一种鱼类鳃代谢组学样品前处理优化方法与流程

1.本发明属于代谢组学技术领域，具体涉及一种基于lc-q-tof/ms技术的鱼类鳃代谢组学样品前处理优化方法。


背景技术：

2.代谢组学是研究生物体系受外部刺激或扰动后所产生的内源性代谢物的整体改变及其变化规律的科学。代谢物对外源性影响极其敏感，一个生物体的代谢轮廓，可以被看作是生物系统对遗传或适应环境变化的终端反应结果。因此代谢组学研究可应用于识别暴露于不同环境条件(或培养条件)的细胞、组织、器官或生物之间的生理差异，从这些差异中鉴定出作为识别特定条件的标志性代谢物，并解析特定代谢途径的功能，常用的分析技术有液相色谱质谱联用技术(lc-ms)、气相色谱质谱联用技术(gc-ms)、核磁共振技术(nmr)等，随着科学技术的进步，科学家们发现仅仅利用某个单一技术手段并不能阐明所关注的特定生物学问题，随着系统生物学的发展，代谢组学因其可以和基因组学/转录组学联合分析，深度揭示生命活动的机制机理，因而得到迅速发展，广泛应用于药物毒理、临床疾病及食品营养等领域。由于代谢组学可以揭示生物系统在细胞层面发生的变化，从整体上阐明特定性状发生发展的物质基础和调控机制，因此它为水产良种繁育以及抗逆应激机制研究提供了一种新的有效手段，在水生动物中的研究备受广泛关注。
3.lc-ms是代谢组学分析中应用最广泛的一种技术，常规的实验步骤包括：采集样品、样品制备并检测、数据预处理和通路分析等。其中，规范化的样品采集和制备流程是获得准确代谢组学信息的重要前提，其目的是获得最能体现生物状态的代谢物，最大覆盖范围的提取出样品中的小分子代谢物。由于生物样品中所含物质种类丰富，而其中代谢物的浓度和极性又呈现高度多样性，因此，合理的样品前处理方法在提高代谢物数据的覆盖率、稳定性过程中起着决定性的作用。
4.鳃作为鱼类参与呼吸、离子和渗透调节、酸碱平衡和氨氮排泄的主要功能靶器官，在环境应激与适应性进化下的生理稳态方面起着至关重要的作用。迄今为止，已有研究对血清、血浆、胚胎等生物样品的代谢组学前处理方法进行了考察，但应用于鱼类鳃组织样品的代谢组学前处理方法研究仍未见相关报道。


技术实现要素：

5.为解决背景技术中的问题；本发明的目的在于提供一种基于lc-q-tof/ms技术的鱼类鳃代谢组学样品前处理优化方法。
6.本发明的一种鱼类鳃代谢组学样品前处理优化方法，它的优化方法如下：
7.步骤一：准备仪器与试剂：
8.acquity uplc系统；色谱柱；sciex triple tof 5600

