一种固定化土壤修复菌种制备方法及其在生物堆土壤修复中的应用与流程

1.本发明涉及土壤修复技术领域，具体为一种固定化土壤修复菌种制备方 法及其在生物堆土壤修复中的应用。


背景技术：

2.土壤是人类环境的重要组成部分，是不可或缺、不可再生的自然资源， 是生物赖以生存的重要基础，随着经济的发展，化肥农药的大量施用及化工 废水的大量排放，对环境造成破坏，首当其冲的便是土壤污染问题，严重影 响人类健康及制约经济发展。
3.土壤修复剂技术方法较多，微生物修复是去除土壤中有机污染物的主要 途径之一，然而，在土壤修复过程中，微生物难以长期生存，有效菌群数量 普遍较低，这些因素使得微生物修复不能大规模的应用到土壤修复过程中， 而微生物固定化技术在一定程度上克服了微生物不能长期存活这一难点，有 效延长了微生物参与土壤修复的持效性。
4.在实验室条件下，单一菌株可对某一种有机物表现较好的降解效果，但 很难应对复杂的土壤环境，因此复合菌种的研制是土壤修复菌种产品的发展 趋势，而筛选针对某一类或几种有机污染物的高效降解菌株更是为菌种性能 提供保障。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种固定化土壤修复菌种制备方法及其在生物堆 土壤修复中的应用，形成一种在土壤修复过程中，针对石油烃污染土壤修复 的菌种产品；利用独特的产品发酵生产工艺，提高产品活菌数，增强产品性 能；采用秸秆生物炭为微生物提供良好的环境及生长所需微量元素，增强微 生物处理污染土壤的持效性。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种固定化土壤修复菌种 的制备方法，包括菌株活化，扩大培养，发酵培养，菌种混合，固定及干化 等步骤。
7.步骤一：菌种活化：将分离保存的单菌株采用活化培养基进行活化；
8.步骤二：菌株扩大培养：接种活化的菌株培养液以1％接种量接种至菌株 扩增培养基进行扩大培养至1～5l；
9.步骤三：菌株发酵：针对不同微生物的需求分别采用不同的发酵手段， 将菌液浓度扩增至10
10～11
以上；
10.步骤四：菌种混合：将步骤三中获得的单菌株发酵液按照体积比1:1～ 5:1～5:1～5:1～5比例混合均匀，脱水50％制备成浓菌液备用；
11.步骤五：菌种固定：取一定量秸秆生物炭与步骤四中得到的混合菌种浓 菌液进行搅拌混合，固定24-36h，补充营养保护剂形成固定化菌种初产品， 固定比例为生物炭∶菌液∶营养保护剂＝10∶2～5∶2～3；秸秆生物炭规格为 50～150目，营养剂配方为牛肉膏5g/l；鱼粉蛋白胨5g/l；营养元素5ml/l；
12.步骤六：菌种干化：将步骤五中的固定化菌种经过冷冻干燥，形成固定 化的菌种
产品。
13.一种固定化土壤修复菌种在生物堆土壤修复中的应用，使用参数如下：
14.第一点：固定化菌种接种至污染土壤比例为1～5％；
15.第二点：持续补充水分，控制土壤含水率至25～50％；
16.第三点：设置曝气，调节污染土壤中通气量，调节污染土壤中do为2～ 4mg/l；
17.第四点：控制环境温度为25～35℃。
18.优选的，步骤一中菌株包括假单胞菌、芽孢杆菌、不动杆菌、产碱杆菌、 微球杆菌、诺卡氏菌6种菌株。
19.优选的，步骤一种活化培养基配方为：牛肉膏3g/l；鱼粉蛋白胨10g/l； nacl 5g/l；加水定容到1l，调节ph＝7.0，琼脂20g/l，121℃灭菌30min备 用。
20.优选的，步骤二中扩增培养基配方为：牛肉膏3g/l；鱼粉蛋白胨10g/l； nacl 5g/l；加水定容到1l，调节ph＝7.0，121℃灭菌30min备用。
21.优选的，步骤三中厌氧菌发酵过程中，持续补充营养，控制溶解氧浓度 do≤0.5。
22.优选的，步骤三中厌氧发酵培养基配方为：葡萄糖10g/l；鱼粉蛋白胨 6g/l；牛肉膏2g/l；酵母膏2g/l；醋酸铵3g/l；kh2po
4 0.5g/l；mgso4·
7h2o0.2g/l；feso4·
7h2o 0.01g/l；加水定容到1l；ph6.5，121℃灭菌30min备用。
23.优选的，步骤三中好氧发酵过程中，需要持续曝气及营养补充，do≥ 2.0mg/l。
24.优选的，步骤三中好氧发酵培养基配方为：葡萄糖10g/l；鱼粉蛋白胨 2g/l；酵母膏1g/l；乳酸1g/l；k2hpo
