细胞(例如，正电子发射断层扫描(pet)成像)的目的。(参见，例如，tavare,r.等人cancer res.2016年1月1日；76(1):73-82；和azad,bb.等人oncotarget.2016年3月15日；7(11):12344-58。)可以用于检测或测量样品中的psma的具体示例性测定法包括酶联免疫吸附测定法(elisa)、放射免疫测定法(ria)和荧光活化细胞分选(facs)。
[0269]
可以用于根据本公开的psma诊断测定法的样品包括在正常或病理条件下可从患者获得的任何组织或流体样品，所述样品含有可检测数量的psma蛋白或其片段。通常，将对从健康患者(例如，不患有与异常psma水平或活性相关联的疾病或病症的患者)获得的特定样品中的psma水平进行测量，以初步建立基线或标准psma水平。然后可以将该psma的基线水平与在从怀疑患有psma相关疾病(例如，含有表达psma细胞的肿瘤)或病症的个体获得的样品中测量的psma水平进行比较。
[0270]
实施例
[0271]
提供以下实施例是为了向本领域的普通技术人员提供完整公开内容和描述如何制备和使用本文所用的方法和组合物，而非旨在限制发明人所认为的其发明的范围。已努力确保有关所用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑某些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是按摄氏度计并且压力是大气压或接近大气压。
[0272]
实施例1：结合前列腺特异性膜抗原(psma)和cd3的双特异性抗体的产生
[0273]
本公开提供了根据本文公开的方法使用的抗psma抗体。根据us 10,179,819中提供的公开内容产生抗体。本文所用的示例性抗体包括h1h11810p抗体，以及该抗体包含的cdr、hcvr和lcvr序列。因此，示例性抗psma抗体或其抗原结合片段包含如us 10,179,819所公开的seq id no:66的hcvr和seq id no:1386的lcvr。
[0274]
本公开还提供结合cd3和前列腺特异性膜抗原(psma)的双特异性抗原结合分子；这种双特异性抗原结合分子在本文中也称为“抗psma/抗cd3双特异性分子”。抗psma/抗cd3双特异性分子的抗psma部分可用于靶向表达psma的肿瘤细胞，而双特异性分子的抗cd3部分可用于活化t细胞。psma结合在肿瘤细胞上和cd3结合在t细胞上促进了活化的t细胞对被靶向的肿瘤细胞的定向杀死(细胞裂解)。
[0275]
使用标准方法构建包含抗psma特异性结合结构域和抗cd3特异性结合结构域的双特异性抗体，其中抗psma抗原结合结构域和抗cd3抗原结合结构域各自包含不同的、独特的hcvr对与共同lcvr。在一些情况下，双特异性抗体利用来自抗cd3抗体的重链、来自抗psma抗体的重链和共同轻链来构建。在其他情况下，双特异性抗体利用来自抗cd3抗体的重链、来自抗psma抗体的重链和来自抗cd3抗体的轻链来构建。在一些情况下，双特异性抗体利用来自抗cd3抗体的hcvr、来自抗psma抗体的hcvr和共同lcvr来构建。在其他情况下，双特异性抗体利用来自抗cd3抗体的hcvr、来自抗psma抗体的hcvr和来自抗cd3抗体的lcvr来构建。
[0276]
示例性抗psmaxcd3双特异性抗体构建体的组成部分汇总如表1所示。
[0277]
表1：抗psmaxcd3双特异性抗原结合分子
[0278][0279]
实施例2：通过4-1bb共刺激增强靶向psma的cd3双特异性抗体诱导的抗肿瘤反应
[0280]
靶标前列腺癌肿瘤抗原psma的psmaxcd3双特异性抗体在几个临床前实体瘤模型中进行了评估。开发了cd3和psma的人源化小鼠，以检查在存在完整免疫系统和正常组织中
