激活式荧光编码铁蛋白纳米探针、制备及应用检测方法与流程

1.本发明涉及激活式荧光编码铁蛋白纳米探针领域，属于生物领域，特别 是涉及一种激活式荧光编码铁蛋白纳米探针、制备及应用检测方法。


背景技术：

2.肺癌相关mrna与肺癌的发生发展过程密切相关，因此，同时联合检测 组织或细胞内多种肺癌相关的mrna对肺癌的早期辅助诊断、治疗评估和预 后判断具有重要的意义。目前研究表明没有一种特异性的肿瘤标志物能够准 确而独立的诊断肺癌，因此通常需要多种标志物联合检测来提高诊断的准确 率。
3.目前，实现多种mrna检测的方法主要有反转录pcr、northern印迹法 和微阵列芯片等。其中不经过扩增的方法用于分析时，往往需求的样本量相 对较大；而基于扩增的方法则由于步骤过多、容易造成污染从而影响检测结 果的准确性。此外，这些方法往往需要对组织或细胞进行破坏，很难在单细 胞水平上原位监测mrna在时间与空间上的变化。同时考虑到基因在细胞中 表达的复杂性，在细胞群体中检测mrna的平均表达水平可能会导致mrna表 达与细胞功能之间关联的一些重要信息的丧失，因此迫切需要可在单细胞水 平上原位检测多种mrna的方法。
4.荧光原位杂交技术是一种利用荧光物质标记探针的检测技术，在单细胞 水平可以实现对单一mrna或多种mrna的原位检测，然而该技术需要固定和 处理细胞等预处理过程，不能实现活细胞中目标物的检测，并且存在成像背 景高等不足。因此，亟需建立一种操作简便、成像对比度高且能够应用于活 细胞，实现在单细胞水平上多种mrna同步原位检测与成像的技术。
5.鉴于此，本研究基于荧光编码原理构建了新型“激活式”荧光编码铁蛋 白纳米探针。在系统研究溶液中“激活式”荧光编码铁蛋白纳米探针分别检 测7种肺癌相关mrna的基础上，进一步，将所构建的纳米探针体系用于活 的单细胞中对应7种mrna的原位检测与成像分析，为肺癌的早期辅助诊断 及预后判断等提供了新的方法和技术支持。“激活式”荧光编码铁蛋白纳米 探针分为两个功能区，其中荧光编码铁蛋白纳米颗粒(包载有不同比例的荧 光素和罗丹明)用于定性分析；抛锚在荧光编码铁蛋白纳米颗粒表面的核酸 组装体，则在目标物存在下，会通过“激活式”信号模式产生信号，用于目 标物定量检测。


技术实现要素：

6.本发明主要解决的技术问题是如何提供一种在溶液中实现了对相应目 标mrna的高灵敏、高特异性检测，并进一步成功地应用于活的单细胞内7 中肺癌相关mrna的同步原位检测与成像分析，同时对激活式荧光编码铁蛋 白纳米探针的简便制备，避免了复杂的功能化修饰过程，为功能纳米探针的 构建提供了简易的制备方法的激活式荧光编码铁蛋白纳米探针、制备及应用 检测方法。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种激活式荧光 编码铁蛋
白纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
8.s1、调节脱铁铁蛋白apo溶液的ph值，同时加入荧光素钠溶液、罗丹 明b溶液，再次调节脱铁铁蛋白apo溶液的ph，从而实现使其在该条件下自 组装重新聚合为笼状结构，同时将染料包载进apo内部空腔，并获得荧光编 码铁蛋白纳米颗粒溶液；
9.s2、取等容积且终浓度均为0.5-1.5μmol/l的信号探针s、识别探针r 以及抛锚探针a，并杂交，杂交时间为25-35min，杂交温度为18-25℃，从 而获得核酸组装体s/a/r；
10.s3、在s2步骤获得的核酸组装体s/a/r中加入与信号探针s等容积且 终浓度为150-250nmol/l的荧光编码铁蛋白纳米颗粒溶液，同时置于温度为 23-27℃的恒温振荡器内反应1.5-2.5h，之后通过超滤离心管去除未结合的 核酸，并收集管芯中所保留的溶液，获得激活式荧光编码铁蛋白纳米探针。
11.在一个较佳实施例中，所述步骤s1之前还包括如下步骤：
12.s101、取滤膜用milliq水润湿，同时用注射器将apo通过滤膜过滤， 并收集滤出液，
13.重复上述步骤，然后将滤出液转移至超滤管离心，获得一定浓度的apo 溶液；
14.s102、取若干步骤s101中获得的apo溶液，加入若干milliq水，加入 hcl溶液调节ph值，同时振荡，使apo充分解聚。
15.在一个较佳实施例中，在s1步骤中，荧光素钠溶液和罗丹明b溶液的 投料比设置为七种，相应的，在s3步骤中获得的激活式荧光编码铁蛋白纳 米探针有七种。
16.在一个较佳实施例中，在步骤s2中，所述抛锚探针a上标记有用于通 过zeta电位表征，观察抛锚链与铁蛋白自组装结合情况金刚烷。
17.一种激活式荧光编码铁蛋白纳米探针，由述方法制备而成。
18.一种激活式荧光编码铁蛋白纳米探针应用检测方法，所述检测方法用于 检测肺癌相关mrna，具体包括如下步骤：
