一种益生菌组合物及其应用的制作方法

1.本技术属于益生菌技术领域，具体涉及一种益生菌组合物及其应用专利申请事宜。


背景技术：

2.益生菌是一类对宿主有益的活性微生物的统称，通常主要寄居于宿主的肠道内，通过参与营养物质转化吸收或者通过合成相关代谢产物从而对宿主的生命活动发挥有益作用。常见的益生菌主要有酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌等类别。
3.部分研究表明，肠道微生物不仅对于肠道内营养物质转化具有重要作用，还通过“肠脑轴”影响人和动物的相关神经调节活动。即，在外界刺激影响条件下，肠道微生物和肠道细胞会产生各种信号分子，这些信号分子会进一步通过迷走神经激活与中枢神经系统沟通，而中枢神经系统通过分析这些信号后又对肠道和机体产生相应的应激信号，进而指导机体对外界压力和应激产生反应。
4.因为益生菌的安全性和良好的口感适应性，近年来益生菌膳食补充剂作为一类单独产品得到了快速发展。需要注意的是，不同于传统的益生菌产品，酸奶等益生菌发酵产品关注的主要是口味和营养，益生菌活菌数量相对不高，而且需要冷链保存。益生菌酸酸乳类的产品，活菌数较高，但水分高，也需要冷链保存，保质期在一周左右。益生菌膳食补充剂作为一类单独的保健类、添加剂类产品，通常是由高浓度的益生菌冻干粉与益生元组合而成，以粉末状的形式包装于隔绝空气（充氮气）、水分、光照的锡箔条包中，用来实现保护肠道健康、减少过敏反应、提高机体免疫水平等功能目的。
5.作为活性的微生物菌株，由于不同益生菌作用不同，因此合适的益生菌组合、以及如何确保益生菌较高存活率，是确保益生菌发挥相应“益生”功能的重要前提。已有研究认为，益生菌的活菌数往往需要达到100亿/克以上才能确保发挥一定益生菌效果。另一方面，益生菌膳食补充剂产品的货架期通常为12个月，远超常见的益生菌发酵类食品，因此，合适的益生菌菌株组合，是较好确保益生菌膳食补充剂产品功能、产品货架期和延缓益生菌活菌数减少的首要技术前提。