的psma表达的情况下的抗肿瘤功效。免疫pet成像表明psmaxcd3在表达psma的组织和肿瘤中积聚，这与显著的抗肿瘤功效相关。然而，随着肿瘤负荷的增加，psmaxcd3失去功效。为了加强肿瘤负荷较高的小鼠的疗效，psmaxcd3与抗4-1bb(来自invivoplus的抗小鼠4-1bb、同种型大鼠igg1，产品目录号bp0169)组合共刺激实现了令人印象深刻的t细胞活化、细胞因子产生、增殖和记忆，从而导致增强的功效和持久的抗肿瘤反应。本实施例展示了cd3双特异性抗体与抗4-1bb共刺激组合是针对实体瘤的可行治疗组合。
[0281]
在本实施例的所有研究中，使用具有无关靶向臂的cd3双特异性抗体(cd3结合对照)作为对照。在异种和同种小鼠模型中评估了体内功效。在异种模型中，nsg小鼠移植有人pbmc和c4-2或22rv1细胞(样品量：每组5只小鼠)。对于同种模型(样品量：每组5-10只小鼠)，hut小鼠移植有tramp-c2-hpsma细胞。所有动物研究均按照nih实验室动物护理和使用指南进行。
[0282]
psmaxcd3诱导靶标依赖性t细胞活化和肿瘤细胞毒性
[0283]
psmaxcd3双特异性抗原结合分子通过用人psma和cd3免疫小鼠来产生。所得的psmaxcd3双特异性抗体是铰链稳定的、效应子最小化的igg4同种型。
[0284]
流式细胞分析用于确定psmaxcd3与jurkat和预活化的人t细胞的结合，然后用pe-抗人igg抗体进行检测。人t细胞用抗cd3/cd28预活化6天。在活化后，将2
×
105个活化的人t细胞或jurkat细胞/孔在4℃下与10μg/ml psmaxcd3一起温育30分钟。在温育后，将细胞用冷pbs(1％fbs)洗涤两次。在洗涤后，将pe-抗人二抗添加至细胞中，并且再温育30分钟。不含抗体或仅含二抗的孔用作对照。在温育后，通过流式细胞术在bd facs canto ii上分析细胞。
[0285]
流式细胞分析还用于确定psmaxcd3与表达psma的细胞系的结合。将c4-2、22rv1或tramp-c2-hpsma细胞(2
×
106个细胞/孔)与psmaxcd3(10μg/ml)一起在4℃下温育15分钟。在温育后，将细胞用冷pbs(2％fbs)洗涤两次，并且在冰上再添加apc-抗人二抗20分钟。未染色或仅二抗染色作为对照包括在内。在bd lsrfortessa细胞分析仪上分析样品。
[0286]
简而言之，将表达psma的细胞系(22rv1和c4-2细胞)用1μm紫色细胞示踪物标记，并且在37℃下铺板过夜。另外，将人pbmc以1
×
106个细胞/ml铺板在补充rpmi培养基中，并且在37℃下温育过夜，以通过消耗贴壁巨噬细胞、树突细胞和一些单核细胞来富集淋巴细胞。第二天，将靶细胞与贴壁细胞耗尽的初始pbmc(效/靶细胞4:1)和系列稀释的psmaxcd3或cd3结合对照在37℃下共同温育48小时。使用无酶解离缓冲液从培养板移除细胞，通过流式细胞术进行分析。对于facs分析，细胞用死/活远红细胞示踪物(invitrogen)染色。为了评估杀死的特异性，在紫色细胞示踪物标记的群体上对细胞进行门控。用于计算调整存活率的活靶细胞百分比报告如下：调整存活率＝(r1/r2)*100，其中r1＝存在抗体时的％活靶细胞，r2＝不存在测试抗体时的％活靶细胞。通过将细胞与cd2、cd69和cd25的直接缀合抗体一起温育，并且报告活化的(cd69 )t细胞或(cd25 )t细胞占总t细胞(cd2 )的百分比来评估t细胞活化。
[0287]
流式细胞分析表明psmaxcd3与jurkat t细胞和人pbmc上的cd3特异性结合(图1a)。此外，psmaxcd3与表达不同水平psma的人肿瘤细胞系22rv1和c4-2特异性结合，这表明psmaxcd3可以与低表达和高表达抗原的细胞系结合(图1b)。为了评估psmaxcd3的细胞毒性潜力，进行了基于体外流式细胞术的细胞杀死测定法。psmaxcd3诱导杀死22rv1(ec50 1.79
×
10-11
)和c4-2(ec50 2.23
