睾酮检测试剂盒及其制备方法与流程

1.本发明属于免疫检测领域，尤其是涉及一种睾酮检测试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.睾酮是一种类固醇激素，由男性睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺少量分泌，睾酮在血液中超过97％以结合蛋白状态存在并循环：大部分与性激素结合球蛋白(shbg)或者睾酮-结合球蛋白(tebg)等血清蛋白结合具有较强的亲和力，睾酮还能够与皮质类固醇结合球蛋白(cbg)和白蛋白进行相对前者的弱结合，游离睾酮的量依赖于shbg的变化。
3.血清睾酮测定在一些内分泌紊乱分析中具有重要的临床意义，在男性中，睾酮测定是性腺功能减退或低下的重要参考指标，同时也用于评价未成年男性性早熟或延迟。与男性相比，正常女性血清睾酮水平较低，但患有雄性激素过多症的女性，如：先天多毛症和肾上腺增生，多囊卵巢综合征等，血清睾酮也作为重要的评价指标。临床和实验室常用的检测方法主要有酶联免疫法、免疫荧光法、化学发光法等。
4.在中国专利文献cn112129955a中公开了一种睾酮检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂r1、试剂r2和试剂r3；所述试剂r1包含链酶亲和素磁微粒和基础缓冲液；所述试剂r2包含被可检测标记物标记的抗睾酮抗体和基础缓冲液；所述试剂r3包含生物素化睾酮和基础缓冲液；所述试剂r2和试剂r3中至少一种还包括抗干扰剂，所述抗干扰剂选自生物素、生物素衍生物中的一种或几种。
5.上述技术方案的睾酮检测试剂盒检测效果不是很理想，究其原因，和试剂种类的选择以及含量有密切关系。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种睾酮检测试剂盒，能够提高睾酮检测的准确度，抗干扰性好，稳定性更好。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该睾酮检测试剂盒包括有试剂r1、试剂r2、试剂r3和试剂r4；其中，所述试剂r1具有链霉亲和素包被的磁性微粒和三羟甲基氨基甲烷tris缓冲液，所述试剂r2为解离剂，所述试剂r3具有吖啶酯标记的鼠抗人t抗体和磷酸盐缓冲液，所述试剂r4具有生物素标记的t衍生物和吗啉乙磺酸mes；
8.还包括有校准品和质控品。
9.检验原理为采用竞争法进行检测，将样本、试剂r2以及生物素标记的鼠抗人睾酮抗体在温育条件下反应，试剂r2(置换剂)释放样本中结合的睾酮，抗体捕获样本中的抗原，形成抗原抗体复合物，加入链霉亲和素包被的磁性微粒以及吖碇酯标记的睾酮牛血清白蛋白结合物在温育条件下反应，后者与释放出的睾酮竞争结合生物素标记的鼠抗人睾酮抗体，形成固相复合物，检测读数：温育结束后，加磁场沉淀，去掉上清液，用清洗液清洗沉淀复合物，并吸干废液，除去未与磁性微粒结合的物质，再将反应杯送入测量室中。泵入激发液，使复合物产生化学发光信号，通过光电倍增器测量发光强度，通过工作曲线计算得出检
测结果。
10.在本发明中，试剂r2为解离剂，释放样本中结合的睾酮，且在试剂r1、试剂r3和试剂r4中均有缓冲液(试剂r4中，吗啉乙磺酸mes是缓冲液)，此外，睾酮检测试剂盒包括有校准品和质控品，检测结果准确度高，抗干扰性好，稳定性更好。
11.优选的，所述试剂r2具有17α-甲基雄甾-17β-醇-3-酮和吗啉乙磺酸mes缓冲液。
12.17α-甲基雄甾-17β-醇-3-酮作为置换剂。
13.优选的，所述试剂r1、所述试剂r2、所述试剂r3和所述试剂r4中均含有防腐剂proclin300；在所述试剂r2中，所述17α-甲基雄甾-17β-醇-3-酮为0.20mg/l，所述吗啉乙磺酸mes缓冲液为50mmol/l。
14.优选的，所述校准品和质控品为冻干粉状态的睾酮抗原；所述防腐剂proclin 300为1g/l。
15.优选的，在所述试剂r1中，所述链霉亲和素包被的磁性微粒为2.5g/l，所述三羟甲基氨基甲烷tris缓冲液为50mmol/l；在所述试剂r3中，所述吖啶酯标记的鼠抗人t抗体为0.15mg/l，所述磷酸盐缓冲液为100mmol/l；在所述试剂r4中，所述生物素标记的t衍生物为0.78mg/l，所述吗啉乙磺酸mes为100mmol/l。
16.本发明要解决的另一个问题是提供一种睾酮检测试剂盒的制备方法，所述睾酮检测试剂盒包括有试剂r1、试剂r2、试剂r3和试剂r4，包括以下步骤：