技术实现要素：

6.基于益生菌活性和具体功能用途考虑，本技术目的在于提供一种益生菌组合，在确保不同益生菌组合具有较好的生物活性和稳定性前提下，一方面有助于延长货架期，另一方面在缓解焦虑和改善睡眠方面具有一定有益功能。
7.本技术的技术方案详述如下。
8.一种益生菌组合物，该益生菌组合物包含：短乳杆菌lactobacillus brevis、类干酪乳酪杆菌 lacticaseibacillus paracasei、嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus；优选情况下，该益生菌组合物还含有γ-氨基丁酸、菊粉或茶氨酸，用于协同增强
混合益生菌的活性和稳定性；所述短乳杆菌选择保藏号为cicc 6239的短乳杆菌lactobacillus brevis ；所述类干酪乳酪杆菌选择保藏号为cicc 25051的类干酪乳酪杆菌 lacticaseibacillus paracasei；所述嗜酸乳杆菌选择嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus cicc 6093。
9.所述益生菌组合物中，三种益生菌的活菌数分别不小于150亿/克，γ-氨基丁酸的用量优选为100mg/g。
10.利用所述益生菌组合物所制备的益生菌膳食补充剂，用于缓解焦虑；所述益生菌膳食补充剂，以固体粉末形式为例，除益生菌菌粉组合外，还通常包括有益生元成分（如菊粉、低聚果糖等），以质量百分比计，实际产品中，益生菌菌粉比例一般在10%-50%左右，益生元的添加量通常为50%-80%左右，剩余为少量用于保鲜和保持干燥的辅料成分。
11.前期实验研究过程中，基于食品领域需要，发明人从现有保藏机构中初步筛选获得了20余株乳酸杆菌属菌株，进一步通过体外稳定性、胃酸性环境和胆汁酸盐耐受性等性能需要，对这些菌株进行了进一步复筛。同时，结合外界压力刺激急性应激反应的小鼠模型筛选出了对压力引起的焦虑和抑郁行为有预防和减缓作用的若干菌株。进一步地，以益生菌的活性和稳定性为基础指标，结合其实际功能差异，通过对现有益生菌的选择、组合，获得了一种较好的益生菌组合。另一方面，已有研究表明，γ氨基丁酸（又称gaba），是存在人类大脑中的一种氨基酸，是神经系统中重要的抑制性神经递质。为此，为进一步提高益生菌组合物的缓解精神压力、改善睡眠的益生作用，发明人进一步将益生菌组合物与γ-氨基丁酸进行了复配。而初步实验结果表明，这种复配对于进一步提高活菌数具有有益效果。
12.总体上，本技术通过相关益生菌的复配、组合，以及与gaba的复配，在确保益生菌组合具有较好活性和稳定性前提下，对于缓解焦虑和改善睡眠也具有一定的益生效果，因此使得该益生菌组合物在保健品制备中也具有一定应用潜力。
附图说明
13.图1为不同组合情况下菌体数；图2为高架十字迷宫实验场景设置；图3为旷场实验中不同处理组小鼠进入中间区域时间；图4为旷场实验中不同处理组小鼠进入中央区域次数；图5为高架十字迷宫实验中不同处理组小鼠在开臂停留时间与总时间的比值；图6为高架十字迷宫实验中不同处理组小鼠进入开臂次数与入臂总次数的比值。
具体实施方式
14.下面结合实施例对本技术做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
15.微生物菌株：保藏号cicc 6239的短乳杆菌lactobacillus brevis，现有技术主要用于生产泡菜、产乳酸、产风味物质较好；属于公开可获得菌株；保藏号cicc 25051的类干酪乳酪杆菌lacticaseibacillus paracasei ，现有技
术主要用于食醋酿造、产酸；属于公开可获得菌株；保藏号cicc 6093的嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus，现有技术主要用于益生菌类保健食品生产；属于公开可获得菌株。
16.实施例1前期预实验基础上，基于发酵类食品加工中所用菌株的筛选和用途差异性，结合菌株活性和稳定性指标，以及结合体外稳定性、胃酸性环境耐受性能（人工胃液体外模拟实验中，以37℃、ph2.0 条件下2小时，存活率达到85%以上为筛选指标），发明人最终选择短乳杆菌、类干酪乳酪杆菌、嗜酸乳杆菌作为益生菌组合。
17.另一方面，基于已有gaba（γ-氨基丁酸）研究，鉴于其作为代谢产物与菌株活性之间的相互反馈关系，以及考虑其对于改善睡眠等益生效果，对于本技术所设计的益生菌组合，发明人在培养体系中引入适量gaba（γ-氨基丁酸），以考察其对于菌株活性的实际影响情况。
18.还需说明的是，实验设计中，在培养体系内引入gaba（γ-氨基丁酸）同时，参考基于现有技术资料，同步选择常用益生类物质麦芽糖醇、茶氨酸、余甘子提取物、菊粉等作为对照（相关物质均为普通市售产品），以考察不同物料对益生菌组合活性影响情况。对于这些物料选择，其主要考虑因素有：菊粉是一种常用益生元，可以作为乳酸菌等生长的碳源；茶氨酸作为植物提取物，具有较强的抗氧化功能，可以对抗应激产生的氧自由基，保护益生菌活性。