高分辨质谱仪；allegra x-30r高速离心机；组织研磨机；涡旋混匀器；kq 300db型数控超声仪；xs205dy电子天平；milli-q a10超纯水机；200μl、1000μl、5000μl移液器；
9.甲醇、乙腈；甲醇、甲酸；麻醉剂；生理盐水；液氮；
10.数据处理软件系统：progensis qi；micrsoft office excel；graphpad prism 8.0；
11.步骤二：uplc-q-tof/ms数据采集与分析：
12.(2.1)、样品的采集与制备：
13.实验前，实验鱼在室内控温循环养殖设备中暂养1周，实验用水为过滤、曝气72h的自来水，水温为24
±
1℃，每天保持12-14h的光照条件，遵照三定三巡的模式管理；采样前24h停止喂食，将鱼转移至含有40mg/l麻醉剂溶液中，深度麻醉后置于冰上解剖，快速取出鳃组织，用无菌生理盐水润洗，吸水纸擦干后用液氮速冻，再转移至-80℃冰箱保存待测；
14.取出-80℃保存的鳃组织样品于4℃解冻，准确称重30mg，加入480μl甲醇和5个钢珠，用组织研磨机60hz研磨30s，冰水浴超声处理10min，4℃下13000rpm离心15min，取300μl的上层溶液，过0.22μm有机相滤膜至进样瓶中待测；同时，将所有鳃组织等量混合，采用经优化后的鳃组织前处理方法制备qc样品，用于方法学考察；
15.(2.2)、uplc-q-tof/ms分析：
16.色谱分离过程在acquity uplc系统上进行，色谱柱为waters acquity uplc beh c18，预柱为acquity uplc beh c
18
vanguard pre-column。液相条件：柱温为40℃，自动进样器温度为4℃；正离子扫描：流动相a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈；负离子扫描：流动相a为水，b为乙腈；梯度洗脱：0～4min，95％～30％a；4～11min，30％～15％a；11～12min，15％～0％a；12～13min，0％a；13～13.2min，0％～95％a；13.2～15min，95％a，流速设为0.3ml/min；
17.质谱条件：在正负离子模式下扫描数据，正负离子源电压为5500v/-4500v，离子源温度为550℃，裂解电压为80v/-80v，碰撞能量为35ev/-35ev，碰撞能量扩展为15ev；氮气用作雾化气体和辅助气体，gas1和gas2的压力为55psi，气帘气压力为35psi；开启动态背景扣除，并设置ida响应值超过100cps的8个峰用于二次质谱扫描；一级质谱的母离子和子离子扫描范围为50-1500da，进样量10μl；
18.(2.3)、数据处理和统计分析：
19.将uplc-q-tof/ms获得的原始数据导入progensis qi软件，以完成峰对齐、峰识别、滤噪、峰匹配等数据预处理，使用峰面积对原始数据进行归一化处理，并输出由保留时间、精确质核比、样品名称及峰强度等信息组成的二维矩阵数据；
20.使用micrsoft office excel、graphpad prism 8.0软件对各预处理方法获得的数据结果进行统计分析。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
22.一、采用uplc-q-tof/ms技术，研究对象为非靶向代谢组学鱼鳃组织样品，对前处理方法中涉及到的液相提取净化方法，进行了优化及方法学考察，基于覆盖率(检测到的潜在代谢物的数量)、稳定性(代谢物相对峰面积和保留时间的rsd)进行了分析讨论，同时利用qc样品开展了方法学考察，最终建立了适用于鱼鳃组织的uplc-q-tof/ms非靶向代谢组学样品前处理方法；
23.二、在利用非靶向代谢组学技术研究鱼类鳃靶器官的实验过程中，为了提高样品中代谢物的提取效果，基于超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术，对鱼鳃样品的前处理
方法进行了优化。
附图说明
24.为了易于说明，本发明由下述的具体实施及附图作以详细描述。
25.图1为本发明中不同种类溶剂的提取效果图，其中图1a为总离子流图总峰面积图，图1b为潜在代谢物数目及rsd分布图；图1c为不同极性代谢物在不同提取溶剂下的信号丰度图。
26.图2为本发明中不同体积溶剂的提取效果图；其中图2a为总离子流图总峰面积图，图2b为潜在代谢物数目及rsd分布图。
27.图3为本发明中不同温度下的提取效果图，其中图3a为总离子流图总峰面积图，图3b为潜在代谢物数目及rsd分布图；图3c为不同极性代谢物在不同提取溶剂下的信号丰度图。
28.图4为本发明中鳃组织前处理流程图。
具体实施方式
29.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图中示出的具体实施例来描述本发明。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。本说明书附图所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
30.在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
31.本具体实施方式采用以下技术方案：它的优化方法如下：
32.一、仪器与试剂：
33.acquity uplc系统(美国waters公司)；色谱柱：waters acquityuplc beh c
18
色谱柱(50mm
×
2.1mm，1.7μm)，acquity uplc beh c
18
vanguard pre-column预柱(2.1mm
×
5mm，1.7μm)；sciex triple tof 5600

