转基因干细胞分泌物在制备化妆品中的用途的制作方法

1.本发明属于生物学技术领域，尤其涉及转基因干细胞分泌物在制备化妆品中的用途。


背景技术：

2.随着当代经济的快速发展，环境污染变的越来越严重，环境的污染使臭氧层的空洞扩大，导致人体皮肤接触和吸收到的紫外线含量越来越多，这会使得黑色素细胞的合成黑色素的能力失调。黑色素是一种广泛分布在皮肤表面、视网膜和头发中的色素。黑色素是由酪氨酸通过tyr的酶促氧化合成的。黑色素的生产是人体抵御太阳的紫外线照射的主要防御机制之一。紫外线、慢性炎症和激素刺激激发可以使皮肤产生黑色素，但是当黑色素异常生成的时候，会出现皮肤色素沉积，黄褐斑以及雀斑等问题。因此，研究解决黑色素过度沉积的美白药物或化妆品具有巨大的用途价值和解决价值。
3.外泌体是杯状、脂质双层、直径50-100nm的膜囊泡，外泌体来源于间充质干细胞，上皮细胞和造血干细胞等多种细胞。目前的研究表明，外泌体可以作为身体内参与许多生理和病理过程的细胞之间信息交流的重要载体。在外泌体的生物发生的过程中，许多的生物分子被封装至外泌体中，这些细胞被输送到其他细胞中产生分子信号从而实现多种功能。目前，关于外泌体在美白药物或化妆品中的研究较少，因此，研究外泌体在美白中的用途将有助于进一步解决黑色素过度沉积的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供了一种转基因干细胞分泌物在制备化妆品中的用途。
5.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明提供了基因修饰的间充质干细胞外泌体在制备美白药物或化妆品中的用途，所述基因修饰的间充质干细胞为过表达lnc-rp11-452j13.1基因的骨髓间充质干细胞。
6.优选的，所述lnc-rp11-452j13.1基因的转录本序列如seq id no.1所示。
7.优选地，所述外泌体通过以下步骤获得：（1）根据序列seq id no.1构建lnc-rp11-452j13.1基因的过表达载体；（2）将lnc-rp11-452j13.1过表达载体转染至骨髓间充质干细胞中；（3）提取含有过表达lnc-rp11-452j13.1基因的外泌体。
8.其次，本发明提供了基因修饰的间充质干细胞外泌体在制备黑色素瘤细胞增殖抑制药物中的用途，所述基因修饰的间充质干细胞为过表达lnc-rp11-452j13.1基因的骨髓间充质干细胞。
9.优选地，所述lnc-rp11-452j13.1基因的转录本序列如seq id no.1所示。
10.优选地，所述外泌体通过以下步骤获得：（1）根据序列seq id no.1构建lnc-rp11-452j13.1基因的过表达载体；（2）将lnc-rp11-452j13.1过表达载体转染至骨髓间充质干细胞中；
452j13.1的相对表达量；上游引物：5
’‑
gtccggaattggtgggttct-3’，seqidno.4；下游引物：5
’‑
gaggcaggaggttaaggagc-3’，seqidno.5； 实验所得到的结果如图1所示，实验组的表达量为3.75
±
0.21，说明本发明成功实现了基因lnc-rp11-452j13.1的过表达。实施例2获取转染pcdna3.1-lnc-rp11-452j13.1的骨髓间充质干细胞的外泌体（1）将转染pcdna3.1和pcdna3.1-lnc-rp11-452j13.1的骨髓间充质干细胞接种于培养瓶中；（2）待细胞进入对数增长时，收集培养瓶中的培养基，4℃，2000r/min离心10min，收集上清并使用0.22μm过滤器进行过滤；（3）过滤后，将培养基重新加入到培养瓶中，并补充1ml新鲜的培养基；（4）每天按照上述方式进行一次换液，培养72h之后，将培养基收集在离心管中，使用0.22μm过滤器进行过滤；（5）将培养基在4℃300
×
g离心10分钟去除残留的细胞，收集上清，去除沉淀；（6）将培养基在4℃2000
×
g离心10分钟，去除死细胞，收集上清，去除沉淀；（7）将培养基在4℃10000
×
g离心30min去除细胞碎片，收集上清，去除沉淀；（8）将培养基在4℃100000
×
g离心70分钟，弃去上清，即得到外泌体；（9）使用dpbs重悬外泌体，在4℃，100000
×
g离心70分钟，弃去上清，获得洗涤的外泌体，使用1mlpbs重悬，bca法测定浓度，得到外泌体1和外泌体2，外泌体1为转染pcdna3.1的骨髓间充质干细胞得到的外泌体，外泌体2为转染pcdna3.1-lnc-rp11-452j13.1的骨髓间充质干细胞得到的外泌体。
