抗体药物缀合物纯化的制作方法

1.本发明涉及具有基于氨基酸的端基的离子交换分离材料。该材料特别适用于分离和纯化adc。


背景技术：

2.抗体药物缀合物(adc)是一类新的高效药物，通常专用于癌症治疗。在这些缀合物中，抗体分子专用于癌细胞的特异性识别，由抗体分子携带的毒性有效载荷破坏它们。可商购获得的adc的实例是adcetris
®
和kadcyla
®
。
3.这些新药是通过将毒性分子(有效载荷)缀合在抗体分子上而制造。这通常通过用暴露于抗体表面上的特定氨基酸残基(例如：赖氨酸或半胱氨酸键还原后的半胱氨酸)受控的化学缀合方法来实现。两种方法都产生具有可变的药物与抗体比率(dar)的adc物类的异质混合物。赖氨酸缀合途径产生超过100种可能性，并将导致不同dar (0、1、2、3、4
…
、》10)的异质群体。半胱氨酸缀合的途径将导致利用抗体的4个二硫键的偶数dar (例如0、2、4、6和8)的群体。为了使adc物类的异质性最小化，可以使用位点特异性缀合方法。这些方法对与抗体连接的有效载荷分子的精确数目和位置具有更好的控制，但是由于缀合的毒性分子的量有限(例如通常仅2个)和缀合位点的选择有限而具有挑战性，因为其可能影响药物的功效。为了克服adc异质性中的制造挑战，一些色谱技术可以用于去除不期望的低dar和高dar物类。低dar物类是不期望的，因为它们与抗体药物缀合物竞争并降低药物的功效。携带dar物类的高毒性有效载荷(》6)也是不期望的，因为它们对药物效率和寿命有作用(k.j. hamblett等人, clinical cancer research 10 (2004) 7063-7070)。关于adc的进一步信息可以在rachel s. zolot, satarupa basu, ryan p. million. antibody
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drug conjugates. nature reviews drug discovery. 2013, 12：259-260中找到。关于示例性adc的细节可以在wo 2011/139985，尤其是实施例8中找到。
4.疏水相互作用色谱法有时应用于adc物类缀合后方法的纯化(us15104359)。不幸的是，由于在高盐浓度溶液中adc稳定性低和结合能力低(约10 mg/ml)，引起纯化成本高和纯化效率低，该方法受到限制。因此，在工业上越来越需要增强adc药物的效率，主要获得dar2和dar4物类，并能够获得最佳的药物动力学、功效、半衰期和耐受性。
5.因此，找到提供稳健和可靠的抗体药物缀合物纯化步骤的方法将是有利的，该方法可有效地应用于广泛的条件，其中不同的dar物类被有效地分离。这对于降低纯化成本也是有益的。


技术实现要素：

6.已经发现，携带共价附着的亮氨酸残基或类似残基的离子交换材料可以用于纯化adc，能够在》10 mg adc/ml材料容量下进行有效的dar (药物抗体比率)物类分离，其中在更优选的实施方案中，所述容量在10-80 mg/ml之间。此外，这种创新的离子交换材料可以以》10 ms/cm的高电导率使用，其中在更优选的实施方案中，电导率在10-40 ms/cm之间。令
人惊奇的是，可以使用溶剂ph梯度分离每个单独的dar物类，而不管它们的缀合程序如何。此外，与疏水相互作用或羟基磷灰石材料相比，应用这种创新的离子交换材料显示显著的经济优势，确保》90%的产物回收率。
7.因此，本发明涉及用于离子交换色谱法的分离材料，其基于含羟基的基础基质，聚合物链通过共价键合接枝到所述基础基质的表面，其特征在于a)基础载体含有羟基，b)所述聚合物链共价键合到所述载体，c)所述聚合物链包含氨基酸端基-n(y)-r3，其中y彼此独立地为h或ch3，优选h，和r3为-chcoomr4其中r4为c1-c4烷基(如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基，优选异丙基和异丁基，非常优选异丁基)或c1-c4全氟烷基并且m为h、na、k或nh4 。
8.优选地，所述聚合物链的单体单元以线性方式连接，并且每个单体单元包含端基-n(y)-r3。
9.优选地，离子密度在10-1200 μeq/g之间。
10.在优选的实施方案中，y为h并且r4为异丙基和/或异丁基。
11.在优选的实施方案中，所述含羟基的基础基质包含脂族羟基。
12.在优选的实施方案中，所述基础基质是通过至少一种选自a)和b)的化合物的共聚形成的共聚物，其中a)至少一种式i的亲水取代的烷基乙烯基醚其中r1、r2、r3彼此独立地可以是h或c1-c6烷基，优选h或-ch3，并且r4为携带至少一个羟基的基团和b)至少一种符合式ii和/或iii和/或iv的交联剂，其中x为具有2-5个c原子，优选2或3个c原子的二价烷基，其中一个或多个不相邻的且不位于n直接邻近的亚甲基可以被o、c=o、s、s=o、so2、nh、noh或n代替，并且亚甲基的一个或多个h原子可以彼此独立地被羟基、c1-c6-烷基、卤素、nh2、c5-c10-芳基、nh-(c1-c8)-烷基、n-(c1-c8)-烷基2、c1-c6-烷氧基或c1-c6-烷基-oh取代，和
其中在式iii和iv中的y1和y2彼此独立地为c1-c10烷基或环烷基，其中一个或多个不相邻的亚甲基或不位于n直接邻近的亚甲基可以被o、c=o、s、s=o、so2、nh、noh或n代替，并且亚甲基的一个或多个h可以彼此独立地被羟基、c1-c6-烷基、卤素、nh2、c5-c10-芳基、nh(c1-c8)烷基、n(c1-c8)烷基2、c1-c6-烷氧基或c1-c6-烷基-oh取代，或c6-c18芳基，其中芳基系统中的一个或多个h可以彼此独立地被羟基、c1-c6-烷基、卤素、nh2、nh(c1-c8)烷基、n(c1-c8)烷基2、c1-c6-烷氧基或c1-c6-烷基-oh取代，和a为具有2-5个c原子，优选2或3个c原子的二价烷基，其中一个或多个不相邻的亚甲基或不位于n直接邻近的亚甲基可以被o、c=o、s、s=o、so2、nh、noh或n代替，并且亚甲基的一个或多个h可以彼此独立地被羟基、c1-c6-烷基、卤素、nh2、c5-c10-芳基、nh(c1-c8)烷基、n(c1-c8)烷基2、c1-c6-烷氧基或c1-c6-烷基-oh取代。
13.式i中的r4通常为携带至少一个羟基的烷基、脂环族基团或芳基。
14.在非常优选的实施方案中，所述基质通过亲水取代的烷基乙烯基醚和作为交联剂的二乙烯基亚乙基脲(1,3-二乙烯基咪唑啉-2-酮)的共聚而形成，所用的亲水取代的烷基乙烯基醚选自1,4-丁二醇单乙烯基醚、1,5-戊二醇单乙烯基醚、二甘醇单乙烯基醚或环己烷二甲醇单乙烯基醚。
15.在优选的实施方案中，所述分离材料可通过使所述含羟基的基础基质经历根据式v的单体的铈(iv)催化的接枝聚合而制备其中r1、r2和y彼此独立地为h或ch3，优选h，r3为-chcoomr4其中r4为c1-c4烷基(如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基，优选异丙基和异丁基，非常优选异丁基)或c1-c4全氟烷基并且m为h、na、k或nh
4
。
16.该接枝聚合优选根据us 5453186第9页实施例8进行。
17.本发明进一步涉及通过使包含adc的样品与包含含羟基的基础基质的分离材料接触而色谱纯化和/或分离抗体药物缀合物(adc)，聚合物链通过共价键合接枝到所述基础基
质的表面，其特征在于a)基础载体含有羟基，b)所述聚合物经由羟基共价键合到所述载体，c)所述聚合物包含端基-n(y)-r3，其中y彼此独立地为h或ch3，优选h，和r3为-chcoomr4其中r4为c1-c4烷基(如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基，优选异丙基和异丁基，非常优选异丁基)或c1-c4全氟烷基并且m为h、na、k或nh
4
。
18.在优选的实施方案中，adc靶分子在2-7之间的ph下结合到所述分离基质，任选洗涤，并通过提高ph值至碱性ph(优选高于9的值 ，例如在9-11之间，优选至约10)来洗脱。
19.在优选的实施方案中，将所述样品施加到以10-1200 μeq/g之间的离子密度的分离基质。
20.在优选的实施方案中，每ml所述分离材料结合10 mg至100 mg之间的adc。
附图说明
21.图1显示根据本发明的分离材料的示意图，所述分离材料的基础材料(点)用通过丙烯酰亮氨酸单体的聚合构建的线性聚合物官能化。
22.图2显示根据本发明的分离材料的示意图，所述分离材料的基础材料(点)用通过丙烯酰缬氨酸单体的聚合构建的线性聚合物官能化。
23.图3显示缬氨酸和亮氨酸与丙烯酰氯的反应流程。
24.图4显示在10 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
25.图5显示在分析hplc柱(mabpac hic-butyl 5 μm，4.6
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100 mm (p/n：088558)，thermo fisher scientific)上使用降低电导率和增加2-丙醇量的线性梯度抗体药物缀合物物类洗脱的定性实例。缓冲液a由1.5 m硫酸铵、0.05 m磷酸盐(ph 7.0)和5% 2-丙醇组成，而缓冲液b由0.05 m磷酸盐(ph 7.0)和20% 2-丙醇组成。hplc柱以1 ml/min流速操作，并且在20分钟内实现从缓冲液a到缓冲液b的梯度。adc样品在缓冲液a中以5 mg/ml浓度稀释，并在梯度洗脱之前将10μl注射到hplc柱上。
26.图6显示样品级分表征的分析结果，其在分析的洗脱级分(5a1至5b7)的定量面积中显示，包括在10 mg adc/ml cv负载和250 mmnacl下负载的adc (负载)。
27.图7显示在30 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
28.图8表示样品级分表征的分析结果，其在分析的洗脱级分(5a2至5c6)的定量面积中显示，包括在30 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下负载的adc (负载)。
29.图9表示adcetris
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样品的去卷积质谱，显示从dar0至dar4物类范围内的dar物类的分布。由于较低dar物类的低电离和方法过载，dar6物类不可检测。
30.图10显示洗脱级分5a7的去卷积质谱，表示第一洗脱峰的最大值。获得的分子量是对于dar2物类，没有明显存在其它dar物类。
31.图11显示洗脱级分5b4的去卷积质谱，表示第二洗脱峰的最大值。获得的分子量是对于dar4物类，没有明显存在其它dar物类。
32.图12显示洗脱级分5b11的去卷积质谱，表示第三洗脱峰的最大值。获得的分子量是对于dar4物类和dar6物类。信号强度不是定量的。
33.图13表示在60 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