高分辨质谱仪(美国ab sciex公司)；allegra x-30r高速离心机(美国beckman公司)；组织研磨机(上海净信实业发展有限公司)；涡旋混匀器(德国ika公司)；kq 300db型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)xs205dy电子天平(瑞士mettler toledo公司)；milli-q a10超纯水机(美国millipore公司)；200μl、1000μl、5000μl移液器(德国eppendorf公司)。
34.甲醇、乙腈(质谱纯，德国merck公司)；甲醇、甲酸(色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；ms-222(美国sigma aldrich公司)；生理盐水(哈尔滨三联药业股份有限公司)；液氮(哈尔滨市黎明气体有限公司)。
35.数据处理软件系统：progensis qi(美国waters公司)；micrsoft office excel(美国micrsoft公司)；graphpad prism 8.0(美国graphpad公司)。
36.二、uplc-q-tof/ms数据采集与分析：
37.2.1、样品的采集与制备：
38.实验所用的方正银鲫购自方正县方正银鲫国家良种场。实验前，实验鱼在室内控温循环养殖设备中(100cm
×
85cm
×
55cm
×
3)暂养1周，实验用水为过滤、曝气72h的自来水，水温为(24
±
1)℃，每天保持12-14h的光照条件，遵照三定三巡(定时定点定量)的模式管理。采样前24h停止喂食，将鱼转移至含有40mg/l麻醉剂(ms-222)溶液中，深度麻醉后置于冰上解剖，快速取出鳃组织(鳃丝)，用无菌生理盐水润洗，吸水纸擦干后用液氮速冻，再转移至-80℃冰箱保存待测。
39.取出-80℃保存的鳃组织样品于4℃解冻，准确称重30mg，加入480μl甲醇和5个钢珠，用组织研磨机60hz研磨30s，冰水浴超声处理10min，4℃下13000rpm离心15min，取300μl的上层溶液，过0.22μm有机相滤膜至进样瓶中待测。同时，将所有鳃组织等量混合，采用经优化后的鳃组织前处理方法制备qc样品，用于方法学考察。
40.2.2、uplc-q-tof/ms分析：
41.色谱分离过程在acquity uplc系统上进行，色谱柱为waters acquity uplc beh c18，预柱为acquity uplc beh c
18
vanguard pre-column。液相条件：柱温为40℃，自动进样器温度为4℃。正离子扫描：流动相a为0.1％甲酸水溶液(v/v)，b为乙腈；负离子扫描：流动相a为水，b为乙腈。梯度洗脱：0～4min，95％～30％a；4～11min，0％～15％a；11～12min，15％～0％a；12～13min，0％a；13～13.2min，0％～95％a；13.2～15min，95％a，流速设为0.3ml/min。
42.质谱条件：在正负离子模式下扫描数据，正负离子源电压为5500v/-4500v，离子源温度为550℃，裂解电压(dp)为80v/-80v，碰撞能量(ce)为35ev/-35ev，碰撞能量扩展(ces)为15ev。氮气用作雾化气体和辅助气体，gas1和gas2的压力为55psi，气帘气压力为35psi。开启动态背景扣除(dbs)，并设置ida响应值超过100cps的8个峰用于二次质谱扫描。一级质谱的母离子和子离子扫描范围为50-1500da，进样量10μl。
43.2.3、数据处理和统计分析：
44.将uplc-q-tof/ms获得的原始数据导入progensis qi软件，以完成峰对齐、峰识别、滤噪、峰匹配等数据预处理，使用峰面积对原始数据进行归一化处理，并输出由保留时间、精确质核比、样品名称及峰强度等信息组成的二维矩阵数据。
45.使用micrsoft office excel、graphpad prism 8.0软件对各预处理方法获得的数据结果进行统计分析。
46.三、结果与讨论：
47.3.1、前处理方法的选择优化：
48.代谢组学分析中，代谢物种类繁多，且不同代谢物之间的化学性质差异性巨大，不同种类的有机试剂对提取代谢物的极性范围也不尽相同。因此，提取剂是影响从生物样品中检测到内源性代谢物的数量、种类和信号强度的主要因素之一，需要对提取剂进行选择优化。如表1所示，本研究选取了鱼类代谢组学中组织样品前处理常用的5种有机试剂，即甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(1：1，v/v)、甲醇-水(4：1，v/v)、甲醇-水(7：3，v/v)，分别检测由这5种有机试剂处理的样品，如表1所示，统计并计算其获得的图谱总峰面积、检测到的潜在代谢物数目以及相对峰面积rsd，以比较分析这5种有机试剂提取代谢物的效果。