×
10-11
)细胞，而cd3结合对照则不能诱导(图1c)。响应于psmaxcd3，t细胞上的早期活化标志物cd69(图1d)和晚期活化标志物cd25(图1e)升高。当t细胞与c4-2或22rv1肿瘤细胞一起温育时，psmaxcd3还诱导细胞因子释放(ifnγ和tnfα)(图1f、g)。
[0288]
总之，这些结果表明psmaxcd3能够诱导靶标依赖性、cd3介导的t细胞活化，从而杀死表达psma的肿瘤细胞。
[0289]
psmaxcd3抑制异种肿瘤模型中的人前列腺癌细胞的生长
[0290]
使用22rv1和c4-2人肿瘤细胞系建立了两种皮下肿瘤异种移植小鼠模型。在肿瘤移植时，人pbmc作为人cd3t细胞的来源被递送至nsg小鼠中，并且立即用cd3结合对照或psmaxcd3治疗小鼠。移植有22rv1肿瘤细胞的小鼠在0.1mg/kg和1mg/kg psmaxcd3下显示出肿瘤生长抑制(图2a)，而移植有c4-2肿瘤细胞的小鼠则在低至0.01mg/kg psmaxcd3下显示出显著的肿瘤生长抑制(图2b)。
[0291]
同种肿瘤研究
[0292]
使用技术在经遗传修饰以表达人cd3和人psma的一部分的小鼠中进行同种研究。给小鼠(5-7只/组，8-16周龄)皮下(sc)注射5
×
106个tramp-c2-hpsma细胞。每周两次给予小鼠5mg/kg psmaxcd3或cd3结合对照，共进行4次治疗。使用卡尺来测量肿瘤生长。基于卡尺测量的肿瘤体积通过以下公式计算：体积＝(长
×
宽2)/2。对于使用psmaxcd3 抗4-1bb(lob12.3,bioxcell)的研究，cd3结合对照组用大鼠igg同种型对照处理，抗4-1bb组用cd3结合对照处理。对于肿瘤记忆研究，响应于治疗而清除肿瘤的小鼠在肿瘤注射后35天在另一侧用1
×
107个tramp-c2-hpsma细胞再次挑战。
[0293]
免疫缀合物和小动物pet的制备
[0294]
使用预先校准的sofie biosciences g8 pet/ct仪器(sofie biosciences(culver city,ca)和perkin elmer)来获取pet和ct图像。能量窗在150到650kev的范围内，视野中心处的重建分辨率为1.4mm。在给药后第6天，小鼠使用异氟醚进行诱导麻醉，并且在10分钟静态pet采集和随后ct采集期间保持在异氟醚的连续流下。衰减校正的pet数据和ct数据使用vivoquant软件(invicro imaging services)在色阶上处理成伪彩色配准的pet-ct最大强度投影，以表示每体积注射剂量的0至15％的信号范围(以％id/g表示)。对于离体生物分布分析，在pet/ct采集后对小鼠实施安乐死。然后收获血液、正常组织和肿瘤并放入计数管中。然后在自动伽马计数器(amg,hidex)上计算所有样品的γ发射放射性，并且以每分钟的归一化计数(cpm)报告结果。每个样品的％id使用样品计数相对于从原始注射材料制备的剂量标准计数来确定。随后，通过用％id值除以适当的血液、组织或肿瘤样品的各自重量得到单个％id/g值。
[0295]
免疫pet成像展示了psmaxcd3在hut小鼠中的体内生物分布
[0296]
异种模型使用缺乏成熟b、t和nk细胞的免疫缺陷小鼠。为了检查psmaxcd3在免疫健全小鼠模型中的功效，我们通过基因工程改造的人靶标小鼠(hut)通过缺失小鼠序列并将其替换为人cd3和psma的直系同源区来表达人psma和cd3。在脊髓、大脑、肝、肾、睾丸和唾液腺中检测到人psma转录物表达，而在前列腺中存在的表达可忽略不计(图3a)。另外，psma蛋白表达也通过免疫组织化学得到证实，并且显示出相似的表达模式(数据未示出；skokos等人，已提交)。为了确定psma抗原的体内生物利用度和psmaxcd3在hut小鼠中的分布，使用
免疫pet(ipet)成像来跟踪抗体定位。hut小鼠注射有
89