34.图14显示样品级分表征的分析结果，其在分析的洗脱级分(1a1至3g12)的定量面积中显示，包括在60 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下负载的adc (负载)。
35.图15显示使用capto
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mmc impres树脂在30 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
36.图16表示样品级分表征的分析结果，其在分析的洗脱级分(4a3至2c2)的定量面积中显示，包括在30 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下负载的adc (负载)。
37.图17显示在10 mg adc/ml cv负载和50 mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
38.图18显示在10 mg adc/ml cv负载和100 mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
39.图19显示在10 mg adc/ml cv负载和150 mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
40.图20显示在10 mg adc/ml cv负载和200 mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
41.图21显示在10 mg adc/ml cv负载和300 mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
42.图22显示在10 mg adc/ml cv负载和350mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
43.图23显示使用步骤方法在10 mg adc/ml cv负载和300 mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
44.图24显示在30 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
45.图25表示在分析hplc柱(mabpac hic-butyl 5 μm，4.6
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100 mm (p/n：088558)，thermo fisher scientific)上使用降低电导率和增加2-丙醇量的线性梯度抗体药物缀合物物类洗脱的定性实例。缓冲液a由1.5 m硫酸铵、0.05 m磷酸盐(ph 7.0)和5% 2-丙醇组成，而缓冲液b由0.05 m磷酸盐(ph 7.0)和20% 2-丙醇组成。hplc柱以1 ml/min流速操作，并且在20分钟内实现从缓冲液a到缓冲液b的梯度。adc样品在缓冲液a中以5 mg/ml浓度稀释，并在梯度洗脱之前将10μl注射到hplc柱上。
46.图26显示样品级分表征的分析结果，其在分析的洗脱级分(1a3至3c10)的定量面积中显示，包括在10 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下负载的adc (负载)。
47.图27显示kadcyla
™
样品的去卷积质谱，显示从dar0至dar7物类范围内的dar物类的分布。
48.图28显示洗脱级分3a4样品的去卷积质谱，显示较低dar物类的分布。
49.图29显示洗脱级分3b12样品的去卷积质谱，显示较高dar物类的分布。
50.图30表示在60 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
51.图31显示样品级分表征的分析结果，其在分析的洗脱级分(2a1至4c10)的定量面积中显示，包括在60 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下负载的adc (负载)。
52.图32显示在30 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下capto
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mmc impres色谱树脂上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
53.图33显示样品级分表征的分析结果，其在分析的洗脱级分(2b1至5d1)的定量面积中显示，包括在30 mg adc/ml cv负载和250 mm nacl下负载的adc (负载)。
54.图34显示使用步骤方法在10 mg adc/ml cv负载和400 mm nacl下，分离基质上结合的adc的洗脱峰。uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
55.在实施例中进一步解释图4-34。
具体实施方式
56.在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于特定的组合物或方法步骤，因为这些可以变化。必须注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另外清楚地规定。因此，例如，提及“一个配体”包括多个配体，并且提及“一种抗体”包括多种抗体等。
57.除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。为了本文所述的本发明的目的，定义以下术语。
58.如本文所用的术语“靶分子”是指将从样品中的一种或多种其它组分(例如杂质)中分开、分离或纯化的任何分子、物质或化合物。靶分子的实例是adc。在生产和/或纯化方法中，靶分子通常存在于液体中。液体可以是水、缓冲液、非水性溶剂(如乙醇)或其任何混合物。除了靶分子之外，所述液体可以包含一种或多种杂质。液体也可以称为样品。液体的组成在生产和/或纯化期间可以根据所进行的方法步骤而改变。在色谱步骤之后，由于在色谱步骤中使用的洗脱液，液体通常包含除之前之外的其它溶剂。通常仅在最后的纯化步骤之后，可以干燥靶分子以制备最终剂型。
59.术语“抗体”是指具有特异性结合到抗原的能力的蛋白质。“抗体”或“igg”还指基本上由一种或多种免疫球蛋白基因编码的多肽或其片段，其特异性结合和识别分析物(抗原)。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，它们进而分别定义免疫球蛋白类别igg、igm、iga、igd和ige。
60.示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25 kd)和一条“重”链(约50-70 kd)，所述链例如通过链间二硫键稳定。每条链的n末端限定了约100-110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(v l)和可变重链(v h)分别指这些轻链和重链。
61.抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以以单体或聚合物形式存在，例如以五聚体形式存在的igm抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的iga抗体。抗体还可包括多特异性抗体(例如，二特异性抗体)和抗体片段，只要它们保留或被修饰以包含配体特异性
结合结构域。术语“片段”是指抗体或抗体链的部分或一部分，其包含比完整或完全抗体或抗体链更少的氨基酸残基。片段可以经由化学或酶处理完整或完全的抗体或抗体链来获得。片段也可以通过重组手段获得。当重组产生时，片段可以单独表达或作为被称为融合蛋白的较大蛋白的一部分表达。示例性片段包括fab、fab'、f(ab')2、fc和/或fv片段。示例性融合蛋白包括fc融合蛋白。根据本发明，融合蛋白也包括在术语“抗体”中。
62.在一些实施方案中，抗体是含fc区的蛋白质，例如免疫球蛋白。在一些实施方案中，含fc区的蛋白质是重组蛋白，其包括与另一个多肽或其片段融合的免疫球蛋白的fc区。示例性多肽包括，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素α链；胰岛素β链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子viiic、因子ix、组织因子和von willebrand因子；抗凝血因子，例如蛋白c；心房促钠尿排泄因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或组织型纤溶酶原激活物(t-pa)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；rantes (受正常表达和分泌的t细胞激活调节)；人巨噬细胞炎性蛋白(mip-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；muellerian抑制物质；松弛素α-链；松弛素β链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，例如β-内酰胺酶；dnase；ige；细胞毒性t淋巴细胞相关抗原(ctla) (例如ctla-4)；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(vegf)；激素或生长因子的受体；蛋白质a或d；类风湿因子；神经营养因子，例如骨衍生的神经营养因子(bdnf)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6 (nt-3、nt-4、nt-5或nt-6)，或神经生长因子，例如ngf-β.；血小板衍生的生长因子(pdgf)；成纤维细胞生长因子，例如αfgf和βfgf；表皮生长因子(egf)；转化生长因子(tgf)，例如tgf-α和tgf-β，包括tgf-βl、tgf-β2、tgf-β3、tgf-β4或tgf-β5；胰岛素样生长因子-i和-ii (igf-i和igf-ii)；des (l-3)-igf-i (脑igf-i)，胰岛素样生长因子结合蛋白(igfbp)；cd蛋白，例如cd3、cd4、cd8、cd19、cd20、cd34和cd40；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(bmp)；干扰素，例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(csf)，例如m-csf、gm-csf和g-csf；白细胞介素(il)，例如il-1到il-10；超氧化物歧化酶；t细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如aids包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，例如cdl ia、cdl ib、cdl ic、cd 18、icam、vla-4和vcam；肿瘤相关抗原，例如her2、her3或her4受体；和任何上述多肽的片段和/或变体。此外，根据本发明的抗体是特异性结合到任何上述多肽的任何蛋白质或多肽、其片段或变体。
