用于治疗乙型肝炎病毒感染的组合物和方法与流程

1.本公开内容总体涉及秋水仙碱或其衍生物与cyp3a4/p-gp抑制剂联合用于治疗乙型肝炎病毒（hbv）感染的用途。具体地，本公开涉及包含秋水仙碱或其衍生物和cyp3a4/p-gp抑制剂的药物组合物、使用秋水仙碱或其衍生物联合cyp3a4/p-gp抑制剂治疗hbv感染的方法以及包含秋水仙碱或其衍生物和cyp3a4/p-gp抑制剂的药盒。


背景技术：

2.秋水仙碱是一种植物生物碱。它可有效对抗痛风性关节炎和其它形式的风湿性疾病，如类风湿性关节炎、家族性地中海热和白塞病。秋水仙碱抑制粒细胞迁移到炎症区域并抑制粒细胞的代谢和吞噬活性。此外，秋水仙碱具有抗有丝分裂和抗纤维化活性。秋水仙碱也延缓微管介导的前胶原运输并增强胶原酶活性。
3.此外，发现秋水仙碱可减少四氯化碳诱导的肝硬化大鼠体内的肝纤维化。几项随机化临床试验解决了秋水仙碱在患有酒精性或非酒精性纤维化和肝硬化的患者中是否具有任何效力的问题。尽管其中一些研究发现秋水仙碱具有一定程度上降低死亡率的效力，但大多数结果是阴性的。
4.目前秋水仙碱主要用于治疗hbv感染。初步研究及后续的一项双中心试验评估了秋水仙碱治疗慢性乙型肝炎的疗效。在这两项临床试验中，秋水仙碱通过口服给药，每天1 mg，每周5天，持续6个月。结果显示秋水仙碱具备抗病毒活性，但缓解率较低（初步研究中7名对象中有3人治疗无效；双中心试验中，6名治疗患者中4人（66.6%）达到持续缓解，6名未治疗患者中则为2人（33.3%））。参见floreani, a, et al. "colchicine in chronic hepatitis b: a pilot study. " alimentary pharmacology & therapeutics12.7(1998):653
–
656以及floreani, a. . "preliminary results of a two-center trial with colchicine for the treatment of chronic hepatitis b." the american journal of gastroenterology 96.12(2001):3451-3452。另一项报道为在100名患乙型肝炎病毒相关肝硬化的患者的大型群体中进行秋水仙碱的双盲对照试验（wang, y. j, et al. "a double-blind randomized controlled trial of colchicine in patients with hepatitis b virus-related postnecrotic cirrhosis." journal of hepatology 21.5(1994):872-7）。该报道表明秋水仙碱对hbv相关坏死后肝硬化中没有治疗作用。该报道进一步讨论称，对于主要的决定因素为病毒复制的hbv相关肝硬化而言，除非使用抗病毒或抗纤维化药物进行早期治疗，否则疾病的进展可能是不可避免的。
5.乙型肝炎病毒（hbv）是一种非致细胞病变的嗜肝dna病毒，在全世界有超3.5亿人患其慢性感染。慢性hbv感染是由于宿主未能产生足够的免疫应答以清除该病毒。hbv感染的结果和发病机理主要由宿主抗病毒免疫应答的性质和强度决定，而免疫应答通常与受感染时的年龄相关。尽管超过95%的成人获得性感染在6个月内通过高效的多克隆hbv特异性t细胞应答自发清除，但超过90%的受感染新生儿和大约30%的1
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5岁儿童则会患慢性感染，这与较弱的和通常几乎检测不到的病毒特异性t细胞应答相关。
6.hbv的基因组由环状dna组成，但不寻常的是，这种dna并非完全双链的。全长链的一端连接到病毒dna聚合酶。基因组的长度为3020
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3320个核苷酸（全长链）和1700
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2800个核苷酸（短链）。反义（非编码）链与病毒mrna互补。在细胞感染后不久，细胞核内即可发现病毒dna。已知该基因组编码四个基因，分别为c、x、p和s。核心蛋白（hbcag）由基因c编码，并且其起始密码子之前是上游的生产前核心蛋白的框内aug起始密码子。hbeag是由前核心蛋白通过蛋白水解加工而成。dna聚合酶由基因p编码。基因s是编码表面抗原（hbsag）的基因。hbsag基因是一个较长的开放阅读框，但包含三个框内“起始”（atg）密码子，将基因分为三个部分，前s1、前s2和s。由于存在多个起始密码子，产生了三种不同大小的多肽，称为大、中和小。基因x编码的蛋白质功能还不完全清楚，但与肝癌的发病有关。hbv的复制是一个复杂的过程。尽管复制发生在肝脏中，但病毒会扩散到血液，因而可在感染者的血液中发现病毒蛋白和针对它们的抗体。
7.乙型肝炎病毒颗粒（有时称为病毒体）包括外部的脂质包膜和由蛋白质组成的二十面体核衣壳核心。核衣壳包裹病毒dna和具有逆转录酶活性的dna聚合酶。外包膜含有包埋的蛋白质，这些蛋白质参与病毒结合和进入易感细胞（通常为肝细胞）。除了感染性病毒颗粒之外，在感染个体的血清中可以发现缺乏核心的丝状和球形体。这些颗粒是非感染性的，由形成病毒粒子表面的一部分的脂质和蛋白质组成，并且在病毒的生命周期期间过量胜场。
8.长期核苷酸类似物治疗或通过有限持续时间的聚乙二醇化α干扰素（ifn-α）治疗可持续抑制病毒复制，从而改善肝病、预防肝失代偿并降低肝细胞癌发病率和死亡率。然而，hbv表面抗原（hbsag）的血清转化作为对hbv的成功免疫应答以及完全且持久的感染控制或“功能性治愈”的标志，以目前的疗法很少能实现。
9.急性乙型肝炎感染通常不需要治疗，大多数成年人可自发清除感染。少于1%的人由于其感染过程非常剧烈（暴发性肝炎）或免疫受损，可能需要早期抗病毒治疗。另一方面，慢性感染的治疗对于降低肝硬化和肝癌的风险可能是必要的。血清谷丙转氨酶（肝损伤的标志物）长期偏高和体内有hbv dna的慢性感染个体是治疗的候选者。治疗持续六个月至一年，取决于治疗方式和基因型。然而，如果经口服给药，则治疗持续时间变化更大，且通常高于一年。
10.尽管尚无药物可清除感染，但是可以阻止病毒复制，从而减少肝损伤。截至2018年，美国已许可八种药物用于治疗乙型肝炎感染。这些药物包括抗病毒药物拉米夫定、阿德福韦、替诺福韦二吡呋酯、丙酚替诺福韦、替比夫定和恩替卡韦，以及两种免疫系统调节剂干扰素α-2a和聚乙二醇化干扰素α-2a。2015年，世界卫生组织推荐替诺福韦或恩替卡韦作为一线药物。目前肝硬化患者仍急需治疗。