zr-抗psma(用于产生psmaxcd3的二价抗体)、
89
zr-psmaxcd3或
89
zr-cd3结合对照，以评估组织分布。在注射有
89
zr-cd3结合对照的小鼠中无特异性靶向。注射有
89
zr-抗psma的小鼠在肝、肾、附睾、泪腺、唾液腺和引流淋巴结中显示出特异性摄取。值得注意的是，大脑和睾丸被鉴定为表达psma的组织，然而，ipet可能由于血脑屏障和抗原不可及性而显示出无靶向性。注射有
89
zr-psmaxcd3的小鼠显示出与二价
89
zr-抗psma相似的分布特征，除了肾摄取减少和脾摄取增加之外，这表明psmaxcd3的分布主要是由于psma结合臂(图3b和3c)。为了证实这一点，研究了单独或除psma之外的cd3人源化小鼠中的血清药物浓度的清除。虽然hut(cd3)小鼠的血清药物浓度与wt小鼠相似，但是hut(psma和cd3)小鼠在血清中显示出更快的药物清除(图3d)。
[0297]
最后，根据t细胞受体(tcr)vβ的使用情况，这些小鼠的人源化不会改变脾cd8和cd4 t细胞的多克隆发育。与wt小鼠相比，hut小鼠也具有相似的t细胞总数和cd4、cd8和调节t细胞(treg)的相对比例。(数据未示出，crawford等人,sci.transl.med.11,eaau7534(2019))
[0298]
总之，这些数据表明psmaxcd3分布是由psma结合臂驱动的，并且在我们的hut小鼠中定位以选择表达抗原的组织。
[0299]
psmaxcd3对hut小鼠中已建立的小肿瘤有效
[0300]
给hut小鼠皮下移植表达人psma的小鼠前列腺腺癌细胞系(tramp-c2-hpsma)。与接受cd3结合对照的小鼠相比，在肿瘤移植当天开始的psmaxcd3治疗完全阻止了肿瘤生长(图4a)。当肿瘤为大约50mm3时开始的psmaxcd3治疗(图4b)也显示出显著的抗肿瘤功效。然而，虽然这些治疗方案诱导了显著的功效，但是当治疗延迟到肿瘤为大约200mm3时，抗肿瘤功效减弱，这展示出短暂而瞬时的抗肿瘤反应(图4c)。流式细胞术证实，在tramp-c2-hpsma肿瘤上仍保持psma靶标表达，这表明功效缺乏并非是由于靶标的缺乏。此外，即使维持了psma靶标表达，20mg/kg的高剂量psmaxcd3仍不足以控制200mm3肿瘤(数据未示出)。
[0301]
无论大小如何，psmaxcd3都靶向肿瘤，但是功效仅限于较小的肿瘤
[0302]
为了确定抗肿瘤功效是由局部肿瘤环境还是小鼠的总肿瘤负荷确定的，建立了双侧肿瘤模型，以使每只小鼠的两侧都有一个小的和大的肿瘤。给hut小鼠皮下(sc)注射1
×
107个(左侧)和1.25
×
106个(右侧)tramp-c2-hpsma细胞。在第12天，当肿瘤测量值为大约150mm3(左侧)和50mm3(右侧)时，给予小鼠5mg/kg psmaxcd3或cd3结合对照每周两次，共进行4次治疗。
[0303]
虽然psmaxcd3能够延迟较小肿瘤的肿瘤进展(图5a)，但是它对同一动物另一侧的较大的肿瘤无影响(图5b)。这些发现表明psmaxcd3功效由肿瘤内在因素确定，而不是由总肿瘤负荷或全身性t细胞功能障碍确定。随后，为了确定psmaxcd3是否可以穿透大肿瘤，将
89
zr-psmaxcd3或
89
zr-cd3结合对照注射至携带双侧肿瘤的hut小鼠中。注射的小鼠在外周组织和肿瘤中显示出
89
zr-psmaxcd3的特异性摄取。相比之下，小鼠在肿瘤或组织中未显示出对
89
zr-cd3结合对照的特异性摄取。此外，离体生物分布分析证实，小肿瘤和大肿瘤之间对psmaxcd3的摄取相似，因此反应的缺乏并不是由于psmaxcd3靶向的缺乏(图5c和5d)。
[0304]
离体流式细胞术：
[0305]
流式细胞术用于检测循环中的t细胞，以及检查处理后48小时或96小时的瘤内t细胞的活化状态，或检查肿瘤细胞上的psma靶标的维持情况。在胶原蛋白酶ii(175个单位/