63.如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“样品”是指含有靶分子的任何组合物或混合物。样品可以衍生自生物或其它来源。生物来源包括真核来源，如动物或人。优选的样品是衍生自哺乳动物的血液或血浆样品。样品还可以包括稀释剂、缓冲液、洗涤剂和发现与靶分子混合的污染物类等。样品可以是“部分纯化的
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(即，已经经历一个或多个纯化步骤，例如过滤或离心步骤)或可以直接从生产靶分子的生物体获得。血浆样品是包含血浆或血浆部分的任何样品。
64.如本文所用的术语“杂质”或“污染物”是指任何外来或不良分子，包括生物大分子例如dna、rna、一种或多种宿主细胞蛋白质、核酸、内毒素、脂质、合成来源的杂质和一种或多种添加剂，其可以存在于含有与一种或多种外来或不良分子分离的靶分子的样品中。如本文所用的术语“杂质”或“污染物”也可以应用于需要从靶分子中分离的某些免疫球蛋白，
如在患者中引起过敏反应的免疫球蛋白a以及免疫球蛋白m。另外，这样的杂质可以包括在生产和/或纯化方法的步骤中使用的任何试剂。
65.如本文可互换使用的术语“纯化”、“分离”或“分开”是指通过将靶分子从包含靶分子和一种或多种其它组分(例如杂质)的组合物或样品中分离来提高靶分子的纯度。通常，通过从组合物中(完全或部分)去除至少一种杂质来提高靶分子的纯度。
66.术语“色谱”是指将感兴趣的分析物(例如靶分子)与混合物中存在的其它分子分离的任何种类的技术。通常，由于混合物的单个分子在流动相的影响下迁移通过固定介质或基质的速率的差异，或在结合和洗脱方法中，靶分子与其它分子分离。色谱分离方法的实例是反相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和力色谱法、疏水相互作用色谱法和混合模式色谱法。
[0067]“缓冲液”是通过其酸-碱共轭组分的作用抵抗ph变化的溶液。在buffers. a guide for the preparation and use of buffers in biological systems, gueffroy, d.编辑. calbiochem corporation (1975)中描述了可以根据例如缓冲液的期望的ph而使用的各种缓冲液。缓冲液的非限制性实例包括mes、mops、mopso、tris、hepes、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸和铵缓冲液，以及这些的组合。
[0068]
术语“基质”、“色谱基质”、“分离基质”以及分离材料在本文中可互换使用，并且是指在分离方法中用作固定相并将靶分子(例如，含fc区的蛋白质，例如免疫球蛋白)与混合物中存在的其它分子分离的任何种类的吸附剂、载体、树脂或固相。通常，由于混合物的单个分子迁移通过基质并在流动相的影响下与基质相互作用的速率的差异，或在结合和洗脱方法中，靶分子与其它分子分离。通常由树脂颗粒、整体吸附剂或膜组成的基质可以放入柱或筒中。通常，基质携带一种或多种类型的配体，这意味着基质包含一种或多种类型的配体与之附着的基础基质或基础材料。
[0069]“配体”是官能团或包含官能团，并且附着于色谱基础基质，并确定或影响基质的结合性质。优选地，配体是携带一个或多个(优选多个)官能团的聚合物链。最优选的是由每个单体单元携带至少一个官能团的聚合物链构成的配体，由所述单体单元构成所述聚合物链。“配体”的实例包括但不限于离子交换基团、疏水相互作用基团、亲水相互作用基团、亲硫相互作用基团、金属亲和基团、亲和基团、生物亲和基团和混合模式基团(上述基团的组合)。本文可以使用的优选的配体包括但不限于弱离子交换基团，例如羧酸。
[0070]
术语“离子交换”和“离子交换色谱法”是指这样的色谱方法，其中混合物中的靶分子(例如，含fc区的靶蛋白质)与连接(例如通过共价附着)到离子交换基质的带电荷的化合物相互作用，使得靶分子比在混合物中的溶质杂质或污染物更多或更少地与带电荷的化合物非特异性相互作用。混合物中的杂质比靶分子更快或更慢地从离子交换材料的柱中洗脱，或者相对于靶分子结合到树脂或从树脂中排除。“离子交换色谱法”具体包括阳离子交换、阴离子交换和混合模式离子交换色谱法。离子交换色谱法可以结合靶分子(例如，含fc区的靶蛋白质)，随后洗脱，或者可以在靶分子“流通”柱时主要结合杂质。优选地，离子交换色谱法步骤以结合和洗脱模式进行。
[0071]
短语“离子交换基质”是指带负电荷(即阳离子交换树脂)或带正电荷(即阴离子交换树脂)的色谱基质。电荷可以通过将一个或多个带电荷的配体附着于基质来提供，例如通过共价连接。作为另外一种选择或除此之外，电荷可以是基质的固有性质。
[0072]
术语“阳离子交换基质”在本文中用于指带负电荷的色谱基质，例如具有一个或多个带负电荷的配体，例如与之附着的羧酸基团。
[0073]
当以结合和洗脱模式“负载”分离柱时，缓冲液用于将包含靶分子(例如，含fc区的靶蛋白质)和一种或多种杂质的样品或组合物负载到色谱柱(例如，离子交换柱)上。缓冲液具有电导率和/或ph，使得靶分子结合到色谱基质，而理想地所有杂质不结合并且流通柱。
[0074]
当“负载”分离柱以“流通”靶分子时，缓冲液用于将包含靶分子(例如，含fc区的靶蛋白质)和一种或多种杂质的样品或组合物负载到色谱柱(例如，离子交换柱)上。缓冲液具有电导率和/或ph，使得靶分子不结合到色谱基质并且流通柱，同时理想地所有杂质都结合到柱。
[0075]
当“负载”分离柱以“结合和洗脱”靶分子时，缓冲液用于将包含靶分子(例如，含fc区的靶蛋白质)和一种或多种杂质的样品或组合物负载到色谱柱(例如，离子交换柱)上。缓冲液具有电导率和/或ph，使得靶分子结合到色谱基质。与一种或多种杂质的分离伴随着电导率和/或ph的变化，使得在一种或多种杂质之前或之后洗涤或洗脱靶分子。
[0076]
通常，其中将样品负载到基质上的缓冲液称为负载缓冲液或样品缓冲液。
[0077]
术语“平衡”是指在负载靶分子之前使用缓冲液来平衡色谱基质。通常，负载缓冲液用于平衡。
[0078]“洗涤(wash)”或“洗涤(washing)”色谱基质是指使合适的液体(例如缓冲液)通过或越过基质。通常，在洗脱靶分子之前使用洗涤从基质中去除弱结合的污染物和/或在负载之后去除未结合的或弱结合的靶分子。
[0079]
在这种情况下，通常，洗涤缓冲液和负载缓冲液是相同的。在使用病毒灭活缓冲液的情况下，在洗脱靶分子之前，其用于灭活某些存在的病毒。在这种情况下，通常，病毒灭活缓冲液不同于负载缓冲液，因为它可以含有一种或多种洗涤剂或具有不同的性质(ph/电导率/盐和它们的量)。
[0080]
在洗脱靶分子之后，洗涤也可用于从基质中去除污染物。这通过在洗脱靶分子后使适当的液体(例如缓冲液)通过或越过基质来进行。在这种情况下，通常，洗涤缓冲液不同于负载缓冲液。它可以含有一种或多种洗涤剂或具有不同的性质(ph/电导率/盐和它们的量)。洗涤缓冲液例如是酸性缓冲液。
[0081]
从色谱基质“洗脱”分子(例如，感兴趣的的多肽如免疫球蛋白g或杂质)是指从其中去除分子。当用负载缓冲液的溶剂前沿洗脱靶分子时，可以直接以流通模式进行洗脱，或者通过改变溶液条件使得不同于负载缓冲液的缓冲液与感兴趣的分子竞争色谱基质上的配体位点。非限制性实例是通过改变离子交换材料周围的缓冲液的离子强度，使得缓冲液与分子竞争离子交换材料上的带电荷的位点，从离子交换基质中洗脱分子。
[0082]
术语“平均粒度直径”或d50是指在累积粒度分布的50%处的平均粒度分布值。粒度通过激光衍射确定，优选使用malvern
ꢀ‘
master sizer。
[0083]
术语“平均孔径”是指在累积孔径分布的50%处的平均孔径分布值。
[0084]
如本文可互换使用的术语“流通方法”、“流通模式”和“流通操作”是指分离技术，其中包含在样品中的至少一种靶分子(例如含fc区的蛋白质或抗体)与一种或多种杂质一起旨在流通通常结合一种或多种杂质的色谱基质，其中靶分子通常不结合(即流通)并且用负载缓冲液从基质中洗脱。
[0085]
如本文所用，术语“结合和洗脱模式”和“结合和洗脱方法”是指分离技术，其中包含在样品中的至少一种靶分子(例如，含fc区的蛋白质)结合到合适的色谱基质(例如，离子交换色谱介质)，并且随后用不同于负载缓冲液的缓冲液洗脱。
[0086]“抗体-药物缀合物”或“adc”是指抗体或其抗原结合片段，并且缀合到药物，例如细胞毒性剂、细胞抑制剂和/或治疗剂，如下文进一步描述的。
[0087]
术语“药物”在本文中与“有效载荷”可互换使用，并且是指缀合或待缀合到抗体的化合物或蛋白质或蛋白质片段或其它细胞毒性剂、生长抑制剂或显像剂。因此，在一些实施方案中，药物是小分子。在一些实施方案中，小分子是细胞毒性剂或显像剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂选自蒽环霉素、阿里他汀、多拉司他汀、倍癌霉素、烯二炔、格尔德霉素、美登素、嘌呤霉素、紫杉烷、长春花生物碱、sn-38、微管溶素、半紫菀素(hemiasterlin)及其立体异构体、等排物、类似物或衍生物。在一些实施方案中，药物是生物相容性聚合物或多肽。本文所用的“药物”不应被解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物活性的蛋白质或多肽。优选地，药物是小分子。
[0088]
术语“药物与抗体比率
”ꢀ
(缩写为“dar”)是指每个抗体缀合的药物分子的数目。多种抗体-药物缀合物的组合物、批次和/或制剂可以通过平均dar来表征。dar和平均dar可以通过各种常规手段确定，例如uv光谱法、质谱法、elisa测定、辐射测量方法、疏水相互作用色谱法(hic)、电泳和hplc。
[0089]
如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32和lu的放射性同位素)、化疗剂、酶及其片段例如溶核酶、抗生素和毒素例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体，以及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
[0090]
