一种组培与扦插结合的落羽杉快繁方法与流程

1.本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种组培与扦插结合的落羽杉快繁方法。


背景技术：

2.落羽杉(taxodium distichum(l.)rich.)为柏科落羽杉属的古老孑遗植物，其树形高大优美，叶片秀丽似羽毛，生长速度快且适应性强，能够耐水湿、低温、土壤贫瘠，病虫害少，广泛应用于生态防护、园林绿化和工业用材。此外，落羽杉叶片和果实中的挥发油具有明显的抑菌活性。
3.相关研究发现，落羽杉的种子败育率高，并且播种繁殖前需要对其进行沙藏处理，持续时间较长，操作繁琐；另外，扦插繁育时枝条的采集易受到数量与季节的限制。迄今为止，有关落羽杉的愈伤组织诱导及分化的方法尚未见报道。因此，通过组织培养技术开展落羽杉的无性繁殖研究非常重要，可为落羽杉良种的扩繁提供理论和技术支持。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种组培与扦插结合的落羽杉快繁方法，可快速产生大量落羽杉小苗。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种组培与扦插结合的落羽杉快繁方法，包括以下步骤：
7.1)从落羽杉优良母树上采取外植体，外植体为嫩叶、半木质化茎段或茎尖，对外植体进行消毒；
8.2)将步骤1)所得无菌外植体接入愈伤组织诱导培养基中，诱导出愈伤组织；
9.3)将步骤2)所得愈伤组织接种至增殖培养基中进行愈伤组织增殖培养；
10.4)将增殖后的愈伤组织接种至不定芽诱导培养基中，诱导出不定芽；
11.5)对不定芽进行伸长生长及壮苗处理后，将其切下进行扦插生根培养，获得落羽杉小苗。
12.进一步地，步骤1)中，所述外植体为半木质化的茎段，茎段切口为45℃斜角。
13.进一步地，步骤2)中，所述愈伤组织诱导培养基为ms tdz 0.3mg/l 6-ba 0.2mg/l naa 0.1mg/l vc 5mg/l 蔗糖30g/l 琼脂8g/l。
14.进一步地，步骤3)中，所述愈伤组织增殖培养基为ms naa 0.1～0.3mg/l 6-ba 0.2mg/l tdz 0.2～0.3mg/l vc 5mg/l 蔗糖30g/l 琼脂8g/l。
15.进一步地，步骤3)中，愈伤组织增殖培养过程中愈伤组织25d继代一次。
16.进一步地，步骤4)中，所述不定芽诱导培养基为：基本培养基 6-ba 0.3mg/l naa 0.1mg/l vc 5mg/l 蔗糖30g/l 琼脂8g/l，所述基本培养基为ms、wpm或mlv。
17.进一步地，步骤5)中，所述不定芽伸长生长与壮苗处理所用的培养基为dcr基本培养基 蔗糖30g/l 琼脂8g/l。
18.进一步地，步骤5)中，枝条扦插前在3
‰
的iaa溶液中浸泡2min。
19.进一步地，步骤5)中，扦插基质为泥炭土和珍珠岩混合而成(体积比：2∶1)。
20.进一步地，步骤2)～5)的培养条件具体为：组培时培养温度为25℃，光照采用白炽灯光源，光照时间16h/d，光强为260
±
30μmol
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s-1
，空气相对湿度42～43％；扦插培养时将空气相对湿度调整为70～80％，其余条件同组培。
21.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
22.相比于现有技术，本发明的组培与扦插结合的落羽杉快繁方法，所用的外植体材料为落羽杉的嫩叶、半木质化茎段和茎尖，其中，半木质化的茎段诱导愈伤组织的效果较好，后期诱导不定芽时繁殖效率高，也不受季节限制。
23.针对落羽杉组培生根慢的问题，该方法中我们采用室内扦插生根的方法，操作简单、成本低，约3周即可快速诱导出大量的白色肉质根，大大缩短了生根周期。此外，室内扦插的方法不受季节限制且省去了以往组培苗的炼苗环节，显著提高了成活率。