技术实现要素：

11.本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物包含特定量的秋水仙碱或其药学上可接受的盐，和药代动力学上有效量的cyp3a4/p-gp抑制剂。在一些实施方案中，cyp3a4/p-gp抑制剂以将秋水仙碱的峰浓度（c
max
）增加约30%至约500%的量存在。在一些实施方案中，cyp3a4/p-gp抑制剂以将秋水仙碱的峰浓度（c
max
）增加约50%至约200%的量存在。
12.在一些实施方案中，秋水仙碱的量为约0.6 mg至约2.0 mg。在一些实施方案中，秋
水仙碱的量为约0.6 mg至约1.2 mg。在一些实施方案中，秋水仙碱的量为约1.0 mg。
13.在一些实施方案中，cyp3a4/p-gp抑制剂选自利托那韦、克拉霉素、1-氨基苯并三唑、普罗地芬、氯霉素、酮康唑、伊曲康唑、可比司他、环孢霉素和维拉帕米。在一些实施方案中，cyp3a4/p-gp抑制剂是利托那韦、1-氨基苯并三唑、普罗地芬或可比司他。
14.在一些实施方案中，施用该药物组合物以获得约20 nm至约60 nm的秋水仙碱的峰浓度（c
max
）。在一些实施方案中，施用该药物组合物以获得约30 nm至约40 nm的秋水仙碱的峰浓度（c
max
）。
15.本公开还提供了一种用于治疗对象中的乙型肝炎病毒感染的药盒，该药盒包含第一药物组合物和第二药物组合物，第一药物组合物包含特定量的秋水仙碱，第二药物组合物包含药代动力学上有效量的cyp3a4/p-gp抑制剂。
16.本公开的另一方面提供了一种治疗对象中hbv感染的方法，包括向有需要的对象施用特定量的秋水仙碱和药代动力学上有效量的cyp3a4/p-gp抑制剂，使得对象中秋水仙碱的峰浓度（c
max
）被有意地增加至预定水平。在一些实施方案中，秋水仙碱的c
max
增加约30%至约500%。
17.本公开的另一方面提供了一种在对象中增强秋水仙碱的抗hbv疗效以用于治疗hbv感染的方法，包括对对象共施用药代动力学上有效量的cyp3a4/p-gp抑制剂，使得对象中秋水仙碱的峰浓度（c
max
）被有意地增加至预定水平。在一些实施方案中，对象中秋水仙碱的c
max
增加约30%至约500%。在一些实施方案中，对象中秋水仙碱的c
max
被增加至约20 nm至约60 nm。
18.本领域的技术人员将从本发明的以下详细描述中显而易见地获得本公开的其他方面或优点。
附图说明
19.图1：秋水仙碱在hbv感染的pxb细胞中的体外有效性研究。所示为未处理（a1/a2）和用不同浓度的秋水仙碱处理（b1/b2：31.3 nm，c1/c2：125 nm，d1/d2：1000 nm）的hbv感染的pxb细胞的代表性显微图像。上图：放大40
×
，下图：放大100
×
）。
20.图2：治疗和非治疗期间体内实验的体重变化。g01：溶媒，10 ml/kg，po，qd，第0
–
41天，n=4；g02：秋水仙碱，1/2/5 mg/kg，po，qd，第0
–
41天，n=4；g03：秋水仙碱 利托那韦，1/2/5 mg/kg，po，qd，第0
–
41天，n=4。po=口服，qd = 一天一次。
21.图3：治疗和非治疗期间血清病毒标志物水平。（a）血清hbsag，（b）血清hbv-dna，对比g01，*p《0.05，**p《0.01，（c）血清hbeag，对比g01，*p《0.05。g01：溶媒，10 ml/kg，po，qd，第0
–
41天，n=4；g02：秋水仙碱，1/2/5 mg/kg，po，qd，第0
–
41天，n=4；g03：秋水仙碱 利托那韦，1/2/5 mg/kg，po，qd，第0
–
41天，n=4。po=口服，qd = 一天一次。
22.图4：治疗和非治疗期间血清alt和ast。（a）血清alt，（b）血清ast。g01：溶媒，10 ml/kg，po，qd，第0
–
27天，n=4；g02：秋水仙碱，1/2/5 mg/kg，po，qd，第0
–
27天，n=4；g03：秋水仙碱 利托那韦，1/2/5 mg/kg，po，qd，第0
–
27天，n=4。po=口服，qd=一天一次。
23.图5：使用aav-hbv模型确认不同治疗的有效性的体内实验。对照：溶媒，10 ml/kg，po，qd，n=3；秋水仙碱，3.3 mg/kg，po，qd，n=3；秋水仙碱 可比司他，po，qd，n=3；或秋水仙碱 1-氨基苯并三唑，po，qd，n=3，给药7天。之后测定病毒标志物，*p《0.05，**p《0.01，***p《
0.001。
24.图6：接受所示剂量的秋水仙碱以及秋水仙碱加上各cyp3a4/p-gp抑制剂的小鼠的体重变化。秋水仙碱，5 mg/kg（n=5）；秋水仙碱 可比司他，5 mg/kg 5 mg/kg（n=5）；秋水仙碱 普罗地芬，5 mg/kg 10 mg/kg（n=5）；秋水仙碱 利托那韦，5 mg/kg 10 mg/kg（n=5）；秋水仙碱 1-氨基苯并三唑（1-abt），5 mg/kg 50 mg/kg（n=5）。
具体实施方式
25.定义应当注意的是，术语“一”或“一个”实体是指该实体中的一个或多个实体；例如，“一种药学上可接受的盐”应理解为代表一种或多种药学上可接受的盐。因此，术语“一”（或“一个”）、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
26.如本文所用，术语“治疗”是指治疗性治疗以及预防性或防御性措施两者，其中目标是防止或减缓（减轻）不期望的生理变化或疾病，诸如癌症进展。有益或期望的临床结果包括但不限于可检测或不可检测的症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病的稳定（即，未恶化）状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及（部分或完全）缓解。“治疗”也可以指与未接受治疗时的预期生存期相比延长的生存期。需要治疗的个体包括已患有病症或疾病的个体以及易患病症或疾病的个体或者要预防病症或疾病的个体。在本发明中，术语“治疗”还指减少或消除表面抗原（hbsag）、核心抗原（hbcag）和/或e抗原（hbeag），或减少或消除乙型肝炎病毒dna的量，如通过本领域常用的血液样品测试所检测的。在本发明中，术语“治疗”也指根据本发明治疗的对象中的hbeag血清转化。
[0027]“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断、预后或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、驯化动物、农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。本文的对象优选是人。