如下描述其它细胞毒性剂。杀肿瘤剂引起肿瘤细胞的破坏。“化疗剂”是可用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷基化剂，例如塞替派和cytoxan(r)环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖丙啶类，例如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；亚乙基亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、塞替派和三羟甲蜜胺；乙酰氧苷类(特别是布拉他辛和布拉他辛酮)；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，marinol(r))；β-拉伯酮；拉伯醇；秋水仙碱；白桦脂酸；喜树碱(包括合成类似物托泊替康(hycamtin(r))、cpt-11 (伊立替康、camptosar(r))、乙酰喜树碱、东莨菪素和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；callystatin；cc-1065 (包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；cryptophycins (特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物kw-2189和cb1至tm1)；五加苷素；水鬼蕉碱；珊瑚素；spongistatin；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氮芥氧化物、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如加利车霉素，尤其是加利车霉素γll和加利车霉素ωll) (例如参见agnew, chem intl. ed. engl., 33：183-186 (1994))；达因霉素，包括达因霉素a；埃博霉素；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素
c、carabicin、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素d、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、adrimycin(r)多柔比星，包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、马赛罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素c、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；5-氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝西布；比生群；依达曲沙；去甲伪麻黄碱；秋水仙碱；地吖醌；依福明；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝铵；喷司他丁；phenamet；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；psk(r)多糖复合物(jhs natural products, eugene, or)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2',2
″‑
三氯三乙胺；单端孢菌素(特别是t-2毒素、verracurin a、roridin a和anguidine)；乌拉坦；长春地辛(eldisine(r)、fildesin(r))；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；胞嘧啶；阿拉伯糖苷(“阿糖胞苷”)；塞替派；紫杉烷类，例如taxol(r)紫杉醇(bristol-myers squibb oncology, princeton, n.j.)；无cremophor的abraxanetm，白蛋白工程化的紫杉醇纳米颗粒制剂(american pharmaceutical partners, schaumberg, illinois)，和taxotere(r)多西他赛(rhone-poulenc rorer, antony, france)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemzar(r))；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱(velban(r))；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(oncovin(r))；奥沙利铂；亚叶酸；长春瑞滨(navelbine(r))；诺消灵；依达曲沙；道诺霉素；氨蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视色素，例如维生素a酸；卡培他滨(xeloda(r))；以上任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上两种或更多种的组合，例如chop (环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的组合疗法的缩写)和folfox (具有与5-fu和亚叶酸组合的奥沙利铂(eloxatintm)的治疗方案的缩写)。
[0091]
该定义中还包括抗激素剂，其起调节、降低、阻断或抑制可以促进癌症生长的激素的作用，并且通常为系统或全身治疗的形式。它们本身可以是激素。实例包括抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(serm)，包括例如他莫昔芬(包括nolvadex (r)他莫昔芬)、evista (r)雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、ly117018、奥那司酮和fareston (r)托瑞米芬；抗黄体酮；雌激素受体下调剂(erd)；用于抑制或关闭卵巢功能的试剂，例如，黄体化激素释放激素(lhrh)激动剂，例如lupron(r)和eligard(r)醋酸亮丙瑞林、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲普瑞林；其它抗雄激素药，例如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；和抑制调节肾上腺中雌激素生产的酶芳香酶的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、megase (r)醋酸甲地孕酮、aromasin (r)依西美坦、福美坦、法倔唑、rivisor (r)伏氯唑、femara (r)来曲唑和arimidex (r)阿那曲唑。此外，化疗剂的这样的定义包括双膦酸盐，例如氯膦酸盐(例如，bonefos(r)或ostac(r))、didrocal(r)依替膦酸盐、ne-58095、
zometa(r)唑来膦酸/唑来膦酸盐、fosamax(r)阿仑膦酸盐、aredia(r)帕米膦酸盐、skelid(r)替鲁膦酸盐或actonel(r)利塞膦酸盐；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途径中基因表达的那些，例如pkc-α、raf、h-ras和表皮生长因子受体(egf-r)；疫苗，例如theratope(r)疫苗和基因疗法疫苗，例如allovectin(r)疫苗、leuvectin(r)疫苗和vaxid(r)疫苗；lurtotecan(r)拓扑异构酶1抑制剂；abarelix(r) rmrh；二甲苯磺酸拉帕替尼(erbb-2和egfr双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为gw572016)；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0092]
本文所用的“生长抑制剂”是指在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物，所述细胞尤其是表达tat的癌细胞。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于s期的表达tat的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进展(在s期以外的位置)的试剂，例如诱导gl停滞和m期停滞的试剂。经典的m期阻断剂包括长春花碱类(vinca)(长春新碱和长春碱)、紫杉烷和拓扑异构酶ii抑制剂，例如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。停滞gl的那些药剂也溢出到s期停滞，例如，dna烷基化剂，例如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。进一步的信息可以在the molecular basis of cancer, mendelsohn和israel编辑, 第1章, 题为"cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs"，murakami等人 (wb saunders：philadelphia, 1995), 尤其是第13页中找到。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)是均衍生自紫杉树的抗癌药物。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(taxotere(r)，rhone-poulenc rorer)是紫杉醇的半合成类似物(taxol(r)，bristol-myers squibb)。紫杉醇和多西他赛促进微管从微管蛋白二聚体装配，并通过防止解聚来稳定微管，这导致细胞中有丝分裂的抑制。
[0093]
本发明涉及adc的纯化。如上所定义的，adc是通过将抗体与毒素(通常是小分子毒素)共价结合(优选经由接头，包括赖氨酸耦合、轻链和重链还原性二硫化物耦合或其它耦合方法)形成的抗体缀合的药物。抗体可以是任何种类的抗体或抗体片段，例如多克隆抗体或单克隆抗体，优选单克隆抗体。小分子毒素的实例是美登素衍生物dm1 (n2'-脱乙酰基-n2'-3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)、dm4 (n2'-脱乙酰基-n2'-4)-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素及其类似物、海豚毒素衍生物mmae (单甲基金立他汀e、甲基金立他汀e)、mmaf (单甲基金立他汀f、甲基金立他汀f)及其类似物。示例性接头是smcc (4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)。
[0094]
本发明提供分离材料，也称为树脂，其包含基础基质，聚合物链共价附着于所述基础基质。聚合物链由包含氨基酸和可聚合双键的单体制成。
[0095]
本发明进一步提供用于分离和纯化adc的方法，例如用于分离具有不同dar的adc或用于从抗体药物缀合物(adc)制剂中去除高分子量物类，特别是聚集体。本发明可用于大规模纯化抗体药物缀合物制剂。在本发明的特定方面，消除具有高dar (dar》6)的adc是有益的，所述adc更疏水并且证明更快的清除，这可能有助于更高的毒性和更低的治疗指数(tl)。在本发明的其它方面，消除具有低dar (dar《2)的adc是有益的，所述adc对功效贡献很小，然而，提供增加未缀合的抗体的量，所述未缀合的抗体可以与adc竞争靶抗原，并导致较低的tl。在本发明的另一方面，消除具有高dar (dar》6)的adc和具有低dar (dar《2)的adc是有益的。在本发明的一个实施方案中，纯化的adc含有3.5-4.5之间(并且在另一个实施方案中，3-5之间)的药物负载(药物与抗体比率，dar)。