17.s1所述试剂r1的制备：取直径1um链霉亲和素包被的磁性微粒，用磁珠稀释液稀释浓度，搅拌混匀；
18.s2所述试剂r3的制备：将一株针对t抗原表位的鼠抗人t抗体，与吖啶酯混合后进行吖啶酯标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到一株针对t抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人t抗体；
19.将得到的一株针对t抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人t抗体用稀释液稀释浓度；
20.s3所述试剂r4的制备：将t衍生物用缓冲液稀释浓度，与生物素混合后进行生物素标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到生物素标记的t衍生物；
21.将得到的生物素标记的t衍生物用稀释液稀释浓度；
22.s4分装试剂：将制备好的所述试剂r1、所述试剂r3和所述试剂r4进行分装，于2-8℃避光存储；
23.所述睾酮检测试剂盒还包括有校准品和质控品，所述试剂r2为解离剂。
24.优选的，在所述步骤s1中，磁珠稀释液包含tris作为缓冲剂，bsa作为封闭剂和proclin300作为防腐剂；在所述步骤s2中，稀释液包括二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠作为缓冲剂，bsa、酪蛋白作为封闭剂，proclin 300作为防腐剂，tween-20作为表面活性剂；在所述步骤s3中，稀释液的主要成分为mes。
25.优选的，在所述步骤s2和所述步骤s3中，均采用zeba脱盐离心柱进行离心脱盐纯化进行离心脱盐纯化；在所述步骤s2和所述步骤s3中，进行标记时，均是在37℃反应90分钟进行标记。
26.其中，zeba脱盐离心柱为7k mwco，0.5ml货号：89883规格。
27.优选的，还包括有步骤s5贴标：将射频卡粘贴在试剂盒上，再将标签覆盖与所述射频卡之上；所述射频卡含有试剂批号、盒号、使用期限、项目代码、项目名称和试剂规格信
息。
28.优选的，在所述步骤s1中，链霉亲和素包被的磁性微粒用磁珠稀释液稀释至2.5g/l的浓度；在所述步骤s2中，每株鼠抗人t抗体与吖啶酯的摩尔比为1:10，将得到的一株针对t抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人t抗体用稀释液配成0.15mg/l的浓度；在所述步骤s3中，将t衍生物用缓冲液稀释至0.78mg/l的浓度，t衍生物与生物素的摩尔比为1:10，将得到的生物素标记的t衍生物用稀释液配成0.78mg/l的浓度。
具体实施方式
29.下面结合本发明的实施方式进一步详细说明：
30.本发明的睾酮检测试剂盒，包括有试剂r1、试剂r2、试剂r3和试剂r4；其中，所述试剂r1具有链霉亲和素包被的磁性微粒和三羟甲基氨基甲烷tris缓冲液，所述试剂r2为解离剂，所述试剂r3具有吖啶酯标记的鼠抗人t抗体和磷酸盐缓冲液，所述试剂r4具有生物素标记的t衍生物和吗啉乙磺酸mes；
31.还包括有校准品和质控品。
32.所述试剂r2具有17α-甲基雄甾-17β-醇-3-酮和吗啉乙磺酸mes缓冲液。
33.所述试剂r1、所述试剂r2、所述试剂r3和所述试剂r4中均含有防腐剂proclin 300；在所述试剂r2中，所述17α-甲基雄甾-17β-醇-3-酮为0.20mg/l，所述吗啉乙磺酸mes缓冲液为50mmol/l。
34.所述校准品和质控品为冻干粉状态的睾酮抗原；所述防腐剂proclin 300为1g/l。
35.在所述试剂r1中，所述链霉亲和素包被的磁性微粒为2.5g/l，所述三羟甲基氨基甲烷tris缓冲液为50mmol/l；在所述试剂r3中，所述吖啶酯标记的鼠抗人t抗体为0.15mg/l，所述磷酸盐缓冲液为100mmol/l；在所述试剂r4中，所述生物素标记的t衍生物为0.78mg/l，所述吗啉乙磺酸mes为100mmol/l。
36.本实施例中的睾酮检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
37.s1所述试剂r1的制备：取直径1um链霉亲和素包被的磁性微粒，用磁珠稀释液稀释浓度，搅拌混匀；