19.ss1、优化检测实验条件，包括优化荧光编码铁蛋白纳米颗粒与核酸组 装体的加样浓度比例，激活式荧光编码铁蛋白纳米探针的用量、激活式荧光 编码铁蛋白纳米探针与目标物杂交的荧光恢复时间；
20.ss2、建立检测标准曲线，通过将七种目标物分别稀释为不同的浓度梯 度，每个浓度设置3个平行，对其荧光响应信号进行测量，将所获得的实验 结果进行线性拟合，分别建立7种肺癌相关mrna检测的标准曲线；
21.ss3、确定检出限和检测特异性；
22.ss4、同步原位检测与成像。
23.在一个较佳实施例中，在步骤ss4之前需考察激活式荧光编码铁蛋白纳 米探针的细胞毒性，具体包括如下步骤：
24.s201、接种细胞；
25.s202、添加待测物；
26.s203、加入cck-8试剂；
27.s204、测定od值；
28.s205、计算细胞存活率。
29.在一个较佳实施例中，在步骤ss4中，具体包括如下步骤：
30.s301、将a549细胞分别接种至八个玻底激光共聚焦皿内，并置于细胞 培养箱中进行孵育，孵育时间设置为12h；
31.s302、对a549细胞进行换液，在其中七个激光共聚焦皿内分别加入7 种激活式荧光编码铁蛋白纳米探针(fenps探针)，同时，在剩余一个激光 共聚焦皿中加入激活式荧光编码铁蛋白纳米探针(fenps探针)体系，并继 续孵育4h；
32.s303、吸弃上清，并用缓冲液清洗若干次；
33.s304、加入缓冲液，用激光共聚焦显微镜分别对上述八个样品进行成像 和数据采集。
34.在一个较佳实施例中，在步骤s302中，所述激活式荧光编码铁蛋白纳 米探针体系为7种激活式荧光编码铁蛋白纳米探针的混合物。
35.在一个较佳实施例中，在步骤s304中，染料flu用488nm激光器作为 激发光源，荧光收集波段为495-545nm；染料rb用552nm激光器作为激发 光源，荧光收集波段为560-620nm；染料cy5.5用638nm激光器作为激发 光源，荧光收集波段为680-730nm，采用63x油镜进行成像。
36.本发明的有益效果是：在溶液中实现了对相应目标mrna的高灵敏、高 特异性检测，并进一步成功地应用于活的单细胞内7中肺癌相关mrna的同 步原位检测与成像分析，同时对激活式荧光编码铁蛋白纳米探针的简便制 备，避免了复杂的功能化修饰过程，为功能纳米探针的构建提供了简易的制 备方法。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中 所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的 前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
38.图1是本发明激活式荧光编码铁蛋白纳米探针、制备及应用检测方法一 具体实施例的激活式荧光编码铁蛋白纳米探针的构建及其用于mrna检测的 原理示意图；
39.图2是本发明激活式荧光编码铁蛋白纳米探针、制备及应用检测方法一 具体实施例中激活式荧光编码铁蛋白纳米探针体系用于细胞内7种mrna同 步原位检测原理示意图；
40.图3是本发明激活式荧光编码铁蛋白纳米探针、制备及应用检测方法一 具体实施例中apo@flu/rb(flu/rb＝3:3)紫外可见吸收光谱；
41.图4是本发明激活式荧光编码铁蛋白纳米探针、制备及应用检测方法一 具体实施例中荧光编码铁蛋白纳米颗粒的荧光光谱图；
42.图5是本发明激活式荧光编码铁蛋白纳米探针、制备及应用检测方法一 具体实施例中7种激活式荧光编码铁蛋白纳米探针对目标物的识别性能；
43.图6是本发明激活式荧光编码铁蛋白纳米探针、制备及应用检测方法一 具体实施例中激活式荧光编码铁蛋白纳米探针用于对应目标物检测的特异 性结果；
44.图7是本发明激活式荧光编码铁蛋白纳米探针、制备及应用检测方法一 具体实施例中激活式荧光编码铁蛋白纳米探针的细胞毒性结果；
45.图8是本发明激活式荧光编码铁蛋白纳米探针、制备及应用检测方法一 具体实施
例中激活式荧光编码铁蛋白纳米探针体系与a549细胞孵育后的激 光共聚焦成像图。
具体实施方式
46.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
47.请参阅图1-8，在本发明的一个具体实施例中提供一种激活式荧光编码 铁蛋白纳米探针、制备及应用检测方法，具体包括以下实施例：
48.实施例1
49.一种激活式荧光编码铁蛋白纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
50.s1、将脱铁铁蛋白apo溶液的ph调为0.5-3.5，加入荧光素钠溶液flu和 罗丹明b溶液rb，调节脱铁铁蛋白apo溶液的ph为7.5-8.5，使其在该条件下 自组装重新聚合为笼状结构；将染料包载进apo内部空腔，并获得荧光编码 铁蛋白纳米颗粒溶液；