4 0.5g/l；kh2po
4 0.5g/l；mgso4·
7h2o 0.2g/l；mnso
4 0.1g/l；nacl 3g/l；feso4·
7h2o 0.01g/l；ph7.0， 121℃灭菌30min备用。
25.优选的，步骤五中营养元素液配方为：mgso4·
7h2o 2g/l；mnso
4 2g/l； feso4·
7h2o 1g/l；znso4·
7h2o，1g/l；cuso4·
5h2o 1g/l；h3bo
3 0.5g/l；cocl2·
6h2o0.05g/l；cacl
2 1g/l；na2moo4·
2h2o 0.3g/l。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
27.1、菌种产品有效活菌数大于等于10
10
/g以上；
28.2、菌种存活时间长，可持续进行土壤处理，处理1个月后，有效活菌数 依然高于107/g以上；
29.3、菌种针对石油烃污染土壤，处理效果同等条件下，提高20％以上。
具体实施方式
30.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.一种固定化土壤修复菌种的制备方法，包括菌株活化，扩大培养，发酵 培养，菌种混合，固定及干化等步骤。
32.步骤一：菌种活化：将分离保存的单菌株采用活化培养基进行活化；
33.进一步地，菌株包括假单胞菌、芽孢杆菌、不动杆菌、产碱杆菌、微球 杆菌、诺卡氏菌6种菌株；活化培养基配方为：牛肉膏3g/l；鱼粉蛋白胨10g/l； nacl 5g/l；加水定容到1l，调节ph＝7.0，琼脂20g/l，121℃灭菌30min备 用；
34.步骤二：菌株扩大培养：接种活化的菌株培养液以1％接种量接种至菌株扩增培养基进行扩大培养至1～5l；
35.进一步地，扩增培养基配方为：牛肉膏3g/l；鱼粉蛋白胨10g/l；nacl5g/l；加水定容到1l，调节ph＝7.0，121℃灭菌30min备用；
36.步骤三：菌株发酵：针对不同微生物的需求采用不同的发酵手段，将菌液浓度扩增至10
10～11
以上；
37.进一步地，厌氧菌发酵过程中，持续补充营养，控制溶解氧浓度do≤0.5，厌氧发酵培养基配方为：葡萄糖10g/l；鱼粉蛋白胨6g/l；牛肉膏2g/l；酵母膏2g/l；醋酸铵3g/l；kh2po40.5g/l；mgso4·
7h2o0.2g/l；feso4·
7h2o0.01g/l；加水定容到1l；ph6.5，121℃灭菌30min备用；
38.进一步地，好氧发酵过程中，需要持续曝气及营养补充，do≥2.0mg/l，好氧发酵培养基配方为：葡萄糖10g/l；鱼粉蛋白胨2g/l；酵母膏1g/l；乳酸1g/l；k2hpo40.5g/l；kh2po40.5g/l；mgso4·
7h2o0.2g/l；mnso40.1g/l；nacl3g/l；feso4·
7h2o0.01g/l；ph7.0，121℃灭菌30min备用；
39.步骤四：菌种混合：将6株菌按照发酵液体积比1:1～5:1～5:1～5:1～5比例混合均匀，脱水50％制备成浓菌液备用；
40.步骤五：菌种固定：取一定量秸秆生物炭与步骤四中得到的菌种浓菌液进行搅拌混合，固定时间24-36h，补充营养保护剂形成固定化菌种初产品，固定比例为生物炭∶菌液∶营养保护剂＝10∶2～5∶2～3；秸秆生物炭规格为50～150目，营养剂配方为牛肉膏5g/l；鱼粉蛋白胨5g/l；营养元素5ml/l；
41.进一步地，营养元素液配方为：mgso4·
7h2o2g/l；mnso42g/l；feso4·
7h2o1g/l；znso4·
7h2o，1g/l；cuso4·
5h2o1g/l；h3bo30.5g/l；cocl2·
6h2o0.05g/l；cacl21g/l；na2moo4·
2h2o0.3g/l；
42.步骤六：菌种干化：将步骤五中的固定化菌种经过冷冻干燥，形成固定化的菌种产品。
43.一种固定化土壤修复菌种在生物堆土壤修复中的应用，使用参数如下：
44.第一点：固定化菌种接种至污染土壤比例为1～5％；
45.第二点：持续补充水分，控制土壤含水率至25～50％；
46.第三点：设置曝气，调节污染土壤中通气量，调节污染土壤中do为2～4mg/l；
47.第四点：控制环境温度为25～35℃。