[0096]
本发明的分离材料包含与其接枝触须样结构的基础材料。
[0097]
基础材料(也称为基础基质)含有可进行接枝聚合反应的反应性基团，特别是oh基团，优选脂族oh基团。因此，基础材料也可以由例如有机聚合物制备。这种类型的有机聚合物可以是多糖，例如琼脂糖、葡聚糖、淀粉、纤维素等，或合成聚合物，例如聚(丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、亲水取代的聚(烷基烯丙基醚)、亲水取代的聚(烷基乙烯基醚)、聚(乙烯醇)、聚(苯乙烯)和相应单体的共聚物。这些有机聚合物也可以优选以交联的亲水网络的形式使用。这也包括由苯乙烯和二乙烯基苯制成的聚合物，其可以优选以亲水化的形式使用，如其它疏水性聚合物。
[0098]
或者，可以使用无机材料(例如二氧化硅、氧化锆、二氧化钛、氧化铝等)作为基础材料。同样可以使用复合材料，即，例如本身可以通过可磁化颗粒或可磁化芯的共聚而磁化的颗粒。
[0099]
然而，优选使用对水解稳定或仅能困难地水解的亲水性基础材料，因为根据本发明的材料应优选在延长的使用持续时间内在例如碱性ph下经受碱性清洁或再生。
[0100]
基础材料可以由不规则形状或球形颗粒组成，其粒度可以在2-1000 μm之间。优选粒度在3-300 μm之间。
[0101]
基础材料可以特别地是无孔或优选多孔颗粒的形式。孔径可以在2-300 nm之间。优选孔径在5-200 nm之间。
[0102]
基础材料同样也可以是膜、纤维、中空纤维、涂层或整体模具的形式。整体模具优选是多孔的三维体，例如圆柱形。
[0103]
在优选的实施方案中，基础材料是通过至少一种选自a)和b)的化合物的共聚形成的共聚物，a)至少一种式i的亲水取代的烷基乙烯基醚其中r1、r2、r3彼此独立地可以是h或c1-c6烷基，优选h或-ch3，并且r4为携带至少一个羟基的基团和b)至少一种符合式ii和/或iii和/或iv的交联剂，其中x为具有2-5个c原子，优选2或3个c原子的二价烷基，其中一个或多个不相邻的且不位于n直接邻近的亚甲基可以被o、c=o、s、s=o、so2、nh、noh或n代替，并且亚甲基的一个或多个h原子可以彼此独立地被羟基、c1-c6-烷基、卤素、nh2、c5-c10-芳基、nh-(c1-c8)-烷基、n-(c1-c8)-烷基2、c1-c6-烷氧基或c1-c6-烷基-oh取代，和
其中在式iii和iv中的y1和y2彼此独立地为c1-c10烷基或环烷基，其中一个或多个不相邻的亚甲基或不位于n直接邻近的亚甲基可以被o、c=o、s、s=o、so2、nh、noh或n代替，并且亚甲基的一个或多个h可以彼此独立地被羟基、c1-c6-烷基、卤素、nh2、c5-c10-芳基、nh(c1-c8)烷基、n(c1-c8)烷基2、c1-c6-烷氧基或c1-c6-烷基-oh取代，或c6-c18芳基，其中芳基系统中的一个或多个h可以彼此独立地被羟基、c1-c6-烷基、卤素、nh2、nh(c1-c8)烷基、n(c1-c8)烷基2、c1-c6-烷氧基或c1-c6-烷基-oh取代，和a为具有2-5个c原子，优选2或3个c原子的二价烷基，其中一个或多个不相邻的亚甲基或不位于n直接邻近的亚甲基可以被o、c=o、s、s=o、so2、nh、noh或n代替，并且亚甲基的一个或多个h可以彼此独立地被羟基、c1-c6-烷基、卤素、nh2、c5-c10-芳基、nh(c1-c8)烷基、n(c1-c8)烷基2、c1-c6-烷氧基或c1-c6-烷基-oh取代。
[0104]
式i中的r4通常为携带至少一个羟基的烷基、脂环族基团或芳基。
[0105]
在非常优选的实施方案中，所述基质通过亲水取代的烷基乙烯基醚和作为交联剂的二乙烯基亚乙基脲(1,3-二乙烯基咪唑啉-2-酮)的共聚而形成，所用的亲水取代的烷基乙烯基醚选自1,4-丁二醇单乙烯基醚、1,5-戊二醇单乙烯基醚、二甘醇单乙烯基醚或环己烷二甲醇单乙烯基醚。
[0106]
合适的可商购获得的基于乙烯基醚的基础材料的实例是德国merck kgaa的eshmuno
®
。
[0107]
线性聚合物链共价键合到基础材料的表面，使得产生分离材料，其中a)基础材料优选含有脂族羟基，b)聚合物共价键合到基础材料，c)聚合物包含氨基酸残基，d)聚合物的单体单元以线性方式连接。
[0108]
包含基础材料和共价附着的线性聚合物链的实际分离材料可以以各种方式制备。在“其上接枝”的情况下，聚合物链必须首先由单体形成，并在第二步中结合到表面。在“接枝自”的情况下，聚合反应在表面上引发，并且接枝聚合物直接由单个单体构成。也可以使用允许结合到载体材料表面的其它聚合方法。
[0109]
优选“接枝自”方法，并且特别优选其中仅形成少量必须分离的副产物(例如非共价键合的聚合物)的变体。具有受控自由基聚合的方法(例如原子转移自由基聚合(atrp)的方法)显得特别合适。在此，在第一步中，引发剂基团以期望的密度共价键合到载体表面。引发剂基团可以是例如经由酯官能团键合的卤化物，如在2-溴-2-甲基丙酸酯中。接枝聚合在
第二步中在铜(i)盐的存在下进行。
[0110]
适用于生产本发明分离材料的非常优选的一步接枝聚合反应可以由在含羟基的载体上的铈(iv)引发，而不必活化载体。
[0111]
这种铈(iv)引发的接枝优选根据ep 0 337 144或us 5,453,186进行。生产的链经由单体单元与基础材料连接。为此，将根据本发明的基础材料悬浮于单体溶液(优选水性溶液)中。在常规的氧化还原聚合过程中，在排除氧的情况下，实现聚合物材料在其上的接枝。所用的聚合催化剂是铈(iv)离子，因为该催化剂在基础材料的表面上形成自由基位点，由此引发单体的接枝聚合。该反应通常在稀无机酸中进行。为了进行这种接枝聚合，酸通常以浓度在1-0.00001 mol/l，优选0.1-0.001 mol/l范围内的水性溶液使用。非常特别优选使用浓度在0.1-0.001 mol/l范围内的稀硝酸。
[0112]
为了制备根据本发明的分离材料，通常将过量的单体加入到基础材料中。通常，每升沉降的聚合物材料使用0.05-100 mol总单体，优选使用0.05-25 mol/l。
[0113]
聚合通过涉及铈盐的终止反应来终止。因此，(平均)链长可能受基础材料、引发剂和单体的浓度比影响。此外，可以使用均匀的单体或者还可以使用不同单体的混合物；在后一种情况下，形成接枝共聚物。
[0114]
有利地用于制备根据本发明的分离材料的单体是根据式v的那些其中r1、r2和y彼此独立地为h或ch3，优选h，r3为-chcoomr4其中r4为c1-c4烷基(如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基，优选异丙基和异丁基，非常优选异丁基)或c1-c4全氟烷基并且m为h、na、k或nh
4
。
[0115]
全氟烷基是指烷基残基的所有h原子被f原子取代。
[0116]
式v的示例性优选结构是va其中r1、r2和y为hr3为-chcoomr4其中r4为异丙基
并且m为h以及式vb其中r1、r2和y为hr3为-chcoomr4其中r4为异丁基并且m为h。
[0117]
这样的单体也可以描述为丙烯酰缬氨酸(式va)、丙烯酰亮氨酸(式vb)、丙烯酰丙氨酸、丙烯酰正亮氨酸、甲基丙烯酰缬氨酸、甲基丙烯酰亮氨酸、甲基丙烯酰丙氨酸、甲基丙烯酰正亮氨酸、二甲基丙烯酰缬氨酸、二甲基丙烯酰亮氨酸、二甲基丙烯酰丙氨酸、二甲基丙烯酰正亮氨酸，其中优选丙烯酰缬氨酸和丙烯酰亮氨酸，特别优选丙烯酰亮氨酸。
[0118]
根据本发明的分离材料优选仅含有接枝到基础材料上的触须样线性聚合物结构，该触须样线性聚合物结构由根据式v的单体构建。优选地，它们含有仅通过根据式v的一种类型的单体构建的线性聚合物。
[0119]
但是线性聚合物也可以通过根据式v的两种或更多种不同的单体的共聚来构建。线性聚合物也可以通过根据式v的一种或多种不同的单体与一种或多种其它可聚合单体的共聚来构建，所述其它可聚合单体如其它丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯等，它们例如用离子基团、亲水性基团或疏水性基团官能化。
[0120]
根据本发明的分离材料的示例性结构示于图1和图2中。图1显示用通过丙烯酰基亮氨酸单体的聚合构建的线性聚合物官能化的基础材料(点)。另外，为了清楚起见，显示每个聚合物单元的羧基-烷基端基。图2显示用通过丙烯酰缬氨酸单体的聚合构建的线性聚合物官能化的基础材料(点)。另外，为了清楚起见，显示每个聚合物单元的羧基-烷基端基。
[0121]
在优选的实施方案中，本发明的分离材料是离子密度窗口在10-1200μeq/g范围内的不同量的离子交换材料，其中在更优选的实施方案中，离子密度窗口在400-900 μeq/g之间。
[0122]
在优选的实施方案中，离子交换材料可以含有离子交换官能团和疏水官能团，其中在更优选的实施方案中，两个官能团都在由已经构建到聚合物链中的一个单体单元产生的单个表面官能单元上，其中在最优选的实施方案中，官能团是氨基酸残基的一部分。
[0123]
本发明进一步涉及色谱柱，其包含上述根据本发明的分离材料。色谱柱是本领域技术人员已知的。它们通常包含填充有分离材料的圆柱形管或筒，以及过滤器和/或用于将分离材料固定在管或筒中的装置，以及用于将溶剂递送到管和从管递送溶剂的连接件。色谱柱的尺寸根据应用(例如分析或制备)而变化。
[0124]
根据本发明的材料也可以描述为具有分离效应的基础材料。它们可用于选择性、部分选择性或非选择性结合或吸附一种或多种靶组分，目的是从样品液体中分离出、或用于选择性、部分选择性或非选择性结合或吸附一种或多种第二组分，目的是从基质中分离
出第二组分，从天然来源中分开、富集和/或消耗生物聚合物，从重组来源中分开、富集和/或消耗生物聚合物，分开、富集和/或消耗蛋白质和肽，分开、富集和/或消耗单克隆和多克隆抗体，分开、富集和/或消耗病毒，分开、富集和/或消耗宿主细胞蛋白质，分开、富集和/或消耗adc。优选的靶分子是adc。
[0125]
将靶分子与来自样品的至少一种或多种其它物质分离，其中将包含靶分子的样品溶解在液体中，使其与根据本发明的材料接触。接触时间通常在30秒至24小时范围内。根据液相色谱法的原理，通过使液体通过含有根据本发明的分离材料的色谱柱来工作是有利的。液体可以仅仅通过其重力流通柱或者借助于泵被泵送通过。一种替代方法是分批色谱，其中只要靶分子或生物聚合物需要能够结合到分离材料，就通过搅拌或摇动将分离材料与液体混合。同样可以根据色谱流化床的原理通过将待分离的液体引入例如包含分离材料的悬浮液中来进行工作，其中选择分离材料使得其由于其高密度和/或磁芯而适于期望的分离。
[0126]
如果色谱方法以结合和洗脱模式进行，则靶分子结合到根据本发明的分离材料。分离材料随后可以用洗涤缓冲液洗涤，所述洗涤缓冲液优选具有与其中靶分子与分离材料接触的液体相同的离子强度和相同的ph。洗涤缓冲液去除所有不结合到分离材料的物质。随后可以用其它合适的缓冲液进行进一步的洗涤步骤而不解吸靶分子。通过改变洗脱液中的离子强度和/或通过改变洗脱液中的ph和/或通过改变溶剂来进行结合的靶分子的解吸。因此，可以在洗脱液中以纯化和浓缩的形式获得靶分子。解吸后靶分子的纯度通常为70%至99%，优选85%至99%，特别优选90%至99%。
