一种肺肿瘤血浆游离DNA多位点突变检测的方法与流程

18.……
共3179条探针
19.该发明所述肺肿瘤血浆游离dna多位点突变检测的方法，包括：
20.①
对正常白细胞gdna、瘤旁正常细胞gdna及从肺部肿瘤ffpe样本中提取的肿瘤细胞gdna进行片段化、加接头、及pcr富集等步骤制备预文库；
21.②
采用具有特定序列的rna探针与预文库进行杂交，从而特异性地捕获来自人类基因组的68种基因中的部分外显子与内含子区域；
22.③
通过磁珠法富集被探针捕获的dna片段，并对捕获的文库进行定量、质控与序列测定；
23.④
采用生物信息学软件判读68种靶基因中是否存在来自肿瘤的变异；
24.⑤
对标准品ctdna及从肺肿瘤血浆样本中提取的cfdna加接头及pcr富集等步骤制备预文库；
25.⑥
采用具有特定序列的rna探针与预文库进行杂交，从而特异性地捕获来自人类基因组的68种基因中的部分外显子与内含子区域；
26.⑦
通过磁珠法富集被探针捕获的dna片段，并对捕获的文库进行定量、质控与序列测定；
27.⑧
采用生物信息学软件判读68种靶基因中是否存在来自肿瘤的变异。
28.与现有技术相比，本发明的有益效果为：。
29.本发明的两轮助力手推车。
30.有益效果：在肺部占位性病变患者外周血标本中基因变异检测的引物，探针，以及检测方法。本发明可在标准品ctdna中实现突变频率0.1％的ctdna检测，相较其他方法提高了检测的灵敏度和特异性，重复性好，操作简单，检测快速，安全等优点，对肺癌的诊断有辅助作用。
附图说明
31.图1为分子标签的分布均匀性示意图(以基因braf的序列分析为例展示)；
32.图2为突变频率为0.1％的ctdna标准品(购自horizon，含6个位点)检测示意图；
33.图3为在100例早期肺癌(i-ii期)临床外周血标本中获得了明显优异于肿瘤蛋白标志物的阳性检出率示意图。
具体实施方式
34.1.提取cfdna以及wbc-gdna，wbc-gdna需要经超声打断至170bp左右；
35.2.加a尾，产物纯化后进行接头连接，纯化分选300bp以下的dna片段，引入barcode；
36.3.分管pcr，反应条件同neb multiplex pcr(neb,m0284s)反应体系。95℃ 1min，60℃ 60s，68℃ 90s，4℃无限。2个循环以上；pcr产物纯化后，第二轮pcr，反应条件同neb multiplex pcr，30个循环；
37.4.产物经凝胶电泳检测片段长度，理论产物约在200bp以下。
38.5.完成建库。
39.实验条件优化：
40.1.确保ligation效率
41.2.确保adapter处引入的随机分子标签barcode连上dna模板(优化随机碱基的数量)。如图1所示
42.3.p5 primer( )与p7-targetgene-3r以及p7-targetgene-3f存在竞争性关系，所以p5 primer( )应较其他两种引物浓度高(比例需要优化)。
43.4.两轮pcr的循环数需要优化。
44.用特异性dna引物、特异性rna探针与内参基因的引物和探针组成ctdna检测流程，进行特异性捕获后开展检测。
45.实施方案i
46.对标准品gdna进行片段化、加接头、及pcr富集等步骤制备预文库；然后进行后续步骤(1)-(3)
47.实施方案ii
48.对从ffpe样本中提取的组织dna进行片段化、加接头、及pcr富集等步骤制备预文库；
49.然后进行后续步骤(1)-(3)
50.实施方案iii
51.对标准品cfdna加接头及pcr富集等步骤制备预文库；
52.然后进行后续步骤(1)-(3)
53.实施方案iv
54.对从肺肿瘤血浆样本中提取的cfdna加接头及pcr富集等步骤制备预文库；如图2所示。
55.然后进行后续步骤(1)-(3)
56.后续步骤：
57.(1)用具有特定序列的rna探针分别与方案i-iv所得的预文库进行杂交，从而特异性地捕获来自人类基因组的70种基因中的部分外显子与内含子区域；
58.(2)通过磁珠法富集被探针捕获的dna片段，并对捕获的文库进行定量、质控与序列测定；
59.(3)采用生物信息学软件判读70种靶基因中是否存在来自肿瘤的变异。如图3所示。
60.通过对不同已知突变丰度的标准品以及ffpe及血浆cfdna进行检测，验证该发明方法的可靠性。
61.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。


技术特征：
1.一种肺肿瘤血浆游离dna多位点突变检测的方法，采用特异性引物、特异性rna探针及捕获技术来提高ctdna检测和特异性，从而能够检测微量ctdna，具体步骤如下：
①
对正常白细胞gdna、瘤旁正常细胞gdna及从肺部肿瘤ffpe样本中提取的肿瘤细胞gdna进行片段化、加接头、及pcr富集等步骤制备预文库；
②
采用具有特定序列的rna探针与预文库进行杂交，从而特异性地捕获来自人类基因组的68种基因中的部分外显子与内含子区域；
③
通过磁珠法富集被探针捕获的dna片段，并对捕获的文库进行定量、质控与序列测定；
④
采用生物信息学软件判读68种靶基因中是否存在来自肿瘤的变异；
⑤
对标准品ctdna及从肺肿瘤血浆样本中提取的cfdna加接头及pcr富集等步骤制备预文库；
⑥
采用具有特定序列的rna探针与预文库进行杂交，从而特异性地捕获来自人类基因组的68种基因中的部分外显子与内含子区域；
⑦
通过磁珠法富集被探针捕获的dna片段，并对捕获的文库进行定量、质控与序列测定；
⑧
采用生物信息学软件判读68种靶基因中是否存在来自肿瘤的变异。2.根据权利要求1所述肺肿瘤血浆游离dna多位点突变检测的方法，其特征在于，所述特异性引物为：forward:5’aggcgaagatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac 3’reverse:5’acactctttccctacacgacgctcttccgatcttcgcct 3’。3.根据权利要求1所述肺肿瘤血浆游离dna多位点突变检测的方法，其特征在于，所述rna探针序列为：5’gttctggaagatcttgaaccctcttctggaaaggggtacctattattactttatggggcagcagcctggaaaagtacttggggaccaaagaaggccaagcttgcctgccctgcattttat 3
’5’
caaaggagcagggaagaaggaatcatcgaggcatgggggtccacactgcaatgtttttgtggaacatggtgagtgcttttcaaaatttctgctcatggttttcctcatgcattcatctta3
’5’
cccgacgtgctggcgcgggaaaatgttggagatctgcctgaagctggtgggctgcaaatccaagaaggggctgtcctcgtcctccagctgttatctggaaggtaagcccgggccgcacgg3’。

技术总结
本发明的一种肺肿瘤血浆游离DNA多位点突变检测的方法，其特征在于，采用特异性引物、特异性PNA探针及捕获技术来提高ctDNA检测和特异性，从而能够检测微量ctDNA，在肺部占位性病变患者外周血标本中基因变异检测的引物，探针，以及检测方法。该方法具有灵敏度高，特异性强，重复性好，操作简单，检测快速，安全等优点，对肺癌的诊断有辅助作用。对肺癌的诊断有辅助作用。对肺癌的诊断有辅助作用。


技术研发人员：李小花 刘朝煜 姚旭梅
受保护的技术使用者：深圳思凝一云科技有限公司
技术研发日：2021.10.08
技术公布日：2022/2/6