51.s2、取等容积且终浓度均为0.5-1.5μmol/l的信号探针s、识别探针r 以及抛锚探针a，并杂交，杂交时间为25-35min，杂交温度为18-25℃，从 而获得核酸组装体s/a/r；
52.s3、在s2步骤获得的核酸组装体s/a/r中加入与信号探针s等容积且终浓 度为150-250nmol/l的荧光编码铁蛋白纳米颗粒溶液，同时置于温度为 23-27℃的恒温振荡器内反应1.5-2.5h，之后通过超滤离心管去除未结合的 核酸，并收集管芯中所保留的溶液，获得激活式荧光编码铁蛋白纳米探针。
53.所述步骤s1之前还包括如下步骤：
54.s101、取滤膜用milliq水润湿，同时用注射器将apo通过滤膜过滤，并 收集滤出液，
55.重复上述步骤，然后将滤出液转移至超滤管离心，获得一定浓度的apo 溶液；
56.取用0.22μm滤膜用milliq水润湿，用注射器将apo通过滤膜过滤，收集 滤出液，再取milliq水清洗滤膜两次，然后将滤出液转移至超滤管离心3-5 min，获得浓度为1
×
10-4
mol/l的apo溶液；
57.s102、取若干步骤s101中获得的apo溶液，加入若干milliq水，加入hcl 溶液调节ph值，同时振荡，使apo充分解聚。
58.取若干步骤s101中获得的apo溶液，加入若干milliq水，缓慢加入适量 的hcl溶液调至ph为2，置于水平摇床内震荡10min使apo充分解。
59.在s1步骤中，荧光素钠溶液和罗丹明b溶液的投料比设置为七种，相应 的，在s3步骤中获得的激活式荧光编码铁蛋白纳米探针有七种。
60.在s1步骤中，荧光素钠溶液flu和罗丹明b溶液rb的投料比有七种，分别 为flu：rb＝6：0、flu：rb＝5:1、flu：rb＝4:2、flu：rb＝3:3、flu：rb＝2:4、 flu：rb＝1:5和flu：rb＝0:6，相应的，在s3步骤中获得的激活式荧光编码 铁蛋白纳米探针有七种。
61.在步骤s2中，所述抛锚探针a上标记有用于通过zeta电位表征，观察抛 锚链与铁蛋白自组装结合情况金刚烷。
62.在具体的实施过程中，将脱铁铁蛋白(apo)溶液的ph调为2，此时加入 不同比例的
荧光素钠溶液(flu)和罗丹明b溶液(rb)，其中flu和rb的投 料比(flu/rb)分别为6:0、5:1、4:2、3:3、2:4、1:5、0:6，然后将ph调 为8，使其在该条件下自组装重新聚合为笼状结构，把染料包载进apo内部空 腔，从而制备7种荧光编码铁蛋白纳米颗粒。
63.7种荧光编码纳米颗粒对应的信息如下：apo@flu/rb(flu/rb＝6:0)； apo@flu/rb(flu/rb＝5:1)；apo@flu/rb(flu/rb＝4:2)；apo@flu/rb (flu/rb＝3:3)；apo@flu/rb(flu/rb＝2:4)；apo@flu/rb(flu/rb＝1:5)； apo@flu/rb(flu/rb＝0:6)。
64.其具体制备过程如下：
65.(1)首先，对apo进行预处理(将其保存液置换为去离子水)，具体操 作如下：首先取用0.22μm滤膜用milliq水润湿，然后用1ml的注射器将apo 通过滤膜过滤，收集滤出液，然后再用milliq水清洗滤膜两次，然后将滤出 液转移至超滤管离心4min，然后收集内管管芯内的apo，利用apo在280nm 处的特征吸收峰，建立紫外吸收标准曲线，利用该标曲测得浓缩后收集的apo 浓度为1
×
10-4
mol/l，密封后于4℃保存备用。
66.(2)apo@flu/rb(flu/rb＝6:0)制备过程如下：准确取6μl apo，然 后加入439μl milliq水，缓慢加入适量的0.1mol/l hcl溶液调至ph为2， 置于水平摇床内震荡10min使apo充分解聚；缓慢滴加300μl浓度为2
×
10-3 mol/l的flu溶液，震荡20min使溶液充分混匀；再加入适量的0.1mol/l naoh 调节上述溶液ph为8，震荡2h使apo充分自组装重新聚合。之后使用0.22 μm滤膜去除溶液反应产生的聚沉物，收集滤出液。并将滤出液用超滤离心 管(30kda，15ml)离心4min，以便去除溶液中自由的flu。最后，吸取内 管芯中的荧光编码铁蛋白纳米颗粒溶液，密封后4℃保存备用。
67.其他荧光编码铁蛋白纳米颗粒的制备过程与apo@flu/rb(flu/rb＝6:0) 制备类似，仅需将flu和rb的投料比(flu/rb)调制为5:1、4:2、3:3、2:4、 1:5、0:6，即可分别制备apo@flu/rb(flu/rb＝5:1)；apo@flu/rb (flu/rb＝4:2)；apo@flu/rb(flu/rb＝3:3)；apo@flu/rb(flu/rb＝2:4)； apo@flu/rb(flu/rb＝1:5)；apo@flu/rb(flu/rb＝0:6)。然后对制备的荧 光编码纳米颗粒进行透射电镜、紫外光谱、荧光光谱表征，并对7种荧光编 码铁蛋白纳米颗粒中每个apo中包载染料的个数进行测量。