[0127]
然而，如果以流通模式运行色谱方法，则靶分子保留在液体中，但其它伴随物质结合到分离材料。然后通过收集通流中的柱洗出液直接获得靶分子。本领域技术人员已知他如何调整条件，特别是ph和/或电导率，以将特异性生物聚合物结合到分离材料，或者不结合靶分子对于纯化任务是否有利。
[0128]
本发明优选涉及上述根据本发明的分离材料用于分离和纯化adc的用途，以及涉及通过液相色谱法纯化和/或分离adc的方法，其包括在酸性条件下使根据本发明的分离材料与包含一种或多种adc的样品接触。
[0129]
出乎意料地，我们发现，根据本发明的离子交换材料可以用于纯化adc，使得在》10 mg adc/ml材料容量下实现有效的dar (药物抗体比率)物类分离，其中在更优选的实施方式中，所述容量在10-80 mg/ml之间。此外，这种创新的离子交换材料可以以》10 ms/cm的高电导率使用，其中在更优选的实施方案中，电导率在10-40 ms/cm之间。令人惊奇的是，可以分离每个单个dar物类，而不管它们的缀合程序，优选使用从4-7到高于9的ph变化，优选在9-11之间，最优选以梯度或步进模式到约ph 10。此外，与疏水相互作用或羟基磷灰石材料相比，应用这种分离材料显示显著的经济优势，确保》90%的产物回收率。另外，本技术不限于分离不同的dar物类，而是可以用于从缀合物中去除未缀合的mab。此外，分离材料的应用不限于分离不同的dar物类，而是可以用于去除未缀合的毒性分子。
[0130]
另外，该材料的应用不限于结合和洗脱应用，而是可以以流通模式使用，导致使用ph《7和/或高电导率(》20ms/cm)的缓冲液时离子交换材料上更高的dar物类吸附。此外，令人惊奇的是，仅主要由共价附着于材料的氨基酸组成的这种离子交换材料对dar物类具有必要的选择性，其中在更优选的实施方案中，这些氨基酸是缬氨酸或亮氨酸，包括其组合和
衍生物，最优选亮氨酸。
[0131]
此外，本发明提供了基于色谱法的adc纯化步骤，其可以再生并且可应用于宽的操作窗口，例如ph 3-10；电导率为1 ms/cm至50 ms/cm。
[0132]
在优选的实施方案中，将根据本发明的离子交换材料掺入色谱柱中，并以结合和洗脱模式用于adc纯化方法以分离dar物类。
[0133]
在优选的实施方案中，将根据本发明的离子交换材料掺入色谱柱中，并以结合和洗脱模式用于adc纯化方法以分离dar物类，其中操作窗口跨度在ph 2至ph 10之间，其中在更优选的实施方案中，ph在4-7之间。
[0134]
在优选的实施方案中，将根据本发明的离子交换材料掺入色谱柱中，并以结合和洗脱模式用于adc纯化方法以分离dar物类，其中溶剂ph洗脱用于回收结合的组分。
[0135]
在优选的实施方案中，将根据本发明的离子交换材料掺入色谱柱中，并以结合和洗脱模式用于adc纯化方法以分离dar物类，其中结合窗口跨度在10 mg adc/ml材料至100 mg adc/ml材料之间，其中在更优选的实施方案中，结合窗口跨度在20 mg adc/ml材料至80 mg adc/ml材料之间。
[0136]
在优选的实施方案中，将根据本发明的离子交换材料掺入色谱柱中，并以结合和洗脱模式用于adc纯化方法以分离dar物类，其中电导率窗口跨度在1 ms/cm至50 ms/cm之间，其中在更优选的实施方案中，电导率范围在2-30 ms/cm之间。
[0137]
在另一个优选的实施方案中，将根据本发明的离子交换材料掺入色谱柱中，并以流通模式用于adc纯化方法以分离dar物类，其中低dar物类在流通物中，而较高dar物类结合到材料。
[0138]
在优选的实施方案中，离子交换材料可以定尺寸在1 μm至200 μm范围内的各种粒度，其中在更优选的实施方案中，平均粒度在20-63 μm之间。
[0139]
在优选的实施方案中，根据本发明的离子交换材料的各种孔径可以在4-1500 nm范围内，其中在更优选的实施方案中，平均孔径在10-120 nm之间，并且在最优选的实施方案中，平均孔径在40-110 nm之间。
[0140]
通过以下附图和实施例来进一步说明本发明，然而，本发明不限于此。
[0141]
上文和下文引用的所有申请、专利和出版物以及2019年7月07日提交的相应的ep专利申请19184130.3的全部公开内容通过引用并入本文。
实施例
[0142]
以下实施例代表本发明的实际应用。
[0143]
1. 分离材料的合成为了制备用于从所述方法接枝的单体，将氨基酸(例如缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸)溶解在ve水中，并通过加入naoh (32%)将ph调节至高于13的ph。在0-5℃之间的温度下，加入丙烯酸类化合物(如丙烯酰氯或丙烯酸)，并将混合物搅拌一小时。
[0144]
缬氨酸和亮氨酸与丙烯酰氯的反应流程图示于图3中。
[0145]
然后通过加入硝酸将ph调节至约ph 2.2。然后加入含oh的基础材料，例如eshmuno
®
颗粒。
[0146]
通过加入硝酸铈(iv)开始聚合。反应在30-50℃下进行4小时。
[0147]
聚合反应后，通过在室温或高温下使用酸性、碱性和溶剂混合物充分洗涤而去除未反应的组分和起始物。
[0148]
为了制备携带全氟烷基化的端基的分离材料，将六氟-缬氨酸溶解在ve水中，并通过加入naoh (32%)将ph调节至高于13的ph。在0-5℃之间的温度下，加入丙烯酸类化合物(如丙烯酰氯或丙烯酸)，并将混合物搅拌一小时。然后通过加入硝酸将ph调节至约ph 2.2。然后加入含oh的基础材料，例如eshmuno
®
颗粒。通过加入硝酸铈(iv)开始聚合。反应在30-50℃下进行4小时。
[0149]
2. 评价根据实施例1制备的离子交换材料(例如平均粒度在20-63 μm之间，平均孔径在40-110 nm之间并且离子密度在400-900 μeq/g之间)分离可商购获得的药物adcetris
®
的adc物类的能力。将离子交换材料填充在5
×
100 mm尺寸的色谱柱中，其中不对称性在0.8-1.2之间，并且》3000个板/m。在填充离子交换材料之后，获得的色谱柱用1 m naoh溶液清洗30分钟，并用ph为4.5的负载缓冲液溶液和300 mm nacl (例如24 ms/cm)预平衡。缓冲液溶液含有盐(例如磷酸二氢钠)、tris、甘氨酸的组合，以获得4.5的ph。使用相同的溶液溶解冻干的adcetris
®
样品直到1 mg/ml浓度。将该溶液负载到制备的色谱柱上，直到对于1 ml树脂达到10 mg adcetris
®
负载。以150 cm/h缓冲液速度进行这些步骤和后续步骤。在负载10 mg/ml adcetris
®
之后，用ph 4.5的缓冲溶液洗涤色谱柱，然后使用ph为8.5的缓冲液和300 mm nacl的梯度洗脱进行洗脱。使用不同的盐(例如磷酸二氢钠)、tris、甘氨酸制备该洗脱缓冲液。在实验设置期间跟踪电导率和ph值，显示由于在梯度洗脱期间ph的变化而实现了从柱的adcetris
®
洗脱。分级样品洗脱，并使用两种不同的dar物类鉴定方法在线评价获得的级分。第一种选择的方法是使用来自thermo fisher scientific的具有4.6
×
100 mm尺寸的mabpac hic-butyl柱的分析疏水相互作用色谱法。对分级的样品的色谱分离使得我们能够基于每种物类的不同的洗脱窗口鉴定不同的dar物类及其质量(例如dar0物类的洗脱在7-9分钟之间，dar2物类的洗脱在10-14分钟之间，dar4物类的洗脱在15-18分钟之间，而dar6物类的洗脱在19-22分钟之间)。
[0150]
10 mg/ml adcetris
®
负载的实例色谱实验示于图4中，其中uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。收集级分，并使用分析hic (疏水相互作用色谱) hplc分析，并使用定量面积计算不同的dar的量(图4)。图5说明在分析hplc柱上线性洗脱梯度期间抗体药物缀合物物类的分离。在uv信号轨迹中鉴定了五个连续的洗脱集合，代表五个不同的抗体药物缀合物物类：峰1表示没有药物的抗体药物缀合物物类，峰2表示具有2个缀合到单个抗体分子的药物分子的抗体药物缀合物物类，峰3表示具有4个缀合到单个抗体分子的药物分子的抗体药物缀合物物类，峰4表示抗体药物缀合物物类的混合物，峰5表示具有6个缀合到单个抗体分子的药物分子的抗体药物缀合物物类。所鉴定的抗体药物缀合物物类的区别在于它们的平均疏水性，一种是更亲水的(例如左侧)至疏水的(例如右侧)。
[0151]
在图6中显示使用疏水相互作用色谱法对收集的级分的分析评价，显示三个获得的峰是dar物类的分离，即第一峰主要是dar2和dar6物类(例如在98 ml处最大洗脱)，第二峰主要是dar4物类(例如在104 ml处最大洗脱)，而第三峰是dar6物类(例如在125 ml处最大洗脱)。
[0152]
如在图6中所示，当使用线性ph梯度洗脱时，不同的dar的分离/富集是可能的。在图1的第一峰中，dar2的纯度增加到40% (起始水平dar2为24%)。在第二峰中，dar4的纯度增
加到65% (起始水平22%)。在第三峰中，dar6的纯度增加到95% (起始水平37%)。
[0153]
3. 在该实验中，评价根据实施例1制备的离子交换材料(例如平均粒度在20-63 μm之间，平均孔径在40-110 nm之间并且离子密度在400-900 μeq/g之间)分离可商购获得的药物adcetris
®
的adc物类的能力。将离子交换材料填充在5
×
100 mm尺寸的色谱柱中，其中不对称性在0.8-1.2之间，并且》3000个板/m。在填充离子交换材料之后，获得的色谱柱用1 m naoh溶液清洗30分钟，并用ph为4.5的负载缓冲液溶液和300 mm nacl (例如24 ms/cm)预平衡。缓冲液溶液含有盐(例如磷酸二氢钠)、tris、甘氨酸的组合，以获得4.5的ph。使用相同的溶液溶解冻干的adcetris
®
样品直到1 mg/ml浓度。将该溶液负载到制备的色谱柱上，直到对于1 ml树脂达到30 mg adcetris
®
负载。以150 cm/h缓冲液速度进行这些步骤和后续步骤。在负载30 mg/ml adcetris
®
之后，用ph 4.5的缓冲溶液洗涤色谱柱，然后使用ph为8.5的缓冲液和300 mm nacl的梯度洗脱进行洗脱。使用不同的盐(例如磷酸二氢钠)、tris、甘氨酸制备该洗脱缓冲液。在实验设置期间跟踪电导率和ph值，显示由于在梯度洗脱期间ph的变化而实现了从柱的adcetris
®
洗脱。分级样品洗脱，并使用两种不同的dar物类鉴定方法在线评价获得的级分。第一种选择的方法是使用来自thermo fisher scientific的具有4.6
×
100mm尺寸的mabpac hic-butyl柱的分析疏水相互作用色谱法。对分级的样品的色谱分离使得我们能够基于每种物类的不同的洗脱窗口鉴定不同的dar物类及其质量(例如dar0物类的洗脱在7-9分钟之间，dar2物类的洗脱在10-14分钟之间，dar4物类的洗脱在15-18分钟之间，而dar6物类的洗脱在19-22分钟之间)。第二种选择的方法是质谱法，其中基于它们的质量和电离比来分离不同的dar物类。使用该方法定性样品评价是可能的，但不是定量的，由于dar物类的不同的电离(例如较高dar物类倾向于电离至较低程度)。30 mg/ml adcetris
