腺苷脱氨酶及其修饰物在制备糖尿病伤口修复药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，涉及一种腺苷脱氨酶及其修饰物在制备糖尿病伤口修复药物中的应用。


背景技术：

2.约20％的糖尿病患者会出现伤口修复困难。腿部或足部溃疡是糖尿病患者最常见的伤口。糖尿病伤口修复困难导致的糖尿病足是最严重的并发症，也是糖尿病患者致残的主要原因之一。糖尿病足发病机制尚不完全清楚，目前认为血脂、血糖代谢紊乱与其发生密切相关，糖尿病足的发生与慢性周围血管病变和周围神经病变密切相关。首先，糖尿病患者由于神经病变使下肢保护功能减退。其次，糖尿病患者由于长期高血糖导致动脉硬化发生微循环障碍，局部组织缺血和抵抗力下降，微小的创伤均可引起感染而形成溃疡加大。糖尿病患者的葡萄糖代谢能力下降，高血糖进一步复杂化伤口修复过程，可能会导致慢性伤口修复停滞，故病程迁延不愈，给患者及家庭带来极大的痛苦和经济负担。所以强调糖尿病足的早期治疗，以防坏疽的发生，这对保存患肢，减少费用，提高生活质量极其重要。
3.血浆小分子腺嘌呤核苷酸的升高是所有2型糖尿病的一个新的重要病理特征。腺苷脱氨酶(ada)(ec 3.5.4.4)是一种嘌呤分解代谢酶，将腺苷转化为肌苷，从而有助于降低组织和细胞中存在的腺苷水平，目前腺苷脱氨酶在临床上常被用来检测和表征一些器官和免疫疾病，如伤寒、肝脏疾病、透析性腹膜炎、重症联合免疫缺陷病等(李翔云,张泽明,李薇.腺苷脱氨酶活性测定及其与临床疾病的相关性研究进展[j].世界最新医学信息文摘,2018,18(48):28-29.)。聚乙二醇酶(peg-ada)是一种酶制剂，已在全球众多患者中使用，用于检测治疗scid等腺苷脱氨酶缺乏导致的疾病(hershfield,m.(2006).adenosine deaminase deficiency.in m.p.adam(eds.)et.al.,university of washington,seattle.)。目前尚未见腺苷脱氨酶或其修饰物用于治疗糖尿病伤口的报道。


技术实现要素：

[0004]
本发明提供腺苷脱氨酶(ec 3.5.4.4)或其修饰物在制备糖尿病伤口修复药物中的应用。
[0005]
本发明所述的糖尿病包括1型和2型糖尿病，且腺苷脱氨酶及其修饰物在2型糖尿病伤口修复中效果更为显著。
[0006]
本发明所述的腺苷脱氨酶可以为任意方式获得的腺苷脱氨酶，包括但不限于提取自生物组织的天然腺苷脱氨酶、重组的人、动物和微生物来源的腺苷脱氨酶、以及化学合成的腺苷脱氨酶。
[0007]
具体地，在本发明具体实施方式中，采用的腺苷脱氨酶为天然提取牛腺苷脱氨酶或大肠杆菌表达鼠腺苷脱氨酶。
[0008]
本发明所述的腺苷脱氨酶修饰物为对腺苷脱氨酶进行化学修饰，增加其稳定性，延长其半衰期获得的腺苷脱氨酶修饰物，包括但不限于聚乙二醇修饰的腺苷脱氨酶。
[0009]
具体地，在本发明具体实施方式中，采用的腺苷脱氨酶修饰物为聚乙二醇修饰天然提取牛腺苷脱氨酶或聚乙二醇修饰大肠杆菌表达鼠腺苷脱氨酶。
[0010]
本发明所述的糖尿病伤口修复药物为含有腺苷脱氨酶或其修饰物中的一种或多种的组合物，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
[0011]
本发明所述的糖尿病伤口修复药物中腺苷脱氨酶或其修饰物的使用剂量可根据病情适当调整。作为可选方案，腺苷脱氨酶或其修饰物的腹腔注射浓度为0.1～8u/g，优选为5u/g；外用涂抹浓度1～300u/ml，优选为150u/ml。(1u表示在特定条件下每分钟分解1μmol腺苷的腺苷脱氨酶量，u/g表示每克病患体重注射的ada酶活，u/ml表示每ml溶液中ada的酶活)。
[0012]
本发明首次公开了腺苷脱氨酶及其修饰物能够对糖尿病小鼠伤口修复具有明显的促进作用，腺苷脱氨酶作为生物体天然具有的蛋白，免疫原性好，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0013]
图1为天然提取牛腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠伤口修复影响图，对比正常小鼠(空白对照组)、糖尿病小鼠和糖尿病腺苷脱氨酶处理(注射/滴加)组在14天内的伤口变化，所用糖尿病模型为db/db小鼠2型糖尿病模型，腺苷脱氨酶为天然提取牛腺苷脱氨酶，注射浓度5u/g，滴加浓度150u/ml。