ml；worthington)、胶原蛋白酶iv(200个单位/ml；gibco)和dna酶1(400个单位/ml；sigma)存在下，在42℃下机械破碎和消化肿瘤9分钟。然后使消化的材料通过细胞过滤器。为了检测t细胞，使用cd45(30-f11,biolegend)、cd90.2(30-h12,biolegend)、cd8(53-6.7bd pharmingen)、cd4(gk1.5,bd pharmingen)和foxp3(fjk-165,ebiosciences)的组合。使用针对粒酶b(gb11,bdpharmingen)、ki67(16a8,biolegend)和4-1bb(iah2,bd pharmingen)的抗体检查t细胞活化。使用ebioscience foxp3染色缓冲液组进行染色。t细胞被鉴定为cd45 、cd90.2 、cd8 、cd4 或cd4 foxp3 。
[0306]
psmaxcd3诱导小肿瘤和大肿瘤中的t细胞浸润和活化
[0307]
为了评估瘤内t细胞的频率和空间分布，通过免疫组织化学分析肿瘤。使用ventana discovery xt(ventana；tucson,az)通过ihc采用抗psma(erp6253,abcam)、抗cd3(a045229,dako)、抗cd4(ab183685,abcam)、抗cd8(4sm15,ebiosciences)和抗foxp3(12653,cellsignaling technologies)对组织或肿瘤的5μm石蜡切片进行染色。使用ventana dab map检测试剂盒在discovery xt自动化ihc染色系统上进行免疫组织化学染色。载玻片用苏木精手动复染(2分钟)、脱水并盖上盖玻片。在aperio at 2载玻片扫描仪(leica biosystems；buffalo grove,il)上获取图像并使用indica halo软件(indica labs；corrales,nm)进行分析。h&e染色由histoserv,inc(germantown,md,usa)进行。
[0308]
小肿瘤和大肿瘤在未治疗的基线处均被cd4 和cd8 t细胞浸润。然后在用psmaxcd3或cd3结合对照处理后检查肿瘤。psmaxcd3处理促进了50mm3和200mm3肿瘤中cd8 t细胞频率的增加。相比之下，对cd4 t细胞的频率无显著影响。另外，foxp3 免疫抑制性treg细胞频率在所有组中相似(数据未示出)。由于t细胞存在于小肿瘤和大肿瘤中，因此确定了这些t细胞在给予psmaxcd3或cd3结合对照后的活性。
[0309]
流式细胞分析确定，在psmaxcd3处理后，小肿瘤和大肿瘤中的cd8 和cd4 t细胞使细胞裂解标志物粒酶b和增殖标志物ki67上调(数据未示出)。另外，在psmaxcd3施用后检测ifn-γ、il-2和tnf-α的血清细胞因子浓度，以指示t细胞活化。用psmaxcd3治疗的携带肿瘤的hut小鼠在4小时诱导全身性细胞因子产生，然而，在72小时细胞因子释放恢复到基线浓度，这表明t细胞应答是强烈而瞬时的(数据未示出)。相比之下，psmaxcd3与抗4-1bb组合导致治疗后96小时细胞因子释放增加，这表明t细胞应答是持久的。这些结果表明，虽然初始反应可以足以消除较小的肿瘤，这些肿瘤在48小时内已经缩小，但是t细胞无法克服快速生长的大肿瘤。因此，大肿瘤的抗肿瘤反应可能需要另外的共刺激来促进肿瘤特异性t细胞的增殖和扩增。
[0310]
具有4-1bb共刺激的psmaxcd3对较大的肿瘤非常有效
[0311]