®
负载的实例色谱实验示于图7中，其中uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
[0154]
使用疏水相互作用色谱法对收集的级分的分析评价在图8中显示，显示三个获得的峰是dar物类的分离，即第一峰主要是dar2物类(例如在110 ml处最大洗脱)，第二峰主要是dar4物类(例如在125 ml处最大洗脱)，而第三峰是dar6物类(例如在140 ml处最大洗脱)。
[0155]
如在图8中所示，当使用线性ph梯度洗脱时，不同的dar的分离/富集是可能的。在图7的第一峰中，dar2的纯度增加到55% (起始水平28%)。在第二峰中，dar4的纯度增加到81% (起始水平29%)。在第三峰中，dar6的纯度增加到87% (起始水平26%)。另外使用质谱法评价选择的样品级分，以评价dar物类分离的质量。在图9-12中所示的结果显示，每个获得的级分含有鉴定的dar物类。
[0156]
图9显示adcetris
®
样品的去卷积质谱，显示从dar0至dar4物类范围内的dar物类的分布。由于较低dar物类的低电离和方法过载，dar6物类不可检测。
[0157]
图10显示洗脱级分5a7的去卷积质谱，表示第一洗脱峰的最大值。获得的分子量是对于dar2物类，没有明显存在其它dar物类。
[0158]
图11显示洗脱级分5b4的去卷积质谱，表示第二洗脱峰的最大值。获得的分子量是对于dar4物类，没有明显存在其它dar物类。
[0159]
图12显示洗脱级分5b11的去卷积质谱，表示第三洗脱峰的最大值。获得的分子量是对于dar4物类和dar6物类。信号强度不是定量的。
[0160]
4. 在该实验中，评价根据实施例1制备的离子交换材料(例如平均粒度在20-63 μm之间，平均孔径在40-110 nm之间并且离子密度在400-900 μeq/g之间)分离可商购获得的药物adcetris
®
的adc物类的能力。将离子交换材料填充在5
×
100 mm尺寸的色谱柱中，其中不对称性在0.8-1.2之间，并且》3000个板/m。在填充离子交换材料之后，获得的色谱柱用1 m naoh溶液清洗30分钟，并用ph为4.5的负载缓冲液溶液和300 mm nacl (例如24 ms/cm)预平衡。缓冲液溶液含有盐(例如磷酸二氢钠)、tris、甘氨酸的组合，以获得4.5的ph。使用相同的溶液溶解冻干的adcetris
®
样品直到1 mg/ml浓度。将该溶液负载到制备的色谱柱上，直到对于1 ml树脂达到60 mg adcetris
®
负载。以150 cm/h缓冲液速度进行这些步骤和后续步骤。在负载60 mg/ml adcetris
®
之后，用ph 4.5的缓冲溶液洗涤色谱柱，然后使用ph为8.5的缓冲液和300 mm nacl的梯度洗脱进行洗脱。使用不同的盐(例如磷酸二氢钠)、tris、甘氨酸制备该洗脱缓冲液。在实验设置期间跟踪电导率和ph值，显示由于在梯度洗脱期间ph的变化而实现了从柱的adcetris
®
洗脱。分级样品洗脱，并使用两种不同的dar物类鉴定方法在线评价获得的级分。第一种选择的方法是使用来自thermo fisher scientific的具有4.6
×
100mm尺寸的mabpac hic-butyl柱的分析疏水相互作用色谱法。对分级的样品的色谱分离使得我们能够基于每种物类的不同的洗脱窗口鉴定不同的dar物类及其质量(例如dar0物类的洗脱在7-9分钟之间，dar2物类的洗脱在10-14分钟之间，dar4物类的洗脱在15-18分钟之间，而dar6物类的洗脱在19-22分钟之间)。60 mg/ml adcetris
®
负载的实例色谱实验示于图13中，其中uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。使用疏水相互作用色谱法对收集的级分的分析评价在图14中显示，显示三个获得的峰是dar物类的分离，即第一峰主要是dar2物类(例如在188 ml处最大洗脱)，第二峰主要是dar4物类(例如在205 ml处最大洗脱)，而第三峰是dar6物类(例如在230 ml处最大洗脱)。
[0161]
令人惊奇的是，同样在60 mg/ml负载中，dar物类的分离是可能的，获得纯化的dar2物类，如在含有49.66%的dar 2物类的级分3b4中所见。此外，级分3c2主要含有83.02%的dar4物类，而级分3c12主要含有83.12%的dar6物类。在97.37%的回收率内获得该结果，解释所有色谱步骤。
[0162]
5. 在该实验中，评价可商购获得的capto
™ꢀ
mmc impres 色谱树脂分离可商购获得的药物adcetris
®
的adc物类的能力。该混合模式材料还暴露弱阳离子交换基团和疏水基团，并且可以适合于adc物类分离。将capto
™ꢀ
mmc impres材料填充在5
×
100 mm尺寸的色谱柱中，其中不对称性在0.8-1.2之间，并且》3000个板/m。在填充capto
™ꢀ
mmc impres材料之后，获得的色谱柱用1 m naoh溶液清洗30分钟，并用ph为4.5的负载缓冲液溶液和300 mm nacl (例如24 ms/cm)预平衡。缓冲液溶液含有盐(例如磷酸二氢钠)、tris、甘氨酸的组合，以获得4.5的ph。使用相同的溶液溶解冻干的adcetris
®
样品直到1 mg/ml浓度。将该溶液负载到制备的色谱柱上，直到对于1 ml树脂达到30 mg adcetris
®
负载。以150 cm/h缓冲液速度进行这些步骤和后续步骤。在负载30 mg/ml adcetris
®
之后，用ph 4.5的缓冲溶液洗涤色谱柱，然后使用ph为8.5的缓冲液和300 mm nacl的梯度洗脱进行洗脱。使用不同的盐(例如磷酸二氢钠)、tris、甘氨酸制备该洗脱缓冲液。在实验设置期间跟踪电导率和ph值，显示由于在梯度洗脱期间ph的变化而实现了从柱的adcetris
®
洗脱。分级样品洗脱，并使用两种不同的dar物类鉴定方法在线评价获得的级分。第一种选择的方法是使用来自thermo fisher scientific的具有4.6
×
100mm尺寸的mabpac hic-butyl柱的分析疏水相
互作用色谱法。对分级的样品的色谱分离使得我们能够基于每种物类的不同的洗脱窗口鉴定不同的dar物类及其质量(例如dar0物类的洗脱在7-9分钟之间，dar2物类的洗脱在10-14分钟之间，dar4物类的洗脱在15-18分钟之间，而dar6物类的洗脱在19-22分钟之间)。30 mg/ml adcetris
®
负载的实例色谱实验示于图15中，其中uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
[0163]
使用疏水相互作用色谱法对收集的级分的分析评价在图16中显示，显示选择的capto
™ꢀ
mmc impres树脂不能结合所有的30 mg adc样品，并且分离不是那么有效。对于单个dar物类获得的最大纯度对于dar2达到52.92%，对于dar4达到75.32%和对于dar6达到72.74%。作为比较，在相同的条件下，对于创新的离子交换树脂获得的纯度是：dar2-55.27%，dar4-81.24%和dar6-86.89%。另外，使用capto mmc impres树脂的回收率为88.38%。
[0164]
6. 在该实验中，测试分离基质分离不同dar(药物抗体比率)的adc adcetris
®
的能力。对于随后的实施例，使用20%乙醇、150 mm nacl溶液将树脂填充到5 mm直径100 mm长的柱中。
[0165]
制备两种以下缓冲液，缓冲液a (为负载缓冲液) (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.0111 m naoh和0.0889 m nacl，ph为4.75)和缓冲液b (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.046 m naoh和0.054 m nacl，ph为8.5)。
[0166]
以0.491 ml/min使用缓冲液a将填充柱平衡，持续至少10个柱体积。将冻干配制的adc溶解在缓冲液a中至浓度为5 mg/ml。以0.491 ml/min将3.93 ml获得的溶液直接负载于经平衡的柱上。负载后，使用平衡溶液用10 cv洗涤柱。以0.491 ml/min，使用120 cv的0-100%的缓冲液b的ph梯度洗脱，对结合的adc进行洗脱(图17)。
[0167]
表1. 样品级分表征的分析结果，其在洗脱级分(峰1-3)的定量面积中显示，包括在10 mg adc/ml cv负载和50 mm nacl下负载的adc (负载)7. 在该实验中，测试分离基质分离不同dar(药物抗体比率)的adc adcetris
®
的能力。对于随后的实施例，使用20%乙醇、150 mm nacl溶液将树脂填充到5 mm直径100 mm长的柱中。
[0168]
制备两种以下缓冲液，缓冲液a (为负载缓冲液) (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.0111 m naoh和0.1389 m nacl，ph为4.75)和缓冲液b (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.046 m naoh
m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.046 m naoh和0.204 m nacl，ph为8.5)。
[0175]
以0.491 ml/min使用缓冲液a将填充柱平衡，持续至少10个柱体积。将冻干配制的adc溶解在缓冲液a中至浓度为5 mg/ml。以0.491 ml/min将3.93 ml获得的溶液直接负载于经平衡的柱上。负载后，使用平衡溶液用10 cv洗涤柱。以0.491 ml/min，使用120 cv的0-100%的缓冲液b的ph梯度洗脱，对结合的adc进行洗脱(图20)。
[0176]
表4. 样品级分表征的分析结果，其在洗脱级分(峰1-3)的定量面积中显示，包括在10 mg adc/ml cv负载和200 mm nacl下负载的adc (负载)。
[0177]
10. 在该实验中，测试分离基质分离不同dar(药物抗体比率)的adc adcetris
®
的能力。对于随后的实施例，使用20%乙醇、150 mm nacl溶液将树脂填充到5 mm直径100 mm长的柱中。
[0178]
制备两种以下缓冲液，缓冲液a (为负载缓冲液) (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.0111 m naoh和0.3389 m nacl，ph为4.75)和缓冲液b (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.046 m naoh和0.304 m nacl，ph为8.5)。
[0179]