[0014]
图2为聚乙二醇修饰天然提取牛腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠伤口修复影响图，对比正常小鼠(空白对照组)、糖尿病小鼠和糖尿病腺苷脱氨酶处理(注射/滴加)组在14天内的伤口变化，所用糖尿病模型为db/db小鼠2型糖尿病模型，腺苷脱氨酶为聚乙二醇修饰天然提取牛腺苷脱氨酶，注射浓度1.5u/g，滴加浓度150u/ml。
[0015]
图3为大肠杆菌表达鼠腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠伤口修复影响图，对比正常小鼠(空白对照组)、糖尿病小鼠和糖尿病腺苷脱氨酶处理(注射/滴加)组在14天内的伤口变化，所用糖尿病模型为链脲佐菌素 高脂饮食诱导2型糖尿病模型，腺苷脱氨酶为大肠杆菌表达鼠腺苷脱氨酶，注射浓度5u/g，滴加浓度150u/ml。
[0016]
图4为聚乙二醇修饰大肠杆菌表达鼠腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠伤口修复影响图，对比正常小鼠(空白对照组)、糖尿病小鼠和糖尿病腺苷脱氨酶处理(注射/滴加)组在14天内的伤口变化，所用糖尿病模型为链脲佐菌素 高脂饮食诱导2型糖尿病模型，腺苷脱氨酶为聚乙二醇修饰大肠杆菌表达鼠腺苷脱氨酶，注射浓度1.5u/g，滴加浓度150u/ml。
具体实施方式
[0017]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例以及附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0018]
以下实施例中采用的各原料，如无特殊说明，均为市售产品。
[0019]
本发明涉及到的腺苷脱氨酶(ec 3.5.4.4)或其修饰物可通过购买或者自制。
[0020]
实施例中采用高脂饮食和链脲佐菌素(stz)诱导的雄性糖尿病小鼠和成年雄性db/db小鼠作为2型糖尿病模型。
[0021]
实施例1
[0022]
天然提取牛腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠伤口修复的影响：
[0023]
1.实验方法
[0024]
1.1糖尿病模型建立：
[0025]
db/db小鼠糖尿病模型：实验采用南京大学模型动物研究中心的雄性db/db糖尿病小鼠(6周龄)。所有小鼠均在标准饲养条件下饲养，12小时光照-12小时黑暗循环，可自由获取食物和水，空腹血糖超过11.1mmol/l的小鼠被视为2型糖尿病小鼠，并被选为后续研究。
[0026]
1.2小鼠伤口模型的建立
[0027]
各组动物使用戊巴比妥钠(1％)麻醉，背部剃毛，于背部最高处用剪刀剪出直径8mm全皮层创口。拍照记录给药后小鼠伤口愈合情况，并以1cm2作标尺，分析各组小鼠伤口愈合情况。
[0028]
1.3分组及给药方式
[0029]
空白对照组：建立小鼠伤口模型，给予对应药物介质(pbs)处理。
[0030]
糖尿病模型组：建立2型糖尿病模型和小鼠伤口模型。给予对应药物介质(pbs)处理。
[0031]
糖尿病腺苷脱氨酶(注射)处理组：建立2型糖尿病模型和小鼠伤口模型。每天腹腔注射天然提取牛腺苷脱氨酶(0.1u/g、0.2u/g、0.4u/g、0.8u/g、1.5u/g、3u/g、5u/g、8u/g)。
[0032]
糖尿病腺苷脱氨酶(滴加)处理组：建立2型糖尿病小鼠模型和伤口模型，每天伤口处滴加牛腺苷脱氨酶(1u/ml、2u/ml、4u/ml、10u/ml、30u/ml、80u/ml、150u/ml、300u/ml)。
[0033]
2.实验结果
[0034]
2.1腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠伤口愈合的影响
[0035]
结果由图1可知，空白对照组伤口在14天左右愈合；
[0036]
与空白对照组相比，糖尿病模型组小鼠伤口愈合速度较慢，14天后伤口面积有30
±
0.5％(该百分比表示该时间点伤口面积/原始伤口面积，下同)。
[0037]
糖尿病腺苷脱氨酶(注射)处理组与糖尿病模型组相比，伤口愈合速度显著加快，14天伤口面积10