研究来自较大肿瘤的t细胞的4-1bb表达。流式细胞分析表明，psmaxcd3诱导活化依赖性4-1bb表面表达，该表达仅限于瘤内t细胞，因为在脾t细胞上未观察到表达(图6a)。接下来确定4-1bb通路的共刺激是否可以增加肿瘤负荷较高的小鼠的抗肿瘤功效。虽然单独的psmaxcd3或抗4-1bb显示出一定的肿瘤生长延迟，但是用单剂量的psmaxcd3与抗4-1bb组合治疗的小鼠产生了惊人的抗肿瘤功效(图6b)并在第60天完全清除了50-60％的肿瘤(图6c)。值得注意的是，当给予更高剂量的psmaxcd3与抗4-1bb组合时，接受psmaxcd3与抗4-1bb组合的小鼠确实经历了瞬时的体重减轻。这种瞬时的体重减轻可以通过将psmaxcd3的剂量从5mg/kg降低至1mg/kg与抗4-1bb组合来减轻，而不影响总体抗肿瘤功效(数据未示
出)。此外，用psmaxcd3与抗4-1bb组合治疗的小鼠显示出traf1衔接蛋白的转录表达升高，这对于4-1bb诱导的活化通路以及存活基因bcl2、bcl-xl(bcl2l1)和bfl-1(bcl2a1a)的上调是至关重要的(图6d)。
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psmaxcd3与4-1bb共刺激可增加cd8 t细胞的扩增并延长存活期
[0313]
评估了作为t细胞活化指标的血清细胞因子释放，并且用psmaxcd3与抗4-1bb组合治疗的小鼠即使在治疗后96小时也显示出增强和持续的细胞因子诱导，而用单独的psmaxcd3治疗的小鼠的细胞因子浓度已恢复至基线水平(数据未示出)。由于存活基因通过4-1bb通路上调，因此研究了治疗后96小时肿瘤浸润的cd8和cd4 t细胞。实际上，与单独的cd3结合对照、抗4-1bb或psmaxcd3相比，在用组合疗法处理的小鼠中观察到cd8 t细胞区室的显著扩张(图7a)。此外，psmaxcd3与抗4-1bb组合提高了粒酶b (数据未示出)和ki67 (数据未示出)cd8 t细胞的比例和总计数，这表明组合疗法诱导了具有细胞毒性活性和持续增殖能力的肿瘤浸润性t细胞的扩增。虽然不同治疗组的treg细胞的总数相似，但是cd8与treg的比率由于接受组合疗法的小鼠的cd8 tt细胞扩增而显著增加(数据未示出)。使在另一侧用tramp-c2-hpsma细胞清除大肿瘤的小鼠经受再次挑战。与未暴露的小鼠相比，接受组合疗法的小鼠能够控制继发性肿瘤挑战，这表示肿瘤特异性免疫记忆的产生(图7b和表2)。
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表2：肿瘤特异性免疫记忆
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初始研究的治疗组无肿瘤小鼠/总数此前未参与研究的未暴露的对照小鼠1/17此前用psmaxcd3 抗4-1bb治疗的小鼠15/15
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总之，数据表明，虽然psmaxcd3能够在短期内诱导t细胞的活化、细胞因子产生和增殖，但是即使在已建立的肿瘤中，与抗小鼠4-1bb的组合也可以延长和增强这些作用，以实现抗肿瘤功效。此外，用psmaxcd3或psmaxcd3 抗4-1bb治疗的小鼠免受继发性肿瘤挑战的影响。
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结论：
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靶向肿瘤抗原psma(psmaxcd3)的cd3双特异性抗体在多个小鼠模型中显示出临床前功效。psmaxcd3与抗4-1bb组合可以实现持久的抗肿瘤活性，从而使小鼠长期存活，这表明共刺激可以增强cd3双特异性抗体对晚期实体瘤的效力。
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本发明在范围上不受本文所述的具体实施方案的限制。事实上，除本文所述的那些之外，本发明的各种修改根据前文描述书对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改旨在落在所附权利要求书的范围内。