19.实验过程：分别选取下述菌株的各0.3克的冻干益生菌粉（cicc购买），并混合均匀（其活菌数均为500亿/克）：短乳杆菌lactobacillus brevis cicc 6239的 ；类干酪乳酪杆菌 lacticaseibacillus paracasei cicc 25051和嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus cicc 6093。
20.再在上述0.9克的益生菌混合物中分别加入0.1克的益生元（麦芽糖醇、gaba、茶氨酸、余甘子提取物或菊粉），得到1克的可作为益生菌膳食补充剂的实验成品（1g成品中，活菌总数相当于450亿/克）。
21.将上述益生菌膳食补充剂实验成在恒温恒湿的室温条件下（温度24℃，湿度60%）自然放置7天（由于不采用密封保存方式，因此会比正常的益生菌膳食补充剂货架期明显缩短，即，相当于加快实验，以考察不同益生元成分对活菌数影响情况）。
22.7天后按照国标乳酸菌检测方法（gb4789.35—2016 乳酸菌检验）检测存留的活菌数。
23.结果如图1所示（对照组为不添加其他成分的纯菌粉）。可以看出，相较于原始的活菌数（原始活菌数450亿/克），保存周期内，活菌数均出现一定程度降低，但与不同益生元混合时，活菌数降低程度不同。其中，在与菊粉复配混合是，活菌数保留程度最高，其次是茶氨酸和gaba。因此，从此实验结果来看，从保持菌体活性角度而言，就本技术特定的菌株组合，菊粉、茶氨酸和gaba显然是较好的复配组合物。
24.实施例2如前所述，鉴于gaba潜在的保健性用途，发明人进一步对gaba与益生菌组合的用途进行了进一步探讨，具体实验简介如下。
25.（一）gaba对益生菌组合活性影响参考前述操作，分别选取下述菌株的各0.3克的冻干益生菌粉，并混合均匀（其活菌数均为500亿/克）：短乳杆菌lactobacillus brevis cicc 6239的 ；类干酪乳酪杆菌 lacticaseibacillus paracasei cicc 25051和嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus cicc 6093。
26.再在上述0.9克的益生菌混合物中加入0.1克gaba（即，成品中三种益生菌的活菌数分别为150亿/克，菌总数相当于450亿/克），得到1克的可作为益生菌膳食补充剂的实验成品。以不添加γ-氨基丁酸处理组作为对照。
27.按照国标法乳酸菌活菌计数方法，与不添加γ-氨基丁酸的对照相比，活菌数分别增加了26.3%、51.5%和37.6%。也即，这一实验结果表明，γ-氨基丁酸的添加，对于混合益生菌菌数活性的保持具有较好的协同增强作用。
28.（二）缓解焦虑效果为准确评估本技术益生菌组合物在缓解焦虑方面的应用效果，发明人进一步通过小鼠旷场实验和高架十字迷宫实验来对相关效果进行评估。具体实验过程简介如下。
29.每个实验中，将 50 只 spf 级 6 周龄 icr 雄性小鼠动物根据体重随机分为 5组，每组 10 只，即：空白组、益生菌 gaba水溶液组（每g水溶液中，活菌总数450亿，gaba100mg）、益生菌组（每g益生菌水溶液中，活菌数450亿）、gaba组（100mg/g）和阳性对照组(地西泮水溶液，剂量按3mg/kg.bw计)。
30.各处理组，每天上午灌胃1 次，灌胃量为 20 ml/kg.bw；空白组每天灌胃无菌生理盐水，益生菌 gaba水溶液组灌胃含益生菌 gaba 的水溶液，其余三组分别灌胃益生菌溶液、gaba溶液和地西泮水溶液；连续30天灌胃。
31.旷场实验过程中，以小鼠在旷场中央区域活动变化作为焦虑状态评价的指标。需要解释的是，抗焦虑治疗本身不会增加小鼠对于旷场的探索，但是它们减轻了焦虑对探索行为的抑制作用，因而小鼠在中央旷场活动轨迹的增加可以表明小鼠的焦虑得到了缓解。
32.高架十字迷宫是一种具有一对开臂和一对闭臂的实验装置（结构如图2所示），高架十字迷宫实验过程中，啮齿类动物由于嗜暗性会倾向于在闭臂中活动，但出于好奇心和探究性又会在开臂中活动。在面对新奇刺激时，动物同时产生探究的冲动与恐惧，这就造成了探究与回避的冲突行为，从而产生焦虑心理。而抗焦虑药物能明显增加进入开臂的次数与时间。即，通过动物进入开臂的次数与时间来评估抗焦虑药物的应用效果。
33.旷场实验结果如图3、图4所示。统计结果表明：相较于单独地益生菌组或者gaba组，益生菌 gaba水溶液组能够更好增加小鼠在中央区域停留时间和增加进入中央区域次数，即，益生菌与gaba之间具有一定协同作用，能够进一步提升缓解焦虑效果；而即使是与阳性对照组相比，益生菌 gaba水溶液组虽然略低于阳性对照组，但考虑本技术所提供产品的安全性、无毒副作用等特点，本技术所提供产品仍然是具有较好技术价值的。
34.高架十字迷宫实验结果如图5、图6所示。统计结果表明，相较于单独的益生菌组或者gaba组，gaba与益生菌表现出一定协同作用，两者复配使用时可以进一步提高小鼠进入开臂的次数和增加小鼠在开臂停留时间，并且这种效果与阳性组效果相当。这也进一步表明本技术所提供产品在环节焦虑方面的技术效果。