68.实施例2
69.一种激活式荧光编码铁蛋白纳米探针，由上述方法制备，具体来说，基 于apo依赖ph的解聚/自组装性能，通过调控溶液ph值，将不同投料比的flu 和rb同时负载进apo内部空腔，构建7种荧光编码铁蛋白纳米颗粒(如2.1 所示)；其次，基于核酸自组装技术，构建由抛锚探针(a)、识别探针(r) 和信号探针(s)形成的核酸组装体；最后，利用金刚烷可以有效地嵌入蛋 白质的性能，将核酸组装体自组装抛锚到荧光编码纳米颗粒表面，从而制得 激活式荧光编码铁蛋白纳米探针(fenps)(图1)。7种fenps(fenps1、 fenps2、fenps3、fenps4、fenps5、fenps6、fenps7)分别用于特异性识别 对应的7种mrna(egfr、cd151、tk1、epcam、cd91、pd-l1、vegf)(核酸 链名称及其对应的碱基序列，见下表1)。
70.在此以fenps1制备为例进行说明：首先将egfr探针体系的信号探针 (s1)、识别探针(r1)以及抛锚探针(a)各取100μl(终浓度均为1μ mol/l)室温条件下杂交30min后，形成核酸组装体(s1/a/r1)，加入100 μl制备好的apo@flu/rb(flu:rb＝6:0)，终浓度为200nmol/l，置于恒温 振荡器内反应2h，温度为25℃，之后超滤离心去除未结合的核酸，收集 管芯中所保留的溶液，即为制备好的fenps1(apo@flu/rb@s1/a/r1， flu/rb＝6:0)于4
℃冰箱保存备用。fenps2、fenps3、fenps4、fenps5、 fenps6、fenps7的制备方法与fenps1类似，通过上述自组装过程，即可分 别制备fenps2(apo@flu/rb@s2/a/r2，flu/rb＝5:1)、fenps3 (apo@flu/rb@s3/a/r3，flu/rb＝4:2)、fenps4(apo@flu/rb@s4/a/r4， flu/rb＝3:3)、fenps5(apo@flu/rb@s5/a/r5，flu/rb＝2:4)、fenps6 (apo@flu/rb@s6/a/r6，flu/rb＝1:5)、fenps7(apo@flu/rb@s7/a/r7， flu/rb＝0:6)。
71.然后，对荧光编码铁蛋白纳米探针制备所涉及的过程进行相应表征：(1) 将标记有金刚烷的抛锚探针a与一定量的apo在恒温振荡器内反应2h，温度 为25℃，超滤离心去除未结合的核酸，对其进行zeta电位表征，观察抛锚 链是否能够与铁蛋白自组装结合；(2)为了验证7种fenps是否成功制备， 并在目标物存在时可实现“激活式”信号读取，分别考察了fenps1、fenps2、 fenps3、fenps4、fenps5、fenps6和fenps7对目标物的荧光响应性能。首 先，将制备好的fenps探针(100nmol/l)不加对应的目标物时进行荧光信 号测量，随后，加入各自对应的目标物溶液(150nmol/l)杂交反应0.5h 后进行荧光信号检测，对比加目标物前后的荧光信号变化来考察fenps性能。
72.表1. 核酸链名称及其对应的碱基序列
。
[0073][0074]
注：溶液实验时，egfr、cd151、tk1、epcam、cd91、pd-l1、vegf靶序 列分别用对应的dna代替mrna序列。
[0075]
实施例3
[0076]
一种激活式荧光编码铁蛋白纳米探针应用检测方法，所述检测方法用于 检测肺癌相关mrna，具体包括如下步骤：
[0077]
ss1、优化检测实验条件，包括优化荧光编码铁蛋白纳米颗粒与核酸组 装体的加样浓度比例，激活式荧光编码铁蛋白纳米探针的用量、激活式荧光 编码铁蛋白纳米探针与目标物杂交的荧光恢复时间；
[0078]
ss2、建立检测标准曲线，通过将七种目标物分别稀释为不同的浓度梯 度，每个浓度设置3个平行，对其荧光响应信号进行测量，将所获得的实验 结果进行线性拟合，分别建
立7种肺癌相关mrna检测的标准曲线；
[0079]
ss3、确定检出限和检测特异性；
[0080]
ss4、同步原位检测与成像。
[0081]
在步骤ss4之前需考察激活式荧光编码铁蛋白纳米探针的细胞毒性，具 体包括如下步骤：
[0082]
s201、接种细胞；
[0083]
s202、添加待测物；
[0084]
s203、加入cck-8试剂；
[0085]
s204、测定od值；
[0086]
s205、计算细胞存活率。
[0087]
具体实施例中，采用cck-8实验检测构建的荧光编码铁蛋白纳米探针对 细胞的毒性。由于本实验的7种荧光编码铁蛋白纳米探针构建材料一致，因 此选择fenps4(flu/rb＝3:3)进行细胞毒性实验考察，具体操作步骤如下：
[0088]
(1)接种细胞：将培养状态良好的a549细胞进行消化，通过细胞计数 后制成浓度为1
×
