猪血小板裂解液培养基及其应用的制作方法

1.本发明涉及细胞培养基的技术领域，具体涉及动物细胞培养中的应用。


背景技术：

2.细胞培养添加物是一类为细胞生长提供所需激素、蛋白质、生长因子和微量化学物质的材料统称，从品类上通常可以分为血清与血清替代物三大类。目前应用中常见的细胞培养添加物主要有血清、pl(血小板裂解液)和无血清培养基。其中以fbs为代表的血清类材料作为培养添加物在应用中最为常见。
3.pl是富血小板血浆的衍生物，是将浓缩血小板进一步裂解后所获得的液体成分，因其成分复杂，存在fbs等血清类材料存在的问题。相关研究表明早在20世纪80年代人pl用于培养已建立的细胞系、肿瘤细胞或关节软骨细胞。人pl已成功用于间充质干细胞的培养和脂肪来源基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、单核细胞、人牙龈成纤维细胞等多种细胞的培养。pl应用最为广泛的是间充质干细胞的培养，相关研究基本都基于人pl在细胞培养中的应用，其他动物源性pl的研究数量极少。
4.随着再生医学和细胞疗法的发展，细胞培养的要求也在相应增加。除了人以外，各种模式动物的细胞培养要求也在相应增高。相同物种的 pl可以有效避免异种间的异源感染问题。2018年爆发非洲猪瘟对地方猪遗传资源安全造成重大威胁，为避免猪遗传资源丢失，国家大力推进地方猪遗传资源保护工作，发明人参与了安徽省地方猪遗传资源保护，其中很重要的一项便是保存猪体细胞，以便于在未来可以通过体细胞克隆与胚胎移植技术重新建立良好的地方猪种质资源。然而保存体细胞涉及细胞分离培养，目前为止多选用fbs分离培养猪的体细胞，然而在未来对体细胞进行克隆与移植将会产生异种免疫反应，使用同源的 pl则可避免此类问题的发生。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了猪血小板裂解液(ppl)替代胎牛血清(fbs)用于猪细胞培养，保证了成纤维细胞或骨髓间充质干细胞在体外培养扩增时不受外源性的污染，也免于异体细胞治疗疾病时的免疫排斥。
6.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
7.本发明提供一种用于猪成纤维细胞或间充质干细胞在体外培养扩增的细胞培养基，其特征在于，该培养基包含1-10％的猪血小板裂解液。
8.优选地，基础培养基可以为dmem高糖培养基或αmem基础培养基。
9.优选地，该培养基包含5-8％的猪血小板裂解液.
10.更进一步地，该培养基包含非必须氨基酸和/或glutamax。
11.本发明还提供一种猪血小板裂解液在细胞培养中的应用。所述细胞为成纤维细胞和间充质干细胞。优选地，所述成纤维细胞为猪胎儿成纤维细胞(pef)或猪成体成纤维细胞(paf)。更优选地，所述间充质干细胞为猪脂肪间充质干细胞(pamsc)或猪骨髓间充质干细
胞(pbmsc)。
12.特别地，培养基中猪血小板裂解液的添加浓度为1-10％，优选5-8％。
13.本发明还提供一种猪血小板裂解液的制备方法，包括以下步骤：
14.(1)采集猪血小板和猪血浆；
15.(2)离心去除步骤(1)中猪血浆中的纤维蛋白原；
16.(3)将猪血小板重悬于已离心去除纤维蛋白原的血浆中；
17.(4)将步骤(3)得到的样品反复冻融，离心后收集上清液，即为血小板裂解液。
18.优选地，所述步骤(1)包括以下步骤，
19.a.选取健康待宰生猪，在屠宰时收集血液；
20.b.将步骤a采集的抗凝猪血液转移到第一离心管中，离心观察到血液分层；
21.c.取第一离心管中部分富血小板血浆(prp)层转移到第二离心管中；
22.d.将步骤c取完部分prp层剩余的液体，按照1-3:1-3的比例添加缓冲液，将离心管倒置混匀；对离心管进行离心，将上清液转移到另一离心管中；
23.e.将步骤d中离心管得到的上清液体进行富集、并离心，得到血小板颗粒；
24.f.对第二离心管中液体进行富集、并离心，得到血小板颗粒和血浆；
25.g.将上述步骤e或步骤f得到的血小板颗粒冷冻保存。
26.优选地，所述猪血小板裂解液的制备方法步骤(4)中，在-80℃和 4℃条件反复冻融2-5次。