[0028]
如本文所用，短语例如“有需要的对象”或“需要治疗的对象”包括将受益于施用秋水仙碱或本公开的组合物以用于例如检测、诊断程序和/或治疗的对象。
[0029]
如本文所用，术语“感染”是指病原体在细胞、组织或对象中侵入、增殖和/或存在。在一个实施方案中，感染是“活动性”感染，即病原体在细胞、组织或对象中复制的感染。这种感染的特征可以是病原体从最初被其感染的细胞、组织、器官和/或对象扩散到其它细胞、组织、器官和/或对象。感染也可以是潜伏性感染，即病原体不复制的感染。在一个实施方案中，感染是指由病原体在细胞、组织或对象中的存在或侵入细胞、组织或对象所引起的病理状态。
[0030]
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指秋水仙碱的衍生物，其中通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式来修饰秋水仙碱。药学上可接受的盐的示例包括但不限于碱性残基如胺的矿物或有机酸盐、酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐等。本发明的药学上可接受的盐包括由例如无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本发明的药学上可接受的盐可由秋水仙碱通过常规化学方法合成。通常，可通过使该化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当碱或酸在水中或有机溶剂中或两者的混合物中反应来制备此类盐。通常，优选的是非水介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。一个非限制性实例是水杨酸秋水仙碱。
mg）。药物动力学取样共持续96小时。单剂、低剂量和高剂量秋水仙碱的血液水平峰值（c
max
）分别为2.5、6.19和6.84 ng/ml。秋水仙碱暴露量（曲线下面积）分别为14.1、52.1和118.2 ng/h/ml。单剂、低剂量和高剂量秋水仙碱的终末半衰期分别为6.36、23.6和31.4小时（terkeltaub ra et al. high versus low dosing of oral colchicine for early acute gout flare: twenty-four-hour outcome of the first multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel-group, dose-comparison colchicine study. arthritis rheum 2010; 62:1060-8）。这些数据表明，低剂量和高剂量秋水仙碱方案在正常、健康志愿者中实现了约6 ng/ml的较高血液秋水仙碱峰浓度。
[0036]
秋水仙碱具有窄的治疗窗并且在用药过量时毒性极大。存在毒性风险的患者是具有肾或肝损伤、胃肠或心脏疾病的患者，以及处于极端年龄的患者。一项对150名秋水仙碱用药过量的患者的评估发现，摄入少于0.5 mg/kg的患者存活并通常具有较轻微的不良反应，例如胃肠道症状，而摄入0.5至0.8 mg/kg的患者则有较为严重的不良反应，包括骨髓抑制。摄入超过0.8 mg/kg的患者死亡率为100%。
[0037]
秋水仙碱衍生物为本领域已知。示例性的衍生物包括n-[(7s)-1,2,3-三甲氧基-9-氧代-10-[3-(三氟甲基)-4-氯苯基氨基]-5,6,7,9-四氢苯并[a]庚烯-7-基]乙酰胺、4-卤代秋水仙碱、硫代秋水仙碱以及以下文献中所述的任一种：majcher, u. et al. antiproliferative activity and molecular docking of novel double-modified colchicine derivatives. cells 2018, 7, 192以及baljinder singh et al. colchicine derivatives with potent anticancer activity and reduced p-glycoprotein induction liability. org. biomol. chem., 2015,13, 5674-5689。其它衍生物也是可用的。化学修饰技术是本领域技术人员可使用的。本公开预期秋水仙碱衍生物可与cyp3a4/p-gp抑制剂一起使用，以实现与本文所述相同或相似的结果，因此在本公开的范围内。
[0038]
cyp3a4/p-gp抑制剂细胞色素p450（cyp）是负责临床实践中使用的药物的氧化和还原代谢转化的酶超家族。cyp酶中，cyp3a4位于内质网，其表达由糖皮质激素和一些药物诱导。存在于肝脏和肠中的人细胞色素p450酶系统负责广泛的异生物质（例如药物、致癌物质和杀虫剂）和内生物质（例如前列腺素、胆汁酸和类固醇）的代谢。cyp3a4负责50%以上市售药物的（至少部分）代谢。cyp3a4代谢大量结构上不相关的化合物的能力使得cyp3a4造成许多药物口服生物利用度较低，因为它们在进入血液前就会被cyp3a4代谢掉。口服给药的药物化合物在从肠腔进入体循环的过程中被代谢掉，即为药物化合物的系统前代谢。在系统前代谢中起重要作用的典型器官包括例如肝脏和肠，已知在这些器官中有cyp3a4介导的代谢活性。
[0039]
p-糖蛋白（p-gp）是由位于染色体7q21.12上的mdr1（abcb1）基因编码的170 kda糖蛋白，最早发现与cho细胞系。p-gp是atp结合盒（abc）转运蛋白家族的成员，并且能够对多种细胞内底物进行能量依赖性转运。p-gp位于质膜中，其作用是逆浓度梯度排出异生物质。p-gp在多种细胞类型上组成型表达，包括肠粘膜细胞的顶端膜、近端肾小管的刷状缘、血脑屏障和下呼吸道上皮细胞。由于在药物出入口的选择性分布，p-gp具有阻止异生物质进入的生化屏障的功能，并作为真空清洁器将它们从器官如脑、肝、肾中排出，并最终从体循环中排出。这种异生物质排泄功能掩盖了p-gp在降低多种药物的系统生物利用度中的作用。
[0040]
本文所用的术语“cyp3a4/p-gp抑制剂”、“抑制剂”是指对cyp3a4酶、p-糖蛋白转运蛋白或两者的活性具有抑制作用的物质。因此，术语“cyp3a4/p-gp抑制剂”的含义包括cyp3a4抑制剂、p-gp抑制剂和cyp3a4和p-gp的双重抑制剂（即，既作为cyp3a4抑制剂又作为p-gp抑制剂的物质，例如伊曲康唑和克拉霉素）。
[0041]