104个/ml的细胞悬液，然后在96孔培养板内每孔加入100 μl细胞悬液，使细胞均匀铺于96孔板内，分别设置阴性对照组和空白对照 组。
[0089]
(2)加待测物：细胞培养24h后，吸弃废液，然后在实验组中加入10 μl不同浓度的荧光编码铁蛋白纳米探针(分别为0.05、0.1、0.5、1.0μ mol/l)，并加入90μl不含胎牛血清的rpmi-1640培养基，对照组和空白 组中分别加入100μl不含胎牛血清的rpmi-1640培养基，每组设置5个平 行样。
[0090]
(3)加cck-8试剂：细胞培养24h后，在实验组、对照组和空白组中 每孔加入10μl cck-8试剂，充分混匀，置于细胞培养箱中培养1～4h，中 途不断观察孔内液体变浅橙色即可进行od值测定，本实验最终选择2h，此 时450nm处吸光度在0.2～0.8之间为最佳。
[0091]
(4)od值测定：在避光条件下，用酶标仪检测96孔板内450nm波长 处的吸光度值。
[0092]
(5)细胞存活率计算：细胞存活率＝(od
450
实验孔-od
450
空白孔)/(od
450
对照孔-od
450
空白孔)
×
100％。
[0093]
在步骤ss4中，具体包括如下步骤：
[0094]
s301、将a549细胞分别接种至八个玻底激光共聚焦皿内，并置于细胞培 养箱中进行孵育，孵育时间设置为12h；
[0095]
s302、对a549细胞进行换液，在其中七个激光共聚焦皿内分别加入7 种激活式荧光编码铁蛋白纳米探针(fenps探针)，同时，在剩余一个激光 共聚焦皿中加入激活式荧光编码铁蛋白纳米探针(fenps探针)体系，并继 续孵育4h；
[0096]
s303、吸弃上清，并用缓冲液清洗若干次；
[0097]
s304、加入缓冲液，用激光共聚焦显微镜分别对上述八个样品进行成像 和数据采集。
[0098]
在步骤s302中，所述激活式荧光编码铁蛋白纳米探针体系为7种激活式 荧光编码铁蛋白纳米探针的混合物。
[0099]
在步骤s304中，染料flu用488nm激光器作为激发光源，荧光收集波段 为495-545nm；染料rb用552nm激光器作为激发光源，荧光收集波段为 560-620nm；染料cy5.5用
638nm激光器作为激发光源，荧光收集波段为 680-730nm，采用63x油镜进行成像。
[0100]
具体来说，将a549细胞(1
×
105个)接种至8个玻底直径为20mm的激 光共聚焦皿内，置于细胞培养箱中孵育12h后，对细胞进行换液。然后，在 1-7号激光共聚焦皿内分别加入7种fenps探针，在8号激光共聚焦皿中加入 fenps探针体系(7种fenps探针的混合物)，继续孵育4h，随后吸弃上清， 并用pbs缓冲液清洗三次，最后加入500μl pbs缓冲液，用激光共聚焦显微 镜分别对上述8个样品进行成像和数据采集。
[0101]
激光共聚焦显微镜成像条件：染料flu用488nm激光器作为激发光源， 荧光收集波段为495-545nm；染料rb用552nm激光器作为激发光源，荧光 收集波段为560-620nm；染料cy5.5用638nm激光器作为激发光源，荧光收 集波段为680-730nm，采用63x油镜进行成像。最后，对激光共聚焦成像结 果进行解码分析，从而实现在活的单细胞内7种mrna的同步原位检测与成像 分析。
[0102]
荧光编码铁蛋白纳米探针体系用于细胞内7种mrna的同步原位检测与成 像的原理如图2所示。在系统优化fenps(fenps1、fenps2、fenps3、fenps4、 fenps5、fenps6、fenps7)实现溶液中对应7种目标mrna(egfr、cd151、 tk1、epcam、cd91、pd-l1、vegf)检测的基础上，进一步将其用于细胞内7 种mrna的同步原位检测与成像。
[0103]
当荧光编码铁蛋白纳米探针识别目标物时(以fenps1对目标物的检测为 例进行说明)，fenps1分为两个功能区，其中荧光编码铁蛋白纳米颗粒 (flu/rb＝6:0)用于egfr mrna定性分析；核酸组装体(s1/a/r1)在目标物 存在下，会通过“激活式”信号模式产生荧光(cy5.5)信号，用于egfr mrna 定量检测。采用cy5.5作为定量荧光信号，主要的考虑是其激发和发射波长 均大于600nm，可以有效地过滤生物体自发背景荧光的影响，从而使得在细 胞成像时，能有效地降低背景信号，提高成像对比度和灵敏度。细胞内不同 mrna具有空间分布位置不同的特点，因此通过将7种fenps探针同时与目标 细胞孵育即可实现细胞内7种mrna的同步原位检测。由于细胞内环境复杂， 所以细胞内的编码比值与溶液中的编码比值会有差异，需通过收集7种fenps 分别与细胞孵育后的激光共聚焦成像数据进行分析。收集激光共聚焦成像图 中flu通道内亮点的荧光信号以及对应的rb通道内亮点的荧光信号，获得7 种fenps在细胞中对应的编码比值范围，以便进行同步原位检测与成像时的 解码处理，实现对细胞内7种mrna的定性分析。