27.优选地，所述步骤b)、步骤d)离心条件为以100-200g离心15-20min；步骤e)、步骤f)离心条件为在20-22℃下以2500-3200r离心15-30min。
28.优选地，将步骤f得到的血浆过滤除菌，冷冻保存；优选地，将步骤f得到的血浆经0.22μm滤器过滤除菌。
29.优选地，在步骤a收集血液中，优选地，所述抗凝剂为cpda-1枸橼酸钠类抗凝剂；将抗凝剂与血液体积以28:200混合均匀。
30.优选地，步骤(3)中所述去除纤维蛋白原采用的物质为无机钙化合物，优选为氯化钙；优选地，血浆中cacl2添加浓度为9.3-21.7mmol/l；优选为9.3mmol/l。
31.本发明还提供了根据上述制备方法制得的猪血小板裂解液。
32.本发明通过实验表明，与fbs相比，ppl培养的间充质干细胞与成纤维细胞表现出纺锤形拉长的形态，具有较高的增殖指标，相似的分化(cd)标记簇，在分化谱系(骨细胞、软骨细胞)中没有明显的变异。因此我们完全可以制备ppl代替fbs培养，特别是在相同物种细胞培养方面。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
34.图1为猪血小板分离流程；
35.图2为本发明通过在不同培养条件下观察到的对细胞形态学的影响(scalebar:250μm)；
36.图3为paf、pef、pamsc和pbmsc细胞生长曲线；
37.图4为paf、pef、pamsc和pbmsc细胞传代增殖曲线；
38.图5为paf、pef、pamsc和pbmsc细胞连续传代倍增时间；
39.图6为本发明paf细胞免疫荧光染色；
40.图7为pamsc细胞免疫荧光染色；
41.图8为pamsc和pbmsc阿利新蓝染色；
42.图9为猪血浆凝固程度
具体实施方式
43.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.本发明提供的血小板裂解液的制备方法及其应用中所用仪器或试剂均可由市场购得。
45.hep缓冲液的配置方法如下：
[0046][0047][0048]
将上述组分加入到800ml双蒸水中，加热溶解，用2n naoh调节溶液ph至7.4，双蒸水定容至1000ml，0.22μm的微孔滤器过滤， 4℃保存备用。
[0049]
cpda-1抗凝剂配制方法如下：
[0050]
组成：
[0051][0052]
将上述组分加入到800ml双蒸水中，加热溶解，用2n naoh调整ph至7.4，双蒸水定容至1000ml，0.22μm的微孔滤器过滤，4℃保存备用。
[0053]
实施例1：猪血小板的分离
[0054]
具体操作流程照图1
[0055]
a)在安徽省绩溪县民生定点屠宰场选取12头健康待宰生猪，促凝管采集血液，收集血清，送至安徽洪桥中科基因技术有限公司进行传染病检测。
[0056]
b)将抗凝剂与血液体积以28:200混合均匀。
[0057]
c)用移液管将采集抗凝猪血液转移到15ml离心管a中。(大量分离血小板时，可将血液静置或低速离心分层取上层至15ml离心管中)
[0058]
d)将15ml离心管a在20-22℃下以200g离心20min，可以观察到血液分层如离心管b所示：底层：红细胞(占总体积的50％
‑ꢀ
80％)中层：非常薄的白细胞及血小板层(buffycoat,bc)上层：富血小板血浆(plateletrichplasma,prp)
[0059]
e)使用移液管将离心管b中prp上层2/3的液体转移到新的离心管l中，余下液体如管c所示。
[0060]
f)向管c的液体中按1:1的比例添加hep缓冲液，慢慢将离心管倒置混匀如离心管d状。
[0061]
g)离心管d在20-22℃下以100g离心15-20min，将上清液用移液管转移到新15ml离心管f中。
[0062]
h)将数个离心管f中的液体聚集在管h中，在20-22℃下以3200 r离心20min；如离心管i所示血小板颗粒沉积在底部，上层转移至离心管j中。获得少量血小板如离心管k所示。
[0063]
i)将管l中的prp富集到离心管m中，在20-22℃下以3200r离心20min；如离心管n所示血小板颗粒沉积在底部，上层血浆转移至离心管o中。获得少量血小板如管k所示。
[0064]
j)可将k离心管中获得血小板富集至一个离心管中，于-20℃冰箱冷冻保存。
[0065]