24.经过愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、愈伤组织的诱导不定芽、伸长生长及壮苗处理以及扦插生根培养，即可得到大量落羽杉小苗，有效解决了落羽杉通过愈伤组织途径实现植株再生的问题。建立了落羽杉高效、稳定的组培体系，结合扦插的方式解决了其良种扩繁问题，利于落羽杉优良品种在市场上的推广。
附图说明
25.图1是不同基本培养基对茎段愈伤组织增殖的影响；
26.图2是4种茎段愈伤组织的状态；
27.图3是ms基本培养基附加激素对茎段愈伤组织诱导不定芽的影响；
28.图4是wpm基本培养基附加激素对茎段愈伤组织诱导不定芽的影响；
29.图5是mlv基本培养基附加激素对茎段愈伤组织诱导不定芽的影响；
30.图6是不定芽伸长生长及壮苗后的状态；
31.图7是不定芽扦插生根的状态。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
33.从落羽杉优良母树上采取外植体，外植体包括嫩叶、半木质化茎段和茎尖，对外植体进行消毒；用75％乙醇消毒1min，2.5％次氯酸钠消毒8min，并加入适量的吐温，消毒过程中要不断晃动，使消毒液与外植体充分接触，倒去次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗3～4次。将无菌的外植体置于干燥的滤纸上，吸去表面的水分，之后将它们接种至愈伤诱导培养基上。培养条件为25℃，空气相对湿度42～43％，光照采用白炽灯光源，光照时间16h/d，光强为260
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。
34.实施例中所有愈伤组织诱导、增殖及不定芽诱导的培养基组合中，均设置至少30个重复。
35.数据统计与分析：采用graphpad prism version 8.0(graphpad software，la jolla，ca，usa)对试验数据进行统计处理并制表作图，图表中所示数据均为重复测定的平均值和标准误差。
[0036][0037][0038][0039]
实施例1：一种组培与扦插结合的落羽杉快繁方法，包括以下步骤：
[0040]
(1)愈伤组织诱导：
[0041]
愈伤组织诱导的培养基配方为：基本培养基 tdz 0.3mg/l 6-ba 0.2mg/l naa 0.1mg/l vc 5mg/l 蔗糖30g/l 琼脂8g/l；培养条件为25℃，空气相对湿度42～43％，光照采用白炽灯光源，光照时间16h/d，光强为260
±
30μmol
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。
[0042]
从表1中可以发现，嫩叶在6种基础培养基中均不能诱导出愈伤组织，外植体均会褐化死亡。茎尖在ms和b5培养基上可以诱导出愈伤组织，ms培养基的效果更好。光培养1周左右半木质化的茎段会脱分化形成愈伤组织，不同基本培养基对落羽杉茎段愈伤组织诱导的效果如表1所示，结果显示：ms培养基的愈伤组织诱导率最高，约为86.7％，其次为1/2ms基本培养基，而其它基本培养基均未诱导出愈伤组织。综上，半木质化的茎段是诱导愈伤组织的最佳外植体。
[0043]
表1不同基本培养基对落羽杉外植体愈伤组织诱导的影响
[0044][0045]
(2)茎段愈伤组织的增殖
[0046]
将愈伤组织接种至增殖培养基中，增殖培养基配方为：基本培养基 naa 0.1～0.3mg/l 6-ba 0.2mg/l tdz 0.2～0.3mg/l vc 5mg/l 蔗糖30g/l 琼脂8g/l；培养条件为25℃，空气相对湿度42～43％，光照采用白炽灯光源，光照时间16h/d，光强为260
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30μmol