[0104]
随后，对7种fenps与细胞同时孵育后的激光共聚焦成像图进行解码。 具体的解码过程：首先，在cy5.5通道内圈选信号点，并认为一个信号点即 为一个拷贝的目标mrna；其次，通过分析该信号点在对应的flu通道和rb通 道的荧光信号比值，将该荧光比值去匹配上述在细胞中获取的7种探针对应 的编码比值范围，即可确认该信号点为哪一种目标物，从而实现目标mrna的 定性分析和定量检测；最后，通过对cy5.5通道内所有发光点信号进行上述 解码处理，即可获得7种目标mrna对应的拷贝数，从而实现在活的单细胞内 7种mrna的同步原位检测(包括定性和定量)与成像分析。
[0105]
在实施例中，荧光编码铁蛋白纳米颗粒的性能表征的实施过程中，
[0106]
(1)利用透射电镜表征，对apo、apo@flu/rb(flu/rb＝6:0)、apo@flu/rb (flu/rb＝3:3)和apo@flu/rb(flu/rb＝0:6)的形貌进行了透射电镜表征， 均可观察到呈白色的蛋白质外壳，呈黑色的内部空腔，同时apo呈球形结构， 且粒径为10nm左右，分散性能好。包载染料后，apo@flu/rb(flu/rb＝6:0)、 apo@flu/rb(flu/rb＝3:3)和apo@flu/rb(flu/rb＝
0:6)尺寸大小未发生改 变，仍呈球形结构，表明经过调节ph的apo仍能够成功地自组装再聚合成球 形结构，且结构稳定，可成功用于染料物质的包载。
[0107]
(2)利用紫外可见吸收光谱及荧光光谱表征，分别对apo、flu、rb和 apo@flu/rb(flu/rb＝3:3)进行了紫外可见吸收光谱表征(图3)。apo在280nm处有特征吸收峰；flu在480nm附近有特征吸收峰；rb在555nm处有 特征吸收峰。apo@flu/rb(flu/rb＝3:3)对应的光谱在280nm处有吸收峰代 表具备apo，在480nm、555nm处对应有flu、rb特征吸收峰，表明flu、rb 同时负载到了apo内部空腔，表明apo@flu/rb(flu/rb＝3:3)已成功制备。
[0108]
其中7种荧光编码铁蛋白纳米颗粒的荧光光谱如图4所示，随着flu投 料比的逐渐降低，flu在515nm处的荧光强度也逐渐降低，随着rb投料比的 逐渐增加，rb在575nm处的荧光强度逐渐增强，同时flu和rb的荧光强度比 值随着投料比的改变而变化，且每一种比例编码的荧光强度区分明显。荧光 光谱结合透射电镜表征、紫外可见吸收光谱，表明7种荧光编码铁蛋白纳米 颗粒已成功制备，从而为fenps制备奠定了基础。
[0109]
在表征的特征考察中，
[0110]
(1)利用荧光编码铁蛋白纳米颗粒中每个apo包载染料个数的表征，以 不同投料比(flu/rb：6:0、5:1、4:2、3:3、2:4、5:1、0:6)制得的7种 荧光编码铁蛋白纳米颗粒中每个apo包载染料的个数，如表2所示，随着flu 投料比例的减小，荧光编码铁蛋白纳米颗粒中apo包载flu的个数呈现下降趋 势，随着rb投料比例的增大，包载rb的个数呈上升趋势，证明已成功制备了 7种荧光编码铁蛋白纳米颗粒，且每个apo中所包载的总染料个数约为65， 具体数据参见下表：
[0111]
7种荧光编码铁蛋白纳米颗粒中每个apo包载染料的个数
[0112][0113]
(2)荧光编码铁蛋白纳米探针的性能表征，zeta电位表征中，利用zeta 电位对apo与抛锚探针(a)的结合进行了表征。a、apo和apo@a的zeta电位 分别为-13.1mv、-15.6mv和-32.3mv。在铁蛋白表面自组装抛锚探针(标 记有金刚烷的核酸链)形成apo@a后，其电位更负，表明抛锚探针可通过金 刚烷/蛋白质相互作用，成功地抛锚在铁蛋白表面。
[0114]
(3)荧光编码铁蛋白纳米探针识别目标物的性能中，通过荧光杂交实 验分别考察了7种fenps(fenps1、fenps2、fenps3、fenps4、fenps5、fenps6、 fenps7)对目标物的识别性能。以fenps1为例进行说明，其对应的结果如a 所示。buffer为杂交缓冲液的信号；fenps1为单独fenps1(不加egfr核酸序 列)的信号；fenps1 egfr为fenps1加入egfr核酸序列产生的荧光信号，cy5.5 荧光被激活。其中图a、b、c、d、e、f、g分别为fenps1、fenps2、fenps3、 fenps4、fenps5、fenps6和fenps7对目标物的识别性能研究结果，表明7 种fenps探针均能被各自对应的目标物“激活”，可有效地用于对应目标物 的识别。
[0115]
实施例4
[0116]
在荧光编码铁蛋白纳米探针用于溶液中mrna检测中，因7种fenps的构 建原理相