k)将离心管o的血浆经16层纱布、4层滤纸、一层无纺布及0.22 μm滤器过滤除菌。使用滤纸和无纺布过滤时可采用布氏漏斗进行负压过滤。将采集到的无菌血浆于-20℃冰箱冷冻保存。
[0066]
实施例2猪血浆中纤维蛋白原的去除
[0067]
本试验优化了去除纤维蛋白原最适ca
2
添加量，设计实验如表1。在室温条件下向透明小管的血浆中添加不同浓度的cacl2后每20min 向小管内投入钢珠以检测血浆凝固情况。每两分钟观察一次血浆凝固情况，并记录。
[0068]
表1cacl2添加浓度滴定优化实验
[0069][0070]
如表2和图9所示，试验结果表明，在添加不同浓度cacl2后，血浆发生了不同程度
的凝固。其中，20min内，cacl2添加浓度在0
‑ꢀ
3.1mmol/l时钢珠沉底，表明血浆中的纤维蛋白原无法析出，血浆仍保持液体状态；cacl2添加浓度在6.2-9.3mmol/l时钢珠挤压凝固的纤维蛋白凝胶后使得凝胶压缩后到达近底部，表明血浆中的纤维蛋白原部分析出，血浆部分凝固；添加浓度在12.4-21.7mmol/l时，钢珠停留在血浆凝块表面，表明纤维蛋白原已充分析出，血浆完全凝固。当试验时长达到40min，cacl2添加浓度为9.3mmol/l时，第二颗钢珠无法落下，表明血浆完全凝固，纤维蛋白原已充分析出。因此在大量制备去纤维蛋白原血浆(血清)时，采取了以497:3的比例添加浓度为1.55mol/lcacl2溶液，并在室温条件下充分凝固40min以上，即可获得凝固的血浆，在此基础上通过高速离心的方法即可大量制备去除了纤维蛋白原的血浆(血清)。
[0071]
表2cacl2添加浓度滴定试验
[0072][0073]
根据实施例1和2的方法，将从1l猪全血中采集到的血小板重悬于70ml已离心去除纤维蛋白原的血浆中，在-80℃和4℃条件反复冻融三次，6000g离心30min后收集上清，上清液经0.22μm孔径过滤器进行过滤除菌，滤过液即为pl，为减少个体及批次间差异，将12 个供体的pl进行混匀，分装后-80℃保存。
[0074]
实施例4：细胞形态学观察：
[0075]
为观察ppl培养猪间充质来源细胞对细胞形态的影响，本发明将分离获得的paf、pef、pamsc、pbmsc细胞分别接种于含8％ppl与含10％fbs培养基中，连续传代后，倒置显微镜下观察细胞形态。图 2为p3代不同培养液细胞生长形态。细胞多呈长梭形，星形或纺锤形，成纤维细胞细胞与间充质干细胞形态相似无明显差异。
[0076]
实施例5：细胞生长曲线的测定：
[0077]
为测定ppl条件下猪细胞生长增殖速度等特性，本发明将分离获得的paf、pef、pamsc、pbmsc细胞分别接种于含8％ppl与含10％ fbs培养基中进行传代培养，选取p3代对数生长期细胞进行生长曲线的测定和绘制。具体方法为：收集对数生长期的细胞，以7.5
×
103个/ml 接种于96孔板中间6行9列。每列分别标记为1d、2d、3d至9d，预培养24h。每日依次向各列孔中加入10μl cck-8溶液，孵育3h；用酶标仪测定波长450mm处吸光度值，利用graphpad prism8绘制生长曲线图。细胞生长曲线绘制结果如图3所示。
[0078]
由图所知，paf在8％ppl与10％fbs培养基中1-3d生长速度较为一致，第四天开始ppl与fbs相比展现出很大的增长优势；pef在 8％ppl与10％fbs培养基中1-5d生长速度较为一致，之后ppl培养细胞生长速度逐渐并一直高于pbs培养细胞；pamsc与pbmsc的生长趋势较为类似，不同的是pbmsc细胞培养第四天后，ppl培养细胞生长速度明显高于fbs，差异十分明显，整体而言细胞培养后期ppl 培养细胞生长速度高于fbs。
[0079]
实施例6：细胞长期连续传代增殖曲线的绘制：
[0080]
为测定ppl长期培养细胞中细胞增殖速度的特性，本发明将分离获得的paf、pef、
pamsc、pbmsc细胞分别接种于含5％ppl与含 10％fbs培养基中进行连续传代，每当细胞达到80％以上汇合度时进行传代，根据细胞的生长节奏调整传代比例为1:3或1:4。在试验的基础上记录每次传代扩增倍数与传代时间，采集相关数据并使用 graphpadprism8绘制细胞增殖曲线图(图4)细胞倍增时间对比图(图5)。