秋水仙碱是外排转运蛋白p-糖蛋白（p-gp）和cyp3a4代谢酶的底物。已经报道了当秋水仙碱与cyp3a4和p-糖蛋白的双重抑制剂克拉霉素一起施用时的致命药物相互作用。还报道了当秋水仙碱与可能不是有效p-gp抑制剂的cyp3a4抑制剂（例如，葡萄柚汁、红霉素、维拉帕米）或与可能不是有效cyp3a4抑制剂的p-gp抑制剂（例如，环孢霉素）一起施用时的毒性。
[0042]
不推荐对肾或肝损伤患者同时给予秋水仙碱胶囊和同时抑制p-糖蛋白和cyp3a4的药物。这些双重抑制剂和秋水仙碱胶囊联合用于肾和肝损伤患者将导致威胁生命或致命的秋水仙碱毒性。
[0043]
本文所用的术语“cyp3a4抑制剂”是指细胞色素p450 3a4（cyp3a4）的抑制剂。除非另有说明，预期任何已知且药理学上可接受的能够抑制细胞色素p450，即抑制cyp3a4同工酶的化合物均可用于本发明。
[0044]
有用的cyp3a4抑制剂的实例为利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、沙奎那韦、克拉霉素、葡萄柚汁、1-氨基苯并三唑、泰利霉素、氯霉素、酮康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑、奈法唑酮、可比司他、胺碘酮、阿瑞匹坦、维拉帕米、红霉素、氟康唑、咪康唑、佛手柑素、西咪替丁、环丙沙星、环孢霉素、决奈达隆、氟伏沙明、伊马替尼、缬草、维拉帕米、丁丙诺啡、咖啡醇、西洛他唑、福沙吡坦、加巴喷丁、洛美他派、奥芬那君、雷尼替丁、雷诺嗪、他克莫司、替格瑞洛、丙戊酸、大麻二酚、二硫代氨基甲酸酯、米非司酮、诺氟沙星、地拉韦啶、孕二烯酮、咪拉地尔、杨桃、奶蓟、烟酰胺、银杏、胡椒碱、异烟肼、槲皮素、兰索拉唑、黃樟素、吴茱萸次碱、柠檬苦素、二胡椒酰胺a、戈米辛c、paradisin a和paradisin b。在一些实施方案中，本发明从cyp3a4抑制剂中排除了使用地尔硫卓。
[0045]
一些cyp3a4抑制剂是蛋白酶抑制剂，包括例如安普那韦、福沙那韦、阿扎那韦、地瑞拉韦、茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、利托那韦、沙奎那韦、替拉那韦及其组合。在一个具体实施例中，cyp3a4抑制剂包括利托那韦。
[0046]
cyp3a4抑制剂可基于对秋水仙碱的作用而分类为强、中或弱抑制剂。强抑制剂使敏感指标性cyp底物的auc增加≥5倍。中抑制剂使敏感指标性cyp底物的auc增加≥2至＜5倍。弱抑制剂使敏感指标性cyp底物的auc增加≥1.25至＜2倍。本发明考虑使用任何强、中和弱cyp3a4抑制剂。
[0047]
本领域已知有许多p-gp抑制剂（varma et al., pharmacological research 2003; 48: 347-359）。通常，p-gp可通过以下方式抑制：（1）阻断其底物结合位点；（2）干扰其atp酶活性；或（3）在转录或转录后环节降低其表达水平。基于特异性和亲和力，p-gp抑制剂被分为三代。
[0048]
第一代p-gp抑制剂是已知临床上用于其他适应症或针对其它适应症开发但已显示出p-gp抑制效应的药理学化合物。这些化合物包括：钙离子通道阻滞剂如维拉帕米；免疫抑制剂如环孢霉素a；抗高血压药利血平、奎尼丁、育亨宾；以及抗雌激素药物如他莫昔芬和托瑞米芬。这些化合物经系统性给药时，抑制p-gp所需的剂量会产生很高的血清浓度，因此
其使用受到了毒性的限制。
[0049]
第二代p-gp调节剂是缺乏第一代化合物的药理学活性并且通常具有更高的p-gp亲和力的药物。第二代p-gp抑制剂包括环孢霉素a的非免疫抑制类似物，例如psc 833（伐司朴达：6-[(2s,4r,6e)-4-甲基-2-(甲基氨基)-3-氧代-6-辛烯酸]-7-l-缬氨酸-环孢霉素a）；维拉帕米异构体，例如维拉帕米的d-异构体、r-维拉帕米和右维拉帕米；和其它抑制剂，例如vx-710（比立考达：1,7-二(吡啶-3-基)庚烷-4-基-(2s)-1-[氧代(3,4,5-三甲氧基苯基)乙酰基]哌啶-2-羧酸酯）、gf120918（依克立达：n-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)乙基)苯基)-5-甲氧基-9-氧代-9,10-二氢吖啶-4-甲酰胺盐酸盐）和ms-209（富马酸多非喹达：1-(4-(2-羟基-3-(喹啉-5-基氧)丙基)哌嗪-1-基)-2,2-二苯乙酮）。
[0050]
第三代p-gp阻断剂正在开发中，其主要目的是改善对多药耐药性肿瘤的治疗，并以高特异性和毒性抑制p-gp。第三代p-gp抑制剂的例子包括：ly335979（zosuquidar：(2r)-1-{4-[(1ar,6r,10bs)-1,1-二氟-1,1a,6,10b-四氢二苯并[a,e]环丙[c]环庚烯-6-基]哌嗪-1-基}-3-(喹啉-5-基氧基)丙-2-醇三盐酸盐）、oc144093（4-[2-[4-[(e)-3-乙氧基丙-1-烯基]苯基]-4-[4-(丙-2-基氨基)苯基]-1h-咪唑-5-基]-n-丙-2-基苯胺）、r-101933（laniquidar：11-(1-(4-(喹啉-2-基甲氧基)苯乙基)哌啶-4-亚基)-6,11-二氢-5h-苯并[d]咪唑并[1,2-a]氮杂-3-羧酸甲酯）、xr9576（tariquidar：n-[2-[[4-[2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢-1h-异喹啉-2-基)乙基]苯基]氨基甲酰基]-4,5-二甲氧基苯基]喹啉-3-甲酰胺）和xr9051（3-((z)-((z)-5-苯亚甲基-4-甲基-3,6-二氧代哌嗪-2-亚基)甲基)-n-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺）。研究显示一些第三代p-gp调节剂如ly335979、oc144093和xr9576是p-gp的高效和选择性抑制剂，其效力是第一和第二代抑制剂的约10倍。
[0051]
在一些实施方案中，p-gp抑制剂选自克拉霉素、伊曲康唑、酮康唑、奎尼丁、维拉帕米、苄普地尔、尼卡地平、硝苯地平、非洛地平、伊拉地平、三氟拉嗪、氯哌噻吨、三氟丙嗪、氟哌噻吨、氯丙嗪、丙氯拉嗪、吲哚生物碱、抗疟奎宁、抗心律失常奎尼丁、环孢霉素a、右维拉帕米、依莫帕米、戈洛帕米和ro11-2933、psc 833、zosuquidar、依克立达、xr9051、oc144-093、比立考达（vx-710）、汀考达（vx-853）或tariquidar（xr9576）。hossam m et al, p-glycoprotein inhibitors of natural origin as potential tumor chemo-sensitizers: a review, journal of advanced research, volume 6, issue 1, 2015, pages 45-62描述了p-gp抑制剂的完整列表。