同，因此以fenps1、fenps4、fenps6、fenps7为代表进行了优化实 验。观察到fenps1、fenps4、fenps6、fenps7的荧光信号变化趋势一致，即 随着荧光编码铁蛋白颗粒与核酸组装体的浓度比例不断增加，荧光信号也逐 渐增强，当二者的浓度比例达到1:5时信号最强，比例为1:10时，信号反 而有所下降，因此，均采用荧光编码铁蛋白纳米颗粒与核酸组装体的浓度比 例为1:5来制备fenps。
[0117]
采用单因素实验对fenps探针的用量进行了优化，当探针浓度为100 nmol/l时，荧光信号最强，因此，7种fenps用于目标物检测时，均采用100 nmol/l(以荧光编码铁蛋白纳米探针中apo含量进行浓度定量)进行实验。
[0118]
采用单因素试验对fenps与目标物杂交的荧光恢复时间进行了优化，探 针与目标物反应时间为30min时，荧光信号最强，因此在后续的实验中，选 择fenps与目标物的杂交时间为30min。
[0119]
分别研究了7种fenps对不同浓度目标物的响应。egfr在5nmol/l-100 nmol/l浓度范围内，对应的线性方程为：y＝8187.0202x-41420.2583(x为c
egfr
， y为荧光强度f-f0)，r2＝0.9963；cd151在2nmol/l-40nmol/l浓度范 围内，对应的线性方程为：y＝562.8346x 1857.4131(x为c
cd151
，y为荧光强度 f-f0)，r2＝0.9960；tk1在2nmol/l-75nmol/l浓度范围内，对应的线性 方程为：y＝5755.7759x-8774.0345(x为c
tk1
，y为荧光强度f-f0)，r2＝0.9753； epcam在5nmol/l-100nmol/l浓度范围内，对应的线性方程为： y＝7114.0549x-66648.1992(x为c
epcam
，y为荧光强度f-f0)，r2＝0.9913；cd91 在1nmol/l-15nmol/l浓度范围内，对应的线性方程为： y＝692.1446x 753.1007x，r2＝0.9976；在20nmol/l-100nmol/l浓度范围内， 对应的线性方程为：y＝8724.6672x-157041.5156，r2＝0.9883(x为c
cd91
，y为 荧光强度f-f0)；pd-l1在5nmol/l-75nmol/l浓度范围内，对应的线性 方程为：y＝3440.0212x 30236.0932(x为c
pd-l1
，y为荧光强度f-f0)， r2＝0.9901；vegf在5nmol/l-75nmol/l浓度范围内，对应的线性方程为： y＝8629.1338x 107740.3794，r2＝0.9961(x为c
vegf
，y为荧光强度f-f0)， r2＝0.9901。
[0120]
在溶液中得到了7种fenps探针分别对7种目标mrna检测的检出限结果， 分别为：
①
egfr mrna检出限为1nmol/l；
②
cd151 mrna检出限为1nmol/l；
ꢀ③
tk1 mrna检出限为1nmol/l；
④
epcam mrna检出限为2nmol/l；
⑤
cd91 mrna检出限为0.5nmol/l；
⑥
pd-l1 mrna检出限为1nmol/l；
⑦
vegf mrna 检出限为0.5nmol/l。
[0121]
通过荧光杂交实验分别考察了7种fenps(fenps1、fenps2、fenps3、 fenps4、fenps5、fenps6、fenps7)对目标物的识别性能。以fenps1为例进 行说明，其对应的结果如图5a所示。buffer为杂交缓冲液的信号；fenps1 为单独fenps1(不加egfr核酸序列)的信号；fenps1 egfr为fenps1加入egfr 核酸序列产生的荧光信号，cy5.5荧光被激活。其中图a、b、c、d、e、f、g 分别为fenps1、fenps2、fenps3、fenps4、fenps5、fenps6和fenps7对 目标物的识别性能研究结果，表明7种fenps探针均能被各自对应的目标物
ꢀ“
激活”，可有效地用于对应目标物的识别，a：fenps1用于egfr mrna识别； b：fenps2用于cd151 mrna识别；c：fenps1用于tk1 mrna识别；d：fenps1 用于epcam mrna识别；e：fenps1用于cd91 mrna识别；f：fenps1用于pd-l1mrna识别；g：fenps1用于vegf mrna识别。其中a曲线为杂交缓冲液，b曲线 为单独fenps探针的荧光光谱，c曲线为fenps探针加入对应目标物后产生的 荧光光谱。
[0122]
检测7种肺癌相关mrna的特异性结果如图6所示，图a、b、c、d、e、f、 g分别为检测egfr、cd151、tk1、epcam、cd91、pd-l1和vegf的特异性结果。 其中mis-1为单碱基错配序列，mis-2为双碱基错配序列，mis-3为三碱基错 配序列，cmy-c为随机干扰序列。从可知，7种肺癌相关mrna检测结果趋势一 致，错配序列的荧光强度均显著低于相同浓度目标物时对应的荧光强度，并 且可以有效区分单碱基错配，表明基于fenps构建的检测方法，可实现对应 目标物的高特异性检测。