[0081]
结果表明在pef培养初期(前6代)，5％ppl条件下与10％fbs条件下接近，传代节奏完全一致。当细胞培养到达7代以后，ppl条件下的细胞生长速度逐渐超过pef条件下的生长速度。在时长约为30天的长期培养中，细胞扩增倍数均达到了106倍以上。与之类似，paf在采用ppl培养初期，fbs条件下细胞增殖速度较快，经6次传代后ppl 条件下细胞增殖速度逐渐超过了fbs。在时长约为30天的长期培养中，细胞扩增倍数均达到了105倍以上。在这种情况下，ppl条件下paf与 pef的平均倍增时间小于fbs培养条件下的平均倍增时间。这一试验结果同时还表明，pef细胞在生长速度方面优于paf。结果同时也表明利用ppl培养猪成纤维类细胞具有可行性。
[0082]
另一方面，在pamsc和pbmsc的培养中，5％ppl条件下培养的两类细胞生长速度远超10％fbs条件。经过30天左右的培养，5％ ppl条件下培养的pamsc和pbmsc比10％fbs条件下的细胞增殖总量高出近一个数量级。此外，两类成体间充质干细胞在5％ppl条件下的生长速率和传代节奏几乎完全一致，与paf的生长情况相接近， ppl条件下pamsc和pbmsc的平均倍增时间比fbs培养条件下的平均倍增时间减少约6.6h。说明在猪间充质干细胞类细胞的培养中， ppl比fbs具有明显的优势。
[0083]
以上结果共同表明，在猪间充质来源的细胞的培养中，较低浓度的 ppl(5％)即可达到甚至超过10％fbs条件下细胞的生长速度，在时长为一个月左右的长期传代中，细胞扩增速率基本可以保持一致。
[0084]
实施例7：细胞免疫荧光实验
[0085]
a)取待染色的细胞，充分移弃培养基，用150μl的dpbs缓冲液漂洗(沿壁缓慢加入，移液泵低档吸走)一遍；b)加入4℃预冷的4％多聚甲醛固定液或甲丙固定液150μl，固定15min后吸弃固定液；c)加入150μl dpbs缓冲液漂洗细胞三遍d)加入150μl 1％bsa，室温封闭2h；e)除去封闭液，用1％bsa稀释一抗，将稀释后的一抗加入细胞培养皿中，孵育0.5h后，吸走抗体再重新加入，4℃孵育14～16h；f) 吸净一抗，加入150μl dpbs缓冲液漂洗3
×
5min，加入80μl二抗工作液室温孵育1h；)除去二抗，细胞用dpbs缓冲液漂洗3
×
5min，加入80μl hoechest33342工作液，室温避光孵育10min)倒置荧光显微镜下观察并拍摄试验结果。结果见图6-7。结果表明ppl培养细胞不会改变细胞表面特异性抗原的表达。
[0086]
实施例8：msc成软骨诱导分化鉴定：
[0087]
将分离获得的pamsc、pbmsc细胞分别接种于含8％ppl与含 10％fbs培养基中，连续传代，并取p3代对数生长期细胞，接种于预铺0.1％明胶的12孔板中，每孔接种2
×
104个细胞。当细胞汇合度达到 50-60％时更换成软骨诱导培养基，成软骨诱导培养基为αmem添加 8％pl/10％fbs、lμmol/l地塞米松、50μg/ml维生素c、0.5mmol/l 丙酮酸钠、0.01mol/l its，每2-3d换液，诱导培养21d。对细胞进行阿利新蓝染色鉴定。
[0088]
切片结果表明，经过21天的诱导，pamsc和pbmsc在ppl和 fbs培养条件下都可以分化成类软骨组织并分泌制造软骨间质(切片中蓝色部分)，证明pamsc、pbmsc细胞在ppl培养条件下同样具有潜在的分化能力和多潜能性(见图8)。
[0089]
根据上述实验，本发明发现在fbs与ppl培养条件下的无明显的细胞形态学差异。免疫荧光结果显示各细胞表面特异性抗体在不同培养条件下也无改变，表明使用fbs与ppl培养上述细胞均有一定的稳定性。根据细胞生长曲线及传代曲线，本发明可以清晰的观察到，不论是特定代次的培养还是长期传代培养，ppl提高了细胞的增殖速度，并潜在增加了大规模细胞培养的优势。
[0090]
本发明的说明书中，说明了大量具体细节。然而，能够理解，本发明的实施例可以在没有这些具体细节的情况下实践。在一些实例中，并未详细示出公知的方法、结构和技术，以便不模糊对本说明书的理解。
[0091]
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。