[0052]
本领域技术人员知道如何确定一个物质是否是代谢酶例如cyp3a4酶的抑制剂。本领域技术人员还知道如何确定物质是否是转运蛋白例如p-糖蛋白的抑制剂。读者可参阅美国卫生和人类服务部、食品和药品管理局以及药物评审和研究中心（cder）在2017年10月发布的in vitro metabolism
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and transporter-mediated drug-drug interaction studies guidance for industry。
[0053]
乙型肝炎病毒感染（hbv感染）乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hbv）引起的肝部感染。血液中发现的标志物可用于确诊乙型肝炎感染并区分急性感染和慢性感染。这些标志物为由乙型肝炎病毒（抗原）产生的物质和由免疫系统产生的对抗病毒的抗体。乙型肝炎病毒具有三种抗原，通常使用这些抗原的测试：表面抗原（hbsag）、核心抗原（hbcag）和e抗原（hbeag）。
[0054]
hbsag和抗hbs抗体：血液中乙型肝炎表面抗原（hbsag）的存在表明患者目前感染了该病毒。hbsag在最初暴露于病毒后平均四周时出现。从急性乙型肝炎感染中恢复的个体在症状发作后大约四个月内清除血液中的hbsag。这些个体产生针对hbsag（抗hbs）的抗体。抗hbs抗体对随后的乙型肝炎病毒感染提供完全免疫。类似地，成功接种抗乙型肝炎疫苗的个体在血液中产生抗hbs抗体。在急性发作期间不能清除病毒的患者发展为慢性乙型肝炎。当hbsag存在于血液中至少六个月时，可确诊慢性乙型肝炎。在慢性乙型肝炎中，多年后依然可检测到hbsag，并且未见抗hbs抗体。
[0055]
抗hbc抗体：在急性肝炎中，出现了一类针对乙型肝炎核心抗原的一类特异性早期抗体（抗hbc igm）。随后会出现另一类抗体，抗hbc igg，并维持终生，而不管个体是否恢复或发展为慢性感染。只有抗hbc igm可用于诊断急性乙型肝炎感染。
[0056]
hbeag、抗hbe抗体和前核心突变。当乙型肝炎病毒活跃增殖时，会出现乙型肝炎e抗原（hbeag），而其抗体（抗hbe抗体，也称为hbeag血清转化）的产生表明病毒的活性相对较低且传播风险较低。在感染乙型肝炎病毒的一些个体中，病毒的遗传物质已经经历了结构改变，称为前核心突变。这种突变导致乙型肝炎病毒不能产生hbeag，即使该病毒正在活跃地繁殖。这意味着即使在具有突变的患者的血液中无法检测到hbeag，乙型肝炎病毒在这些人中仍然是有活性的并且可以感染其他人。
[0057]
乙型肝炎病毒dna：乙型肝炎病毒繁殖的最佳标志物是血液中乙型肝炎病毒的dna水平。血液样品中乙型肝炎病毒dna的检测表明病毒正在活跃地增殖。在急性肝炎中，hbv dna在感染后不久就存在，但在清除感染的患者体内随着时间的推移而被消除。在慢性肝炎中，hbv dna的水平通常维持高水平多年，然后随着免疫系统控制病毒而降低。hbv dna水平有时被称为“病毒载量”。
[0058]
方法和疗法本公开提供了一种使用秋水仙碱联合cyp3a4/p-gp抑制剂治疗hbv感染的方法。如上所述，使用秋水仙碱单药治疗hbv感染在临床中似乎没有前景，并且没有进行进一步的临床试验，导致无nda申请或fda未批准。
[0059]
本发明人惊奇地发现，通过用cyp3a4/p-gp抑制剂提高对象的秋水仙碱血液浓度，秋水仙碱在病毒清除和繁殖方面的有效性显著提高。本文所示的数据表明，当有意将秋水仙碱与cyp3a4/p-gp抑制剂联用时，与使用秋水仙碱单药相比，hbv dna水平（胞外或胞内）显著降低。
[0060]
已有研究描述cyp3a4/p-gp抑制剂因药物间相互作用（ddi）而应避免与秋水仙碱共同施用，并且已有报道称共同施用导致致死情形甚至死亡。在秋水仙碱与cyp3a4/p-gp抑制剂例如利托那韦一起施用的情况下，提出通过减少秋水仙碱的预期日剂量或通过延长给药间隔来减少秋水仙碱的剂量，以便防止潜在的毒性。然而，基于如下发现，即当秋水仙碱的血液浓度增加到通常推荐剂量（例如不超过2 mg）所不能达到的某一水平时，秋水仙碱对抑制hbv复制和促进病毒清除极其有效，在本公开中刻意将cyp3a4/p-gp抑制剂与秋水仙碱联用。在本公开的一些实施方案中，考虑到秋水仙碱的潜在毒性和狭窄的治疗窗以及目前临床实践中通常推荐的秋水仙碱剂量，通过对接受秋水仙碱给药相同对象共同施用cyp3a4/p-gp抑制剂而不增加秋水仙碱正常剂量来实现秋水仙碱血液浓度的增加。
[0061]
在一些实施方案中，cyp3a4/p-gp抑制剂与秋水仙碱共同施用，使得接受治疗的对
象的血液中秋水仙碱的峰浓度（c
max
）增加到有效减少hbv复制或清除hbv的水平。cyp3a4/p-gp抑制剂的剂量是在药代动力学上增加对象中与cyp3a4/p-gp抑制剂共同施用的秋水仙碱的c
max
的量。在本公开中，与秋水仙碱共同施用的cyp3a4/p-gp抑制剂的剂量被定义为“药代动力学上有效量”。本说明书中使用的术语“药代动力学上有效量”是指在受治疗的对象中，每种活性成分能够在药代动力学上将秋水仙碱的c
max
增加至所需或预定水平的量。通过控制单独的抑制剂的量或秋水仙碱和抑制剂的剂量，可以调节对象中c
max
的增加。用于单剂的cyp3a4抑制剂、p-gp抑制剂或cyp3a4/p-gp双重抑制剂的药代动力学上有效量可以以多种方式指定，这取决于诸如配制方法、施用方式、患者年龄、体重、性别、病理状况、饮食、施用时间、施用间隔、施用途径、排泄速度和反应敏感性的因素。例如，单剂时抑制剂的药代动力学上有效量可在0.001至100 mg/kg，或0.02至10 mg/kg的范围内，但不限于此。单剂的代谢有效量可以配制成单位剂型的单一制剂或配制成适当分开的剂型，或者可以制备成包含在多剂量容器中。在一个实施方案中，抑制剂的有效量为约0.1 mg/kg至约100 mg/kg。在另一个实施方案中，抑制剂的有效量为约1 mg/kg至约20 mg/kg。在一个实施方案中，抑制剂（例如利托那韦）的有效量为约0.1 mg/kg至约100 mg/kg。在另一个实施方案中，抑制剂的有效量为约1 mg/kg至约20 mg/kg。
[0062]
在一些实施方案中，对象中秋水仙碱的c
max
