一种伊维菌素制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种伊维菌素制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.伊维菌素是广泛应用于人、畜禽和植保领域的抗寄生虫药物。然而，近年来许多研究证实鉴伊维菌素能够抑制输入蛋白(imp)a/b1异二聚体对病毒整合酶(in)的识别和和结合，从而抑制rna病毒入核过程，抑制病毒感染。目前，相关研究已经证明，伊维菌素可以通过上述机制对于在感染期间对impa/b1依赖实现入核增殖的多种病毒实现控制感染的作用，包括hiv-1、denv血清型1-4、流感病毒以及最近报道的新冠病毒sars-cov-2。
3.人们已经开发出不同的药物配方和递送系统来优化伊维菌素的药效。研究表明，脂质体、微乳液和聚合物胶束等制剂技术能够明显提高伊维菌素的抗寄生虫效果及其对宿主的安全性。然而，伊维菌素的抗病毒特性还没有被充分挖掘，同时缺乏合适的配方可以改善伊维菌素的细胞内化，并减少药物对机体的不利影响。
4.然而目前传统的伊维菌素脂质体等制剂虽然能够改变药物在体内的分布，提高药物的利用效率，但尚无研究表明伊维菌素的上述制剂可以靶向到病毒感易感细胞。实现药物的靶向一般采取在载体上修饰相关抗体的方式，使药物载体可以通过受体-配体结合，与靶细胞结合。但这种方式需要制备结合效率高、靶向性强的抗体，成本极高。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明利用16hbe分泌的外泌体作为载体负载伊维菌素，能够得到易于富集于支气管上皮细胞的伊维菌素新型药物制剂，从而增加伊维菌素在支气管上皮中的内化，积累至较高水平，能够产生限制sars-cov-2病毒感染的效果。本发明解决的主要技术问题是提供靶向伊维菌素外泌体制剂。
6.本发明还要解决的技术问题是提供了伊维菌素外泌体制剂的制备方法和应用。
7.技术方案：本发明提供了一种伊维菌素制剂，所述伊维菌素制剂是将外泌体作为药物载体负载伊维菌素制得。
8.其中，所述外泌体为ace2表达阳性人源细胞或细胞系来源的外泌体。
9.其中，所述伊维菌素浓度为1-3μg/ml。
10.其中，所述外泌体直径为50-200nm。
11.本发明内容还包括所述的伊维菌素制剂的制备方法，包括以下步骤：
12.1)ace2阳性外泌体制备：将人支气管上皮细胞16hbe细胞在条件培养基中培养，收集条件培养基以离心法分离外泌体；
13.2)伊维菌素外泌体制剂制备：将步骤1)分离的外泌体包裹伊维菌素，外泌体和伊维菌素混合后，加入冷电穿孔缓冲液进行电穿孔，回收、旋转脱盐去除未掺入的伊维菌素，得到伊维菌素外泌体制剂。
14.其中，所述步骤1)中的培养基为：90％高糖dmem 10％胎牛血清。
15.其中，所述步骤1)中的离心法步骤为：
16.s1)先1000xg离心10-15分钟来处理条件培养基以去除细胞和大碎片；
17.s2)以10,000xg离心20-30分钟，110,000xg超速离心75-150分钟；
18.s3)弃去上清液，将含有外泌体的沉淀重新悬浮，获得外泌体。
19.其中，所述步骤2)中外泌体浓度为1～10
×
105个/ml，作为优选地，所述步骤2)中外泌体浓度为5
×
105个/ml。
20.其中，所述步骤2)中伊维菌素终浓度为1-3μg/ml。
21.本发明内容还包括所述的伊维菌素制剂在制备治疗sars-cov-2病毒感染疾病药物中的应用。
22.本发明所述外泌体分离方法和外泌体负载伊维菌素的方法仅为说明本发明，其它分离外泌体和外泌体药物负载方法亦在本专利的保护范围之内。
23.本发明意外发现人支气管上皮细胞16hbe来源的外泌体可以天然靶向该支气管上皮细胞。而支气管上皮是sars-cov-2病毒感染的细胞。如果应用人支气管上皮细胞16hbe来源的外泌体包裹伊维菌素，就能够以方便、低成本的方式实现伊维菌素向呼吸道上皮细胞的靶向递送，抵御病毒的入侵感染。
24.因此，本发明基于人源ace2阳性细胞的外泌体制备了伊维菌素外泌体制剂，促进了伊维菌素向病毒靶细胞内的内化和富集，减少药物副作用并有效控制病毒感染。
25.有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
26.1、本发明应用外泌体作为伊维菌素的药物载体，结构更稳定，更有利于药物的长期保存和使用；
27.2、本发明应用ace2阳性的人源细胞产生的外泌体作为载体，使得外泌体制剂更容易靶向呼吸道或血管内皮等ace2阳性细胞，从而加速伊维菌素向该类细胞的内化和富集，提升药物靶向性，提高药效，减少药物用量，提升药物应用的安全性。
28.3、本发明应用ace2阳性的人源细胞产生的外泌体作为载体，导致以ace2作为结合靶点的病毒可以结合本载体，一方面可以部份封闭病毒与人体细胞的结合程度，减低病毒毒力，另一方面，病毒与ace2阳性的外泌体制剂结合后，发生感染时，伊维菌素可以与病毒遗传物质一起进入细胞，阻止病毒在靶细胞内的复制。本发明能够通过ace2阳性脂质体向细胞内富集伊维菌素有效抑制sars-cov-2等病毒对ace2阳性细胞的感染，能够提升伊维菌素作用的效率达2倍以上。