[0123]
荧光编码铁蛋白纳米探针(fenps)用于对应目标物检测的特异性结果。 其中，(a)fenps1检测egfr的特异性结果；(b)fenps2检测cd151的特 异性结果；(c)fenps3检测tk1的特异性结果；(d)fenps4检测epcam的 特异性结果；(e)fenps5检测cd91的特异性结果；(f)fenps6检测pd-l1 的特异性结果；(g)fenps7检测vegf的特异性结果。
[0124]
在上述实施例中，荧光编码铁蛋白纳米探针用于细胞内7种mrna的同步 原位检测与成像，其中探针的细胞毒性中采用cck-8研究fenps的细胞毒性。 因为7种fenps的组成类似，因此以fenps4(flu/rb＝3:3)为代表进行了细 胞毒性考察，结果如图7所示。不加fenps探针时细胞的存活率定义为100％， 其它组则对应为不同浓度的探针与细胞孵育24h后的细胞活性，从图中可以 得知探针浓度越小，细胞活性越高，当fenps4探针浓度为0.5μmol/l时， 细胞活性为93％，当探针浓度高达1μmol/l时，细胞活性仍在90％以上， 本实验选择的用于细胞内检测的fenps浓度为0.4μmol/l；根据fenps制备材 料apo中含有的flu和rb染料个数，选择了当量的flu-rb(3:3)混合物考察 其细胞毒性，从图中可以看出当浓度大于25μmol/l时，细胞存活率下降明 显。上述结果表明，相比于单纯的荧光染料，通过apo包载染料形成的fenps 探针具备更低的细胞毒性，为后期活细胞内mrna的检测提供了保障。
[0125]
在另一个实施过程中，细胞内7种肺癌相关mrna的同步原位检测与成像， fenps探针体系(7种fenps探针)用于a549细胞内7种mrna的同步原位检测 与成像，其对应的激光共聚焦成像结果如图8所示，通过叠加图中可以看出 细胞形态良好，并且四个通道内的荧光发光区域很好的重叠于细胞质中，与 mrna大多分布在细胞质中的生物学特性一致。随后，对7种fenps与细胞同 时孵育后的激光共聚焦成像图进行解码。具体的解码过程：首先，在cy5.5 通道内圈选信号点，并认为一个信号点即为一个拷贝的目标mrna；其次，通 过分析该信号点在对应的flu通道和rb通道的荧光信号比值，将该荧光比值 去匹配上述在细胞中获取的7种探针对应的编码比值范围，即可确认该信号 点为哪一种目标物，从而实现目标mrna的定性分析和定量检测；最后，通过 对cy5.5通道内所有发光点信号进行上述解码处理，即可获得7种目标mrna 对应的拷贝数。
[0126]
对超过100个细胞的共聚焦成像图进行解码后，获取利用该方法检测到 的a549细胞内7种mrna的表达量，检测结果表明7种mrna在a549细胞中 表达量有差异，其中egfr表达量最高(单细胞中平均拷贝数为34)，其后 依次为vegf(单细胞中平均拷贝数为32)，pd-l1(单细胞中平均拷贝数为 29)，tk1(单细胞中平均拷贝数为28)，cd151(单细胞中平均拷贝数为 17)，cd91(单细胞中其平均拷贝数为16)，表达量最低的为epcam(单细 胞中平均拷贝数为15)。上述研究结果表明，荧光编码铁蛋白纳米探针可成 功地实现活的单细胞内7种mrna的同步原位检测(包括定性和定量)与成 像分析。
[0127]
因此，本发明具有以下优点：
[0128]
1、利用荧光编码原理，构建了一系列新型的“激活式”荧光编码铁蛋 白纳米探针
(fenps)，fenps分为两个功能区，其中荧光编码铁蛋白纳米颗 粒用于目标物的定性分析；核酸组装体在目标物存在下，会通过“激活式
”ꢀ
信号模式产生信号，用于目标物定量检测，以此为基础，在溶液中实现了对 相应目标mrna的高灵敏、高特异性检测，并进一步成功地应用于活的单细 胞内7中肺癌相关mrna的同步原位检测与成像分析；
[0129]
2、利用自组装方式(包括apo自组装、核酸自组装、金刚烷/蛋白质相 互作用介导的自组装)，实现了对“激活式”荧光编码铁蛋白纳米探针的简 便制备，避免了复杂的功能化修饰过程，为功能纳米探针的构建提供了简易 的制备方法；
[0130]
3、通过上述方法，极大程度的提升了肺癌诊断的准确率，能够让患者 根据自己的检测结果及时的对疾病得到治疗，同时也有利于肺癌疾病的研 究，具有重大的现实意义。
[0131]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是 利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用 在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。