增加约30%至约500%。优选地，约50%至约500%、约50%至约400%、约50%至约300%、约50%至约200%、约50%至约180%、约50%至约150%、约50%至约120%、约50%至约100%、约60%至约500%、约60%至约400%、约60%至约300%、约60%至约200%、约60%至约100%、约70%至约500%、约70%至约400%、约70%至约300%、约70%至约200%、约70%至约100%、约80%至约500%、约80%至约400%、约80%至约300%、约80%至约200%、约80%至约100%、约90%至约500%、约90%至约400%、约90%至约300%、约90%至约200%、约90%至约100%、约100%至约500%、约100%至约400%、约100%至约300%、约100%至约200%、约100%至约180%、约100%至约150%、约100%至约120%、或其间的任意值。例如，对象中秋水仙碱的c
max
增加了约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%、约110%、约120%、约130%、约140%、约150%、约160%、约170%、约180%、约90%、约200%、约210%、约220%、约230%、约240%、约250%、约260%、约270%、约280%、约290%、约300%、约310%、约320%、约330%、约340%、约350%、约360%、约370%、约380%、约390%、约400%、约410%、约420%、约430%、约440%、约450%、约460%、约470%、约480%、约490%、约500%、或其间的任何值。
[0063]
如上所述，有效减少hbv复制或清除hbv的水平由秋水仙碱对对象的药理学参数确定。在一些实施方案中，对象中秋水仙碱的c
max
被提高至约20 nm至约60 nm，优选地约20 nm至约55 nm、约20 nm至约50 nm、约20 nm至约45 nm、约20 nm至约40 nm、约20 nm至约35 nm、约20 nm至约30 nm、约25 nm至约60 nm、约25 nm至约55 nm、约25 nm至约50 nm、约25 nm至约45 nm、约25 nm至约40 nm、约25 nm至约35 nm、约25 nm至约30 nm、约30 nm至约60 nm、约30 nm至约55 nm、约30 nm至约50 nm、约30 nm至约45 nm、约30 nm至约40 nm、约30 nm至约35 nm、约35 nm至约60 nm、约35 nm至约55 nm、约35 nm至约50 nm、约35 nm至约45 nm、约35 nm至约40 nm、约40 nm至约60 nm、约40 nm至约55 nm、约40 nm至约50 nm、约40 nm至约45 nm。例如，对象中秋水仙碱的c
max
被提高至约20 nm、约22 nm、约24 nm、约26 nm、约28 nm、约30 nm、约32 nm、约34 nm、约36 nm、约38 nm、约40 nm、约42 nm、约44 nm、约46 nm、约48 nm、约50 nm、约52 nm、约54 nm、约56 nm、约58 nm、约60 nm、或其间的任何值。
[0064]
在一些实施方案中，秋水仙碱以每日一次约0.6 mg至约2 mg，优选地每日一次约0.6 mg至约1.2 mg，更优选地每日一次约1.0 mg的剂量施用。在一些实施方案中，秋水仙碱以低于约2 mg每日的剂量施用。
[0065]
在一些实施方案中，抑制剂以每日一次约50 mg至约600 mg，优选地每日一次约100 mg至约600 mg，优选地每日一次约100 mg至约500 mg，优选地每日一次约100 mg至约400 mg，优选地每日一次约100 mg至约300 mg，优选地每日一次约100 mg至约200 mg，优选地每日一次约200 mg至约500 mg，优选地每日一次约200 mg至约400 mg，优选地每日一次约200 mg至约300 mg，优选地每日一次约300 mg至约500 mg，优选地每日一次约400 mg至约500 mg，或其间的任何值的剂量施用。
[0066]
本文所用的术语“共同施用”或类似表达包括秋水仙碱在施用cyp3a4/p-gp抑制剂之前、同时或之后施用的情况。优选地，秋水仙碱与抑制剂同时施用。
[0067]
在秋水仙碱不与抑制剂同时施用的情况下，考虑两种治疗模式可以在彼此约0.1至12小时内给予对象。在一些实施方案中，两种治疗模式在彼此约0.5至6小时内施用。在一些实施方案中，两种治疗模式在彼此约1至6小时内施用。在一些实施方案中，两种治疗模式在彼此约3至6小时内施用。例如，在施用抑制剂约0.1小时、约0.2小时、约0.4小时、约0.6小时、约0.8小时、约1.0小时、约1.2小时、约1.4小时、约1.6小时、约1.8小时、约2.0小时、约2.2小时、约2.4小时、约2.6小时、约2.8小时、约3.0小时、约3.2小时、约3.4小时、约3.6小时、约3.8小时、约4.0小时、约4.2小时、约4.4小时、约4.6小时、约4.8小时、约5.0小时、约5.2小时、约5.4小时、约5.6小时、约5.8小时、约6.0小时、或其间的任何值之前或之后施用秋水仙碱。在一些实施方案中，在施用秋水仙碱或其衍生物之前施用抑制剂。例如，在施用秋水仙碱或其衍生物约0.1小时、约0.2小时、约0.4小时、约0.6小时、约0.8小时、约1.0小时、约1.2小时、约1.4小时、约1.6小时、约1.8小时、约2.0小时、约2.2小时、约2.4小时、约2.6小时、约2.8小时、约3.0小时、约3.2小时、约3.4小时、约3.6小时、约3.8小时、约4.0小时、约4.2小时、约4.4小时、约4.6小时、约4.8小时、约5.0小时、约5.2小时、约5.4小时、约5.6小时、约5.8小时、约6.0小时、或其间的任何值之前施用抑制剂。
[0068]
在一些实施方案中，秋水仙碱和抑制剂以药物组合物的形式施用，该药物组合物包含特定量的秋水仙碱、药代动力学上有效量的抑制剂和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，秋水仙碱以包含特定量的秋水仙碱和药学上可接受的载体的药物组合物的形式施用，并且抑制剂以包含药代动力学上有效量的抑制剂和药学上可接受的载体的药物组合物的形式施用。在那些实施方案中，提供了一种药盒，该药盒包括：包含特定量的秋水仙碱和药学上可接受的载体的药物组合物，和包含药代动力学上有效量的抑制剂和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，药盒可以包含医师在临床使用期间可以参考的使用说明书。
[0069]
在某些实施方案中，上述任一药物组合物是胃肠外或非胃肠外施用的，例如口服、静脉内、肌内、经皮或皮内施用。优选地，上述药物组合物是口服给药的。
[0070]