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。愈伤组织25d继代一次。
[0047]
结果表明：增殖培养45天时，称取愈伤组织的质量计算愈伤增殖系数，发现以ms为基本培养基的增殖效果最好，增殖系数平均达到7.43，显著高于wpm和dcr基本培养基(图1)。增殖形成的愈伤组织主要包括4种状态：(1)愈伤组织呈绿色，质地较硬(图2-a)；(2)愈伤组织呈深黄色，表面为颗粒状凸起(图2-b)；(3)愈伤组织呈黄绿色，质地松软(图2-c)；(4)愈伤组织呈米白色，质地较硬(图2-d)。其中，呈黄绿色、质地松软的愈伤组织分裂旺盛、状态较好(图2-c)，可用于后期的不定芽诱导。
[0048]
(3)茎段愈伤组织诱导不定芽：
[0049]
将黄绿色、质地松软的愈伤组织接种至不定芽诱导培养基中，诱导培养基是以ms、wpm和mlv为基本培养基附加6-ba、tdz、naa和zt，再分别加入蔗糖至30g/l、加入琼脂至8g/l。在ms附加激素的培养基中可以发现，加入适量的6-ba和naa，愈伤组织会变得蓬松，在30d时可分化出明显的不定芽芽点(图3左)，60d时不定芽的结构更加明显(图3右)，据统计，诱导率最高可达96.7％(表2)。当培养基中同时加入6-ba、naa和zt时，不定芽诱导率会有所降低。此外，当培养基中加入tdz处理时，愈伤组织不能分化出不定芽，可以发现tdz不适用于不定芽的诱导。
[0050]
表2 ms基本培养基及不同激素配比对不定芽诱导的影响
[0051][0052][0053]
在wpm附加激素的培养基中可以发现，含有6-ba和naa的培养基均可以诱导分化出不定芽，但是随着zt的加入，诱导率出现降低(表3)。我们发现，30d时，在愈伤团的表面出现明显的绿色或者黄绿色的芽点(图4左)，但是随着进一步的发育，芽点的表面会生长出质地松软、颜色透明的愈伤组织，使得芽点不能进一步发育(图4右)。同样地，当培养基中含有tdz时，愈伤组织不能分化出不定芽。
[0054]
表3 wpm基本培养基及不同激素配比对不定芽诱导的影响
[0055][0056]
在mlv附加激素的培养基中可以发现，含有6-ba 0.2～0.3mg/l、naa0.1～0.3mg/l以及zt 0.1mg/l的培养基均可以诱导出不定芽，诱导率最高可达63％(表4)。可以发现，30d时，在愈伤团的表面出现明显的绿色芽点，叶片组织发达(图5左)，但是这些组织无法继续发育，后期会逐渐褐化死亡(图5右)。同样地，当培养基中含有tdz时，愈伤组织不能分化出不定芽。
[0057]
表4 mlv基本培养基及不同激素配比对不定芽诱导的影响
[0058][0059]
将茎段愈伤组织诱导出的不定芽进行伸长生长及壮苗处理(图6)，所用培养基均为dcr基本培养基 蔗糖30g/l 琼脂8g/l，无需添加其它植物激素。培养条件为25℃，空气相对湿度42～43％，光照采用白炽灯光源，光照时间16h/d，光强为260
±
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。
[0060]
经过2个月左右的伸长生长及壮苗处理，不定芽可生长至高度为5～6cm、直径为0.3cm的半木质化小枝条，此时将其切开，进行扦插生根培养。扦插前，将枝条在3
‰
的iaa溶液中浸泡2min，随后扦插至室内扦插池，培养条件为25℃，空气相对湿度70～80％，光照采用白炽灯光源，光照时间16h/d，光强为260
±
30μmol
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s-1
。扦插基质为泥炭土和珍珠岩混合而成(体积比：2∶1)。
[0061]
扦插培养3周左右时，即可明显观察到枝条周围生长出白色肉质根，显著缩短了生根周期(图7)。此外，室内扦插生根的方法操作简单，成本较低，不受季节限制且省去了以往组培苗的炼苗环节，大大提高了成活率。