49.如图1a所示，采用甲醇-水(4：1，v/v)处理的鳃组织样品，经uplc-q-tof/ms检测后获得的图谱总峰面积最大，且与除甲醇-水(7：3，v/v)以外的三种方法之间存在显著差异。
50.如图1b所示，就潜在代谢物数目而言，相较于其它种类的有机试剂，采用甲醇-水(4：1，v/v)处理的鳃组织样品，经uplc-q-tof/ms检测后获得的潜在代谢物数目最多，覆盖率最大。在代谢组学分析中，检测到代谢物的相对峰面积rsd小于30％时，一般可代表其特征较稳定。相比于其它各组，甲醇-水(4：1，v/v)处理组中相对峰面积rsd《30％的代谢物占比最大，表明该法稳定性最佳。
51.如图1c所示，选取了葡萄糖(glucose)、l-亮氨酸(l-leucine)、柠檬酸(citric acid)等6种不同极性的内源代表性代谢物，分别考察了其在不同种类有机试剂处理组的信号强度，结果表明，采用甲醇-水(4：1，v/v)处理的鳃组织样品中，这6种代谢物的相对信号强度最大。
52.综上所述，在鱼鳃组织非靶向代谢组学分析中，采用甲醇-水(4：1，v/v)提取样品中的代谢物效果最好。
53.表1 5种有机试剂概述(鳃重量为30mg)
[0054][0055]
由于有机试剂的加入量直接影响样品中蛋白质的去除效果和目标化合物的溶出效率，因此，需要对提取剂用量进行考察。参考相关代谢组学研究中组织样品的前处理文献，通过考察不同样品-试剂比(1/13、1/16、1/20和1/25mg/μl)，来比较分析提取剂用量对代谢物提取效果的影响。
[0056]
结果表明，1/16mg/μl处理组获得的图谱总峰面积最大，优于1/13mg/μl，且与其余两组之间存在显著性差异(如图2a)。就代谢物的覆盖率而言，相比于其它组，1/16mg/μl处理组获得的潜在代谢物数量最多，且稳定性良好(如图2b)。
[0057]
在代谢组学样品前处理过程中，提取温度能显著影响代谢物的提取效果。为进一步提高代谢物的提取效果，本研究对提取剂温度进行了考察优化。采取：
①
在鳃组织中加入480μl常温(25℃)80％甲醇水溶液(v/v)；
②
在鳃组织中加入480μl经4℃预冷的80％甲醇水溶液(v/v)，经组织研磨机充分研磨后冰水浴超声10min；
③
以及将加入4℃预冷的80％甲醇水溶液(v/v)的匀浆液进一步置于-20℃环境中静置30min，考察这3种方法对鳃组织中代谢
物提取效果的影响。
[0058]
3.2、方法学考察结果：利用qc样品，对经选择优化后的样品前处理方法进行了方法学考察，包括仪器精密度、方法精密度和样品稳定性考察，结果如表2所示。
[0059]
表2仪器精密度、方法精密度和稳定性实验结果(n＝6)
[0060][0061][0062]
3.2.1、仪器精密度考察：取qc单独样品，连续进样6次，进行uplc-q-tof/ms分析，分别统计选择的6种代谢物的相对峰面积和保留时间，并计算其rsd。结果表明：这6种代谢物的相对峰面积的rsd范围为4.2％～10.8％，保留时间的rsd均小于3.0％，表明仪器精密度良好。
[0063]
3.2.2、方法精密度考察：取6份平行qc样品，进行uplc-q-tof/ms分析，统计6种代谢物的相对峰面积和保留时间，并计算其rsd。结果表明，这6种代谢物的相对峰面积的rsd范围为5.7％～14.05％，保留时间的rsd范围为1.43％～4.65％，表明该方法的精密度良好。
[0064]
3.2.3、样品稳定性试验：取qc单独样品，分别在0、6、12、18、24和48h六个时间点进行uplc-q-tof/ms分析，统计6种代谢物的相对峰面积和保留时间，并计算其rsd。结果表明，6种代谢物相对峰面积的rsd范围为4.62％～17.31％，保留时间的rsd均小于3.0％，表明该方法处理的样品在48h内稳定性良好。通过方法学考察后，最终确定的鱼鳃组织前处理方法流程如图4所示。
[0065]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0066]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。