因此，本公开内容的一个方面提供了一种治疗对象中hbv感染的方法，包括向有需要的对象施用特定量的秋水仙碱和药代动力学上有效量的cyp3a4/p-gp抑制剂，使得对象中秋水仙碱的峰浓度（c
max
）被有意地增加至预定水平。在一些实施方案中，秋水仙碱的c
max
增加约30%至约500%。
[0071]
在一些实施方案中，秋水仙碱的c
max
增加到有效减少hbv复制或清除hbv的水平。在一些实施方案中，与使用相同量的秋水仙碱单药相比，细胞外或细胞内hbv dna水平显著降低。
[0072]
在一些实施方案中，与使用相同量的秋水仙碱单药相比，秋水仙碱的c
max
水平增加至导致对象中hbsag和/或hbeag水平显著降低的水平。
[0073]
本文所用的术语“显著地”是指与对照（例如，通过使用相同量的秋水仙碱单药获得的水平或值）相比，水平或值增加或降低至少约20%。在一些实施方案中，“显著地”是指至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、5000%、10000%或更多，或其间的任何值的变化。
[0074]
在一些实施方案中，将秋水仙碱的c
max
提高至约20 nm至约60 nm，优选地提高至约30 nm至约40 nm。
[0075]
在一些实施方案中，本公开的方法还包括监测对象的潜在毒性。在一些实施方案中，本公开的方法还包括调节秋水仙碱和抑制剂的剂量以避免不良副作用。
[0076]
本公开的另一方面提供了一种在对象中增强秋水仙碱的抗hbv疗效以用于治疗hbv感染的方法，包括对对象共施用药代动力学上有效量的cyp3a4/p-gp抑制剂，使得对象中秋水仙碱的峰浓度（c
max
）被有意地增加至预定水平。在一些实施方案中，对象中秋水仙碱的c
max
增加约30%至约500%。在一些实施方案中，对象中秋水仙碱的c
max
被增加至约20 nm至约60 nm。
[0077]
药物组合物和药盒本发明的另一方面提供了一种药物组合物，该药物组合物包含特定量的秋水仙碱或其药学上可接受的盐、药代动力学上有效量的cyp3a4/p-gp抑制剂和药学上可接受的载体。该药物组合物用于治疗对象的hbv感染。在一些实施方案中，药物组合物包含约0.6 mg至约2 mg的秋水仙碱。
[0078]
本发明的另一方面提供了一种药盒，该药盒包含第一药物组合物和第二药物组合物，第一药物组合物包含特定量的秋水仙碱或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体，第二药物组合物包含药代动力学上有效量的cyp3a4/p-gp抑制剂和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药盒可以包含医师在临床使用期间可以参考的使用说明书。在一些实施方案中，第一药物组合物包含约0.6 mg至约2 mg的秋水仙碱。
[0079]
在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，剂型必须是无菌的，并且必须是容易注射程度的流体。其在生产和储存条件下必须是稳定的，并且必须被保存以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。
[0080]
载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）、其合适的混合物和/或植物油。例如，通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散液的情况下保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。微生物作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，其优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
[0081]
例如，对于水溶液中的肠胃外给药，如果需要，溶液应该适当地缓冲，并且首先用
足量的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下、肿瘤内和腹膜内给药。在这方面，根据本公开，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，一个剂量可以溶解在1 ml等渗nacl溶液中，并且添加到1000 ml皮下灌注流体中或者在建议的输注部位注射。根据所治疗的对象的状况，剂量将必然发生一些变化。在任何情况下，负责给药的人将确定个体对象的合适剂量。此外，对于人类给药，制剂应满足fda要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。
[0082]
通过根据需要，将活性化合物以所需量与上述列举的各种其它成分一起掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入到无菌溶媒中来制备分散体，其中无菌溶媒包含基本分散介质和来自以上列举的那些其它所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何其他所需成分的粉末。
[0083]
本文公开的组合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括由蛋白质的游离氨基，和无机酸如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式和治疗有效量施用。该制剂易于以各种剂型给药，例如注射溶液、药物释放胶囊等。
[0084]
如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、溶媒、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类媒介和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除了与活性成分不相容的任何常规媒介或试剂之外，考虑其在治疗组合物中的用途。也可将补充活性成分掺入组合物中。
[0085]
实验例实施例1. 秋水仙碱单药具有剂量依赖性的抗hbv疗效材料和方法：pxb细胞用hbv gt c感染。第12天开始用秋水仙碱处理，后续每3天处理一次直至第24天。第27天结束孵育。通过分析细胞外hbv dna、hbsag、hbeag、h-alb和细胞内hbv dna/cccdna水平来测量抗hbv疗效。恩替卡韦用作阳性对照。将从3只小鼠分离的肝细胞合并到种子培养板。混合细胞的细胞密度为7.37
×
106个/ml。pxb-cells
®