以0.491 ml/min使用缓冲液a将填充柱平衡，持续至少10个柱体积。将冻干配制的adc溶解在缓冲液a中至浓度为5 mg/ml。以0.491 ml/min将3.93 ml获得的溶液直接负载于经平衡的柱上。负载后，使用平衡溶液用10 cv洗涤柱。以0.491 ml/min，使用120 cv的0-100%的缓冲液b的ph梯度洗脱，对结合的adc进行洗脱(图21)。
[0180]
表5. 样品级分表征的分析结果，其在洗脱级分(峰1-3)的定量面积中显示，包括在10 mg adc/ml cv负载和300 mm nacl下负载的adc (负载)。
[0181]
11. 在该实验中，测试分离基质分离不同dar(药物抗体比率)的adc adcetris
®
的能力。对于随后的实施例，使用20%乙醇、150 mm nacl溶液将树脂填充到5 mm直径100 mm
长的柱中。
[0182]
制备两种以下缓冲液，缓冲液a (为负载缓冲液) (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.0111 m naoh和0.3889 m nacl，ph为4.75)和缓冲液b (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.046 m naoh和0.354 m nacl，ph为8.5)。
[0183]
以0.491 ml/min使用缓冲液a将填充柱平衡，持续至少10个柱体积。将冻干配制的adc溶解在缓冲液a中至浓度为5 mg/ml。以0.491 ml/min将3.93 ml获得的溶液直接负载于经平衡的柱上。负载后，使用平衡溶液用10 cv洗涤柱。以0.491 ml/min，使用120 cv的0-100%的缓冲液b的ph梯度洗脱，对结合的adc进行洗脱(图22)。
[0184]
表6. 样品级分表征的分析结果，其在洗脱级分(峰1-3)的定量面积中显示，包括在10 mg adc/ml cv负载和350mm nacl下负载的adc (负载)。
[0185]
12. 在该实验中，测试分离基质分离不同dar(药物抗体比率)的adc adcetris
®
的能力。对于随后的实施例，使用20%乙醇、150 mm nacl溶液将树脂填充到5 mm直径100 mm长的柱中。
[0186]
制备两种以下缓冲液，缓冲液a (为负载缓冲液) (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.0111 m naoh和0.3389 m nacl，ph为4.75)和缓冲液b (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.046 m naoh和0.304 m nacl，ph为8.5)。
[0187]
以0.491 ml/min使用缓冲液a将填充柱平衡，持续至少10个柱体积。将冻干配制的adc溶解在缓冲液a中至浓度为5 mg/ml。以0.491 ml/min将3.93 ml获得的溶液直接负载于经平衡的柱上。负载后，使用平衡溶液用10 cv洗涤柱。以0.491 ml/min，以22% b、30% b和36% b，使用ph步骤对结合的adc进行洗脱(图23)。
[0188]
表7. 样品级分表征的分析结果，其在洗脱级分(步骤1-3)的定量面积中显示，包括在步骤方法中在10 mg adc/ml cv负载和300 mm nacl下负载的adc (负载)。
[0189]
13. 在该实验中，评价创新的离子交换材料分离可商购获得的药物kadcyla
®
的adc物类的能力。将离子交换材料填充在5
×
100 mm尺寸的色谱柱中，其中不对称性在0.8-1.2之间，并且》3000个板/m。在填充离子交换材料之后，获得的色谱柱用1 m naoh溶液清洗30分钟，并用ph为4.5的负载缓冲液溶液和300 mm nacl (例如24 ms/cm)预平衡。缓冲液溶液含有盐(例如磷酸二氢钠)、tris、甘氨酸的组合，以获得4.5的ph。使用相同的溶液溶解冻干的kadcyla
®
样品直到1 mg/ml浓度。将该溶液负载到制备的色谱柱上，直到对于1 ml树脂达到30 mg kadcyla
®
负载。以150 cm/h缓冲液速度进行这些步骤和后续步骤。在负载30 mg/ml kadcyla
®ꢀ
之后，用ph 4.5的缓冲溶液洗涤色谱柱，然后使用ph为8.5的缓冲液和300 mm nacl的梯度洗脱进行洗脱。使用不同的盐(例如磷酸二氢钠)、tris、甘氨酸制备该洗脱缓冲液。在实验设置期间跟踪电导率和ph值，显示由于在梯度洗脱期间ph的变化而实现了从柱的kadcyla
®
洗脱。分级样品洗脱，并使用两种不同的dar物类鉴定方法在线评价获得的级分。第一种选择的方法是使用来自thermo fisher scientific的具有4.6
×
100mm尺寸的mabpac hic-butyl柱的分析疏水相互作用色谱法。对分级的样品的色谱分离使得我们能够基于对于每种物类不同的洗脱窗口鉴定不同的dar物类及其质量。第二种选择的方法是质谱法，其中基于它们的质量和电离比来分离不同的dar物类。使用该方法定性样品评价是可能的，但不是定量的，由于dar物类的不同的电离(例如较高dar物类倾向于电离至较低程度)。30 mg/ml kadcyla
®
负载的实例色谱实验示于图24中，其中uv吸收信号轨迹以实线表示，而ph信号轨迹以虚线表示。
[0190]
收集级分，并使用分析hic (疏水相互作用色谱) hplc分析，并使用定量面积计算不同的dar的量。图25说明在分析hplc柱上在线性洗脱梯度期间抗体药物缀合物物类的分离。在uv信号轨迹中鉴定了五个连续的洗脱集合，代表五个不同的抗体药物缀合物物类：峰1表示没有药物的抗体药物缀合物物类，峰2表示具有1个缀合到单个抗体分子的药物分子的抗体药物缀合物物类，峰3表示具有2个缀合到单个抗体分子的药物分子的抗体药物缀合物物类，峰4表示具有3个缀合到单个抗体分子的药物分子的抗体药物缀合物物类，峰5表示具有》4个缀合到单个抗体分子的药物分子的抗体药物缀合物物类。所鉴定的抗体药物缀合物物类的区别在于它们的平均疏水性，一种是更亲水的(例如左侧)至疏水的(例如右侧)。
[0191]
使用疏水相互作用色谱法对收集的级分的分析评价在图26中显示，显示选择的创新的离子交换树脂能够从较高dar物类分离较低dar物类。
[0192]
使用质谱法另外评价选择的样品级分，以评价dar物类分离的质量。在图27-29中所示的结果显示，每个获得的级分含有鉴定的dar物类。
[0193]
图27. kadcyla
®
样品的去卷积质谱，显示从dar0至dar7物类范围内的dar物类的分布。
[0194]
图28. 洗脱级分3a4样品的去卷积质谱，显示较低dar物类的分布。
[0195]
图29. 洗脱级分3b12样品的去卷积质谱，显示较高dar物类的分布。
[0196]
14. 在该实验中，测试分离基质分离不同dar(药物抗体比率)的adc kadcyla
®
的能力。对于随后的实施例，使用20%乙醇、150 mm nacl溶液将树脂填充到5 mm直径100 mm长的柱中。
[0197]
制备两种以下缓冲液，缓冲液a (为负载缓冲液) (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、
0.0111 m naoh和0.2889 m nacl，ph为4.75且电导率为约28 ms/cm)和缓冲液b (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.046 m naoh和0.254 m nacl，ph为8.5且电导率为约27 ms/cm)。
[0198]
以0.491 ml/min使用缓冲液a将填充柱平衡，持续至少10个柱体积。将冻干配制的adc溶解在缓冲液a中至浓度为5 mg/ml。以0.491 ml/min将22.52 ml获得的溶液直接负载于经平衡的柱上。负载后，使用平衡溶液用10 cv洗涤柱。以0.491 ml/min，使用120 cv的0-100%的缓冲液b的ph梯度洗脱，对结合的adc进行洗脱(图30)。
[0199]
如在图31中所示，使用线性ph梯度洗脱，不同的dar的分离/富集是可能的。》dar4的纯度增加到96% (起始水平68%)。
[0200]
15. 在该实验中，测试capto
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mmc impres色谱树脂分离不同dar (药物抗体比率)的adc kadcyla
®
的能力。对于随后的实施例，使用20%乙醇、150 mm nacl溶液将树脂填充到5 mm直径100 mm长的柱中。
[0201]
制备两种以下缓冲液，缓冲液a (为负载缓冲液) (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.0111 m naoh和0.2889 m nacl，ph为4.75且电导率为约28 ms/cm)和缓冲液b (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.046 m naoh和0.254 m nacl，ph为8.5且电导率为约27 ms/cm)。
[0202]
以0.491 ml/min使用缓冲液a将填充柱平衡，持续至少10个柱体积。将冻干配制的adc溶解在缓冲液a中至浓度为5 mg/ml。以0.491 ml/min将11.26 ml获得的溶液直接负载于经平衡的柱上。负载后，使用平衡溶液用10 cv洗涤柱。以0.491 ml/min，使用120 cv的0-100%的缓冲液b的ph梯度洗脱，对结合的adc进行洗脱(图32)。
[0203]
如在图32中所示，使用线性ph梯度洗脱，不同的dar的分离/富集是可能的。》dar4的纯度增加到》90% (起始水平72%)。
[0204]
16. 在该实验中，测试分离基质分离不同dar (药物抗体比率)的adc kadcyla
®
的能力。对于随后的实施例，使用20%乙醇、150 mm nacl溶液将树脂填充到5 mm直径100 mm长的柱中。
[0205]
制备两种以下缓冲液，缓冲液a (为负载缓冲液) (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.0111 m naoh和0.4389 m nacl，ph为4.75)和缓冲液b (例如0.00796 m柠檬酸、0.009068 m磷酸二氢钠、0.021543 m甘氨酸、0.010668 m tris、0.007666 m琥珀酸盐、0.046 m naoh和0.404 m nacl，ph为8.5)。
[0206]
以0.491 ml/min使用缓冲液a将填充柱平衡，持续至少10个柱体积。将冻干配制的adc溶解在缓冲液a中至浓度为5 mg/ml。以0.491 ml/min将3.93 ml获得的溶液直接负载于经平衡的柱上。负载后，使用平衡溶液用10 cv洗涤柱。以0.491 ml/min，在5% b和40% b下，使用ph步骤对结合的adc进行洗脱(图34)。
[0207]
表8. 样品级分表征的分析结果，其在洗脱级分(步骤1-2)的定量面积中显示，包括在步骤方法中，在10 mg adc/ml cv负载和400 mm nacl下负载的adc (负载)。