38.s2所述试剂r3的制备：将一株针对t抗原表位的鼠抗人t抗体，与吖啶酯混合后进行吖啶酯标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到一株针对t抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人t抗体；
39.将得到的一株针对t抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人t抗体用稀释液稀释浓度；
40.s3所述试剂r4的制备：将t衍生物用缓冲液稀释浓度，与生物素混合后进行生物素标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到生物素标记的t衍生物；
41.将得到的生物素标记的t衍生物用稀释液稀释浓度；
42.s4分装试剂：将制备好的所述试剂r1、所述试剂r3和所述试剂r4进行分装，于2-8℃避光存储；
43.所述睾酮检测试剂盒还包括有校准品和质控品，所述试剂r2为解离剂。
44.制备得到的睾酮检测试剂盒包括有试剂r1、试剂r2、试剂r3和试剂r4。
45.在所述步骤s1中，磁珠稀释液包含tris作为缓冲剂，bsa作为封闭剂和proclin 300作为防腐剂；在所述步骤s2中，稀释液包括二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠作
为缓冲剂，bsa、酪蛋白作为封闭剂，proclin 300作为防腐剂，tween-20作为表面活性剂；在所述步骤s3中，稀释液的主要成分为mes。
46.在所述步骤s2和所述步骤s3中，均采用zeba脱盐离心柱进行离心脱盐纯化；在所述步骤s2和所述步骤s3中，进行标记时，均是在37℃反应90分钟进行标记。
47.还包括有步骤s5贴标：将射频卡粘贴在试剂盒上，再将标签覆盖与所述射频卡之上；所述射频卡含有试剂批号、盒号、使用期限、项目代码、项目名称和试剂规格信息。
48.在所述步骤s1中，链霉亲和素包被的磁性微粒用磁珠稀释液稀释至2.5g/l的浓度；在所述步骤s2中，每株鼠抗人t抗体与吖啶酯的摩尔比为1:10，将得到的一株针对t抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人t抗体用稀释液配成0.15mg/l的浓度；在所述步骤s3中，将t衍生物用缓冲液稀释至0.78mg/l的浓度，t衍生物与生物素的摩尔比为1:10，将得到的生物素标记的t衍生物用稀释液配成0.78mg/l的浓度。
49.在本实施例中，试剂盒1的试剂r1、试剂r2、试剂r3和试剂r4的具体组分和含量如下表1所示：
50.表1：
[0051][0052]
表1中的生物素化睾酮即为生物素标记的t衍生物；
[0053]
在本实施例中，试剂盒2的试剂r1、试剂r2、试剂r3和试剂r4具体组分和含量如下表2所示：
[0054]
表2：
[0055][0056]
表2中的生物素化睾酮即为生物素标记的t衍生物；
[0057]
将上述试剂盒1和试剂盒2进行抗干扰性测试，结果如下表3所示：
[0058][0059]
从上述测试结果来看，试剂盒1的抗干扰性较好，试剂盒1的偏差相对试剂盒2的偏差较小。
[0060]
将上述试剂盒1和试剂盒2进行稳定性测试，结果如下表4所示：
[0061]
表4：
[0062][0063]
从上述测试结果来看，试剂盒1的稳定性较好，试剂盒1的信号保留率相对试剂盒2的信号保留率较高；表中的a、b、c、d、e表示不同浓度的校准品编号，浓度即为编号后面的数值，单位为ng/ml。
[0064]
发明人经过研究发现，试剂盒1中试剂r4的生物素浓度对于试剂盒的抗干扰性有影响，具体数据表格如下表5所示：
[0065]
表5：
[0066][0067]
结果显示，生物素的浓度为30ng/ml抗干扰性最好。
[0068]
采用本实施例的睾酮检测试剂盒进行睾酮检测时，检测结果出来后，阳性判断值或者参考区间如下表6、7所示：
[0069]
血清表6：
[0070]
参考人样95％参考区间(ng/ml)男性1.75-7.81女性＜0.100-0.750
[0071]
血浆、全血，表7：
[0072]
参考人群95％参考区间(ng/ml)男性1.68-7.58女性≤0.100-0.900
[0073]
由于地理、人种、性别和年龄等差异，建议建立自己的参考范围；睾酮项目的默认结果单位使用ng/ml或nmol/l(换算因子：ng/ml
×
3.47＝nmol/l)。
[0074]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。