18.实施例3检测外泌体提取效果和实验组和对照组的外泌体中lnc-rp11-452j13.1的表达量1.检测细胞提取和外泌体提取蛋白中外泌体标志物的蛋白表达（1）提取外泌体1和外泌体2的细胞裂解蛋白，制备蛋白样品；（2）制备10%分离胶和5%浓缩胶的电泳胶，将制备好的电泳胶安装至电泳槽中，使用移液器进行加样；（3）全程使用80v的电源来跑分离胶和浓缩胶，待溴酚蓝达到玻璃板底部停止电泳；（4）预先裁剪pvdf膜备用，转膜前将pvdf膜浸泡在甲醇中5-10min，制作电转三明治模型，220ma电转1.5h；（5）转膜完成后取出pvdf膜，将膜放入到tbst配置的5%脱脂奶粉中，室温下孵育1-2h；（6）pvdf膜封闭完毕后，用tbst漂洗3次，每次10min，将pvdf膜与抗体cd9和cd63进行孵育，4℃摇床上过夜；（7）回收一抗，将pvdf膜置于tbst中，在摇床上清洗3次，每次10min；（8）弃掉tbst，加入二抗，摇床室温下孵育1h；（9）弃掉二抗，将pvdf膜置于tbst中，在摇床上清洗3次，每次10min；
（10）按照说明书以1:1的比例配置a和b两种发光液并混匀备用，均匀的将混合发光液均匀滴加在pvdf膜上，进行显影。
19.实验得到的结果如图2-a所示，可以看出，实验组和对照组的外泌体中均有外泌体标志物cd9和cd63的表达，而细胞裂解的样品则无，说明外泌体提取成功。
20.2.检测实验组和对照组的外泌体中lnc-rp11-452j13.1的表达量（1）加入trizol参照说明书提取rna；（2）参照逆转录试剂盒将rna逆转录为cdna；（3）参照sybr greenⅰ荧光定量pcr试剂盒检测外泌体中非编码基因lnc-rp11-452j13.1的相对表达量；上游引物：5
’‑
gtccggaattggtgggttct-3’，seq id no.4；下游引物：5
’‑
gaggcaggaggttaaggagc-3’，seq id no.5；实验结果如图2-b所示，其中，外泌体2的lnc-rp11-452j13.1的相对表达量为2.59
±
0.26，p小于0.05差异具有统计学意义。
21.实施例4检测过表达lnc-rp11-452j13.1的外泌体对于b16细胞的细胞增殖的影响（1）将p3代的5
×
103个小鼠b16细胞接种于96孔板中，每孔100ul，（2）置于细胞培养箱中，孵育1天后，空白对照组添加100ul完全培养基，实验组1添加100ng/ml的外泌体1，实验组2添加100ng/ml的外泌体2；（3）将96孔板置于细胞培养箱中培养72h后，使用mtt进行检测各孔的吸光度。
22.实验得到的结果如图3所示，其中，空白对照组的od值为0.656
±
0.040，实验组1的od值为0.571
±
0.032，p值小于0.05，实验组2的od值为0.389
±
0.031，p值小于0.001。
23.从上述结果可以看出，过表达lnc-rp11-452j13.1的骨髓间充质干细胞所产生的外泌体能够更加有效的抑制黑色素瘤细胞的增殖。
24.实施例5检测过表达lnc-rp11-452j13.1的外泌体对于b16细胞的酪氨酸酶蛋白表达的影响（1）将实验分为三组，空白对照组添加培养基，实验组1添加外泌体1，实验组2添加外泌体2，每组设置3个重复，处理48h后，提取蛋白样品；（2）制备10%分离胶和5%浓缩胶的电泳胶，将制备好的电泳胶安装至电泳槽中，使用移液器进行加样；（3）全程使用80v的电源来跑分离胶和浓缩胶，待溴酚蓝达到玻璃板底部停止电泳；（4）预先裁剪pvdf膜备用，转膜前将pvdf膜浸泡在甲醇中5-10min，制作电转三明治模型，220ma电转1.5h；（5）转膜完成后取出pvdf膜，将膜放入到tbst配置的5%脱脂奶粉中，室温下孵育1-2h；（6）pvdf膜封闭完毕后，用tbst漂洗3次，每次10min，将pvdf膜与抗体tyrosinase和gapdh进行孵育，4℃摇床上过夜；（7）回收一抗，将pvdf膜置于tbst中，在摇床上清洗3次，每次10min；
（8）弃掉tbst，加入二抗，摇床室温下孵育1h；（9）弃掉二抗，将pvdf膜置于tbst中，在摇床上清洗3次，每次10min；（10）按照说明书以1:1的比例配置a和b两种发光液并混匀备用，均匀的将混合发光液均匀滴加在pvdf膜上，进行显影。
25.实验得到的结果如图4所示，从图中可以看出，外泌体1对于酪氨酸酶有轻度的抑制效果，而外泌体2则可以显著的抑制酪氨酸酶的蛋白表达，说明外泌体2可以有效的抑制酪氨酸酶的蛋白表达。
26.实施例6（1）将b16细胞密度调整为1
×
106个/ml接种于6孔培养板，每孔2ml，置于细胞培养箱中培养过夜后，去除上清；（2）将实验分为三组，空白对照组添加新的培养基，实验组1添加外泌体1，实验组2添加外泌体2，每组设置3个复孔；（3）培养48h之后，弃去培养基，使用pbs洗涤，使用胰蛋白酶消化后，将细胞收集于离心管中，1500r/min离心10min；（4）弃去上清加入1ml含10% dmso的1mol/l naoh溶液，80℃水浴中孵育1h后，分别移入96孔板中，使用酶标仪检测吸光度。
27.实验得到的结果如图5所示，可以看出，空白对照组的od值为0.525
±
0.020，实验组1的od值为0.470
±
0.016，p小于0.05，实验组2的od值为0.232
±
0.019，p小于0.001。上述结果说明过表达lnc-rp11-452j13.1的骨髓间充质干细胞所产生的外泌体能够更加有效的抑制黑色素的生成，因此可用于制备美白产品。