±
0.5％；
[0038]
糖尿病腺苷脱氨酶(滴加)处理组与糖尿病模型组相比，伤口愈合速度显著加快，14天伤口面积10
±
0.5％；
[0039]
该结果说明，天然提取牛腺苷脱氨酶能有效加速糖尿病小鼠伤口愈合速度，注射和滴加给药方式同样有效。
[0040]
且注射浓度在0.1-8u/g范围内均有效，治疗效果在有效浓度范围内随浓度升高而先强后弱，最适浓度为5u/g，低于0.1u/g或高于8u/g无效。涂抹滴加浓度在1-300u/ml有效，治疗效果在有效浓度范围内随浓度升高而先强后弱，最适浓度在150u/ml，低于1u/ml或高于300u/ml无效。
[0041]
实施例2
[0042]
聚乙二醇修饰天然提取牛腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠伤口修复的影响：
[0043]
1.实验方法
[0044]
1.1聚乙二醇修饰腺苷脱氨酶(peg-ada)的制备
[0045]
用1ml无菌pbs(10mmol/l，ph9.0)将ada稀释至500u/ml。然后加入分子量为20kda
24.doi:10.3390/molecules23020503】。
[0088]
1.2聚乙二醇修饰腺苷脱氨酶的制备
[0089]
用1ml无菌pbs(10mmol/l，ph9.0)将ada稀释至500u/ml。然后加入分子量为20kda的mpeg-spa，终浓度为100mg/ml，室温混合5h。最后加入pbs(10mmol/l，ph7.4)，将peg-ada稀释至终浓度150u/ml。
[0090]
1.3小鼠糖尿病模型的建立
[0091]
高脂饮食和链脲佐菌素诱导2型糖尿病模型：实验采用南京大学模型动物研究中心的雄性c57bl/6小鼠(8-10周龄)。所有小鼠均在标准饲养条件下饲养，12小时光照-12小时黑暗循环，可自由获取食物和水。喂养4周后，用30mg/kg链脲佐菌素连续3天进行腹腔注射诱导。空腹血糖超过11.1mmol/l的小鼠被视为2型糖尿病小鼠，并被选为后续研究。
[0092]
1.4小鼠伤口模型的建立
[0093]
各组动物使用戊巴比妥钠(1％)麻醉，背部剃毛，于背部最高处用剪刀剪出直径8mm全皮层创口。拍照记录给药后小鼠伤口愈合情况，并以1cm2作标尺，分析各组小鼠伤口愈合情况。
[0094]
1.5分组及给药方式
[0095]
空白对照组：建立小鼠伤口模型。给予对应药物介质(pbs)处理。
[0096]
糖尿病模型组：建立2型糖尿小鼠伤口模型。给予对应药物介质(pbs)处理。
[0097]
糖尿病腺苷脱氨酶(注射)处理组：建立糖尿病模型和小鼠伤口模型。每周腹腔注射聚乙二醇修饰的大肠杆菌表达的鼠腺苷脱氨酶(0.1u/g、0.2u/g、0.4u/g、0.8u/g、1.5u/g、3u/g、5u/g、8u/g)。
[0098]
糖尿病腺苷脱氨酶(滴加)处理组：建立糖尿病db/db小鼠模型和伤口模型，每天伤口处滴加聚乙二醇修饰的鼠腺苷脱氨酶(1u/ml、2u/ml、4u/ml、10u/ml、30u/ml、80u/ml、150u/ml、300u/ml)。
[0099]
2.实验结果
[0100]
2.1腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠伤口愈合的影响
[0101]
结果由图4可知，空白对照组伤口在14天左右愈合；
[0102]
与空白对照组相比，糖尿病模型组小鼠伤口愈合速度较慢，14天后伤口面积仍有30
±
0.5％；
[0103]
而糖尿病腺苷脱氨酶(注射)处理组与糖尿病模型组相比，伤口愈合速度显著加快，14天伤口面积10
±
0.5％；
[0104]
糖尿病腺苷脱氨酶(滴加)处理组与糖尿病模型组相比，伤口愈合速度显著加快，14天伤口面积10
±
0.5％；
[0105]
该结果说明，聚乙二醇修饰的大肠杆菌表达的鼠腺苷脱氨酶能有效加速糖尿病小鼠伤口愈合速度，注射和滴加给药方式同样有效。
[0106]
且注射浓度在0.1-8u/g范围内均有效，治疗效果在有效浓度范围内随浓度升高而先强后弱，最适浓度为1.5u/g，低于0.1u/g或高于8u/g无效。涂抹滴加浓度在1-300u/ml有效，治疗效果在有效浓度范围内随浓度升高而先强后弱，最适浓度在150u/ml，低于1u/ml或高于300u/ml无效。