具体实施方式
29.以下结合实施例对本发明作进一步说明，实施例是用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。
30.实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。
31.实施例1 ace2阳性外泌体制备
32.人支气管上皮细胞16hbe细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)在pbs(ph7.2)中冲洗两次，然后在90％高糖dmem 10％胎牛血清中培养。3天后，收集该条件培养基以离心法分离外泌体。在分离过程中，将缓冲液为pbs(ph7.2)。以1000xg离心10分钟来处理条件培养基以去除细胞和大碎片；以10,000xg离心20分钟；弃去沉淀后110,000xg超速离心75分钟进一步处理上清液；弃去上清液，沉淀重新悬浮，获得外泌体。
33.实施例2伊维菌素外泌体制剂制备
34.将实施例1制备的105个外泌体在pbs(ph7.2)中稀释至200μl共三份，分别加入伊维菌素(sigma-aldrich)使得终浓度分别为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml，然后分别加入等体积的冷2x电穿孔缓冲液(pbs ph7.2，600mm蔗糖)。在gene pulser ii electroporator(biorad)中的4mm比色皿中以250v和125μf进行电穿孔。外泌体在37℃下回收20分钟。通过3个连续的旋转脱盐柱(thermofisher scientific)去除未掺入的伊维菌素，其中在最后一个脱盐步骤中，样品中的蔗糖浓度逐步降低至150mm、50mm和10mm。使用高效液相色谱检测外泌体中伊维菌素含量。结果如表1所示，伊维菌素在1μg/ml至3μg/ml的范围内，伊维菌素外泌体剂型的添加回收率都在50％以上，表明外泌体可以比较好的负载伊维菌素。
35.表1外泌体中伊维菌素添加回收率结果
36.添加值(ug/ml)检测值(ug/ml)回收率(％)10.58
±
0.0458％21.06
±
0.1053％31.56
±
0.1752％
37.实施例3伊维菌素外泌体靶向性验证
38.为检测ace2阳性外泌体伊维菌素制剂能够向ace2阳性细胞富集，我们将实施例2制备的ace2阳性外泌体伊维菌素制剂(伊维菌素含量：1.56μg/ml)施加于107个人脐带间充质干细胞(赛业(苏州)生物科技有限公司；ace2低表达)和107个人支气管上皮细胞16hbe细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司；ace2高表达)中。在37℃，5％co2中孵育48小时。pbs冲洗3遍后，使用tryple
tm express消化5分钟，收集细胞并离心清洗。收获的细胞溶于0.5ml甲醇，涡动3分钟后，以2500转，离心15分钟，收取上清。沉淀再次溶于0.5ml甲醇，重复提取一次，合并上清，并定容至2ml。取10μl进样，使用hplc测定伊维菌素含量。结果如表2所示，脐带间充质干细胞中伊维菌素的富集程度明显低于在人支气管上皮细胞16hbe细胞的富集程度，表明ace2阳性外泌体伊维菌素制剂能够靶向ace2阳性，抑制sars-cov-2等病毒对ace2阳性细胞的感染。
39.表2伊维菌素靶向富集
40.细胞种类检测值(ug/ml)脐带间充质干细胞0.04
±
0.01016hbe细胞0.28
±
0.068
41.实施例4伊维菌素外泌体靶向性验证
42.为检测ace2阳性外泌体伊维菌素制剂能够促进伊维菌素向ace2阳性细胞富集，我们将实施例2制备的ace2阳性外泌体伊维菌素制剂(伊维菌素含量：1.56μg/ml)和伊维菌素(1.56μg/ml)在分别施加于107个人支气管上皮细胞16hbe细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司；ace2高表达)中。在37℃，5％co2中孵育48小时。pbs(ph7.2)冲洗3遍后，使用
tryple
tm
express消化5分钟，收集细胞并离心清洗。收获的细胞溶于0.5ml甲醇，涡动3分钟后，以2500转，离心15分钟，收取上清。沉淀再次溶于0.5ml甲醇，重复提取一次，合并上清，并定容至2ml。取10μ0进样，使用hplc测定伊维菌素含量。结果如表3所示，伊维菌素外泌体制剂能够显著促进伊维菌素在人支气管上皮细胞16hbe细胞的富集程度，胞内浓度达到0.28μg/ml；而仅添加伊维菌素的对照组中，胞内浓度仅为0.12μg/ml，表明ace2阳性外泌体伊维菌素制剂的使用，能够提升伊维菌素作用的效率达2倍，有助于降低药物用量，提升药物安全性。
43.表3外泌体促进伊维菌素的向靶细胞内富集
44.种类检测值(ug/ml)伊维菌素0.12
±
0.027伊维菌素外泌体制剂0.28
±
0.088