是从pxb小鼠中分离的新鲜肝细胞。分离后的细胞活度：＞80%。供体肝细胞购自corning公司（tewksbury，ma，usa），批号：bd195（西班牙裔，2y，女性）。秋水仙碱获自rim bioscience llc，批号：20180320，浓度:10 mm。恩替卡韦购自santa-cruz，批号：i0914，浓度：1 mm。在显微镜下观察培养板并拍照。
[0086]
结果和结论：第27天的参数测量结果见表1。秋水仙碱和阳性对照恩替卡韦均显示剂量依赖性抗hbv疗效。秋水仙碱的疗效稳健但稍弱于恩替卡韦。图1中所示的显微图像表明与未处理的对照组相比秋水仙碱具有剂量依赖性抗hbv疗效。
[0087]
实施例2. 秋水仙碱在aav-hbv小鼠模型中的体内药效学疗效材料和方法目的和材料：本研究的目的是评价试验化合物在aav-hbv小鼠模型中的体内药效学效力。携带hbv基因组的重组aav（raav8-1.3hbv ayw，批号：2016120601）由covance从北京五加和分子医学研究所购买，使用前在-70 ℃储存。提供溶媒、秋水仙碱以及秋水仙碱和
利托那韦的组合作为备用溶液，给药前在2
–
8 ℃储存。
[0088]
动物和饲养：于2017年9月18日接收来自上海灵畅生物科技有限公司（中国上海）的十六只4
–
5周龄的雄性c57bl/6小鼠。基于可接受的临床状况和体重选择小鼠以纳入研究中。在受控的温度（21
–
25 ℃）、湿度（40
–
70%）和12小时光照/12小时黑暗循环（上午7:00至下午7:00开启光照）下，将小鼠分组安置在铺有玉米穗垫料的聚碳酸酯笼中。小鼠可自由摄取正常饮食（啮齿动物粮#5cc4，pmi nutrition international, llc，in，usa）和无菌水。本研究中的所有程序都符合当地动物福利法规、covance全球政策和程序，以及《实验动物的照料和使用指南》。
[0089]
小鼠aav-hbv模型诱导：到达covance后，使动物在动物设施中适应7天。在第-28天，所有动物通过尾静脉（iv）注射1
×
10
11 aav-hbv载体基因组（在200 μl pbs中）用于模型诱导。每天监测动物临床体征，并在第-35、-28、-14和-7天测量体重。在-14天和-7天（分别为aav-hbv注射后14天和21天），在异氟烷麻醉下通过眼窝窦后出血收集血样用于血清制备（每只小鼠15 μl），并用于基线病毒载量分析测定。
[0090]
处理参数：在第-1天（第1次化合物给药前一天），基于血清病毒标志物（hbsag、hbv dna、hbeag）和第-7天的体重，选择12只合格的hbv感染小鼠，随机分成3组，每组4只动物，用于化合物治疗（表2）。
[0091]
表1. 第27天的参数测量定量限：hbv-dna（细胞外）；2.76 log拷贝/ml，hbsag；0.05 iu/ml，hbeag；截止指数，halb；5.0 μg/ml的hbv dna（细胞内）；10拷贝/100 ng dna， cccdna；25拷贝/100 ng dna。
[0092]
*
：尚未经质控确认的数值。
**
：使用10倍稀释的样品测量的hbeag水平。 ：实时pcr阳性。
[0093]
在第0
–
17天和第23
–
41天给予10 ml/kg溶媒，在第18
–
22天给予20 ml/kg溶媒。在第0
–
17天以1 mg/kg的剂量和10 ml/kg的体积给予秋水仙碱和秋水仙碱 利托那韦，第18
–
22天剂量为2 mg/kg，体积为20 ml/kg，在第23
–
41天剂量为5 mg/kg，体积为10 ml/kg。通过口服灌胃每日一次给予溶媒和两种化合物。每日监测动物临床体征。治疗期间每周两次测量体重进行剂量计算，非治疗期间每周一次。在第0、7、14、21、28、35、42、49和56天，每周一次（在治疗期间给药之前）从所有小鼠采集血样用于血清制备（每只小鼠30 μl）。血清样品用于由adicon测定hbsag、hbeag和hbv dna，以及由covance测定ast和alt。第56天采集血样后，对所有研究动物实施安乐死，不采集组织。未纳入研究的四只不合格的hbv感染小鼠实施安乐死，不采集血液或组织。基于血清hbv生物标志物（hbv dna、hbsag和hbeag）和第-7天的体重，将动物分成3组。第0天开始进行化合物治疗，此时平均hbsag为4.28 log10 iu/ml、hbv dna为5.72 log10 iu/ml、hbeag为3.66 log10 s/co，平均体重为23.2 g。秋水仙碱与可比司他的联用以及与1-氨基苯并三唑的联用如上文所述参考利托那韦采用相同的步骤。
[0094]
表2. 化合物治疗的分组设计缩写：po=口服；qd=每日一次。
[0095]
表3. 试验化合物的组合物结果和结论如图2所示，除了在第21
–
42天期间剂量水平增加时03组（g03）体重增长轻微降低外，各研究组中未见显著差异。
[0096]
剂量水平增加到2 mg/kg/天和5 mg/kg/天时，秋水仙碱和秋水仙碱 利托那韦对血清hbv-dna显示出显著的下调作用，且在自第42天起治疗停止后反弹（图3）。在停药期内（第42
–
56天），秋水仙碱 利托那韦治疗组中hbv-dna和hbeag的血清水平保持显著低于溶媒组。
[0097]
如图4所示，秋水仙碱 利托那韦治疗组的血清alt和ast从第28天开始随着剂量水平增加而增加，治疗停止后恢复至正常水平。图5示出了秋水仙碱分别联用另外两种抑制剂的体内疗效，其中表明在aav-hbv小鼠模型中，与秋水仙碱单药相比，秋水仙碱与可比司他联用以及秋水仙碱与1-氨基苯并三唑联用显著降低了hbsag、hbv dna和hbeag的水平。
[0098]
实施例3. 秋水仙碱在小鼠中的毒性研究材料和方法：使用约4
–
5周龄的雄性balb/c小鼠（18
–
21 g）进行测定。如下将动物
随机分成五组。每日一次口服给予指定浓度的秋水仙碱或秋水仙碱加指定的各cyp3a4/p-gp抑制剂。每日测量并记录小鼠重量。如小鼠体重减轻不超过15%或体重超过15 g，则所有小鼠接受下一次口服给药。当小鼠死亡或体重减轻超过15%时，实验结束。将小鼠随机分成5组：（每日一次口服）对照（秋水仙碱）（n=5）；秋水仙碱 可比司他（n=5）；秋水仙碱 普罗地芬（n=5）；秋水仙碱 利托那韦（n=5）；秋水仙碱 1-氨基苯并三唑（1-abt）（n=5）。
[0099]
结果见图6中，其中各组中小鼠体重的变化似乎未见显著性。如上所述，秋水仙碱与不同的cyp3a4/p-gp抑制剂联用对小鼠的毒性并不高于使用秋水仙碱单药。特别地，当抑制剂之一（1-abt）的剂量增加到50 mg/kg时，小鼠体重没有显著降低，表明对该联合治疗的耐受性良好。
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