编码CRY2Ai蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列及其用途的制作方法

folder)、稻黄茎螟(rice yellow stem)的抗性的作物植物品种的开发仍然是农业领域的主要问题。已经做出多种尝试来控制或防止作物植物的昆虫侵袭，但某些害虫仍然是农业中的重大问题。因此，仍然需要在转基因植物中具有期望杀虫蛋白表达水平的昆虫抗性转基因作物植物。
12.本发明通过提供编码bt cry2ai蛋白的植物密码子优化的合成dna序列，在此提供了解决现有害虫侵袭问题的方法，所述bt cry2ai蛋白具有针对害虫包括但不限于属于鳞翅目的害虫的杀虫活性。
13.发明概述
14.本文公开了编码苏云金芽孢杆菌cry2ai蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列，该蛋白具有针对害虫的杀虫活性。本公开内容涉及用于增强植物细胞中异源基因表达的方法。构建cry2ai基因的基因或编码区以提供植物特异性偏好密码子(preferred codon)序列。以这种方式，对于cry2ai蛋白的密码子使用被改变以提高在植物中的表达。这样的植物优化的编码序列可与能够在植物细胞中指导编码序列表达的启动子可操作地连接。包含经密码子优化的苏云金芽孢杆菌合成核苷酸序列的转化的宿主细胞和转基因植物也是本公开内容的方面。
15.本公开内容的一个目的是提供编码杀虫蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中所述核苷酸序列经优化用于在植物中表达。
16.本公开内容的另一个目的是提供编码杀虫bt蛋白的经密码子优化的核苷酸序列，以使bt蛋白在植物中优选在选自以下的植物中的表达最大化：茄子、棉花、稻、番茄、小麦、玉米、高粱、燕麦、粟、豆科作物(legume)、甘蓝、花椰菜、青花菜、芸薹属(brassica sp.)、豆类、豌豆、木豆(pigeon-pea)、马铃薯、胡椒、葫芦(cucurbit)、莴苣、甘薯芥花籽(sweet potato canola)、大豆、苜蓿、花生和向日葵。本公开内容的一个特征是，经密码子优化的合成bt cry2ai基因是使用最优选的茄子、稻和豆科作物密码子构建的。
17.根据本公开内容，发明人已经合成了bt杀虫cry2ai晶体蛋白基因，其中密码子使用已被改变以提高在植物中的表达，特别是在茄子、稻和豆科作物中的表达。然而，本发明人没有改变密码子使用以使其在总体密码子分布方面类似于茄子、稻或豆科作物基因，而是通过在本公开内容的核苷酸序列的合成中使用在植物例如稻、茄子、番茄、玉蜀黍和豆科作物中最优选的密码子优化了密码子使用。经优化的植物偏好密码子使用对在双子叶植物例如茄子和番茄，单子叶植物例如稻以及豆科作物例如鹰嘴豆(chickpea)和木豆中高水平表达bt杀虫蛋白是有效的。
18.本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列来源于苏云金芽孢杆菌cry2ai蛋白，该蛋白具有如seq id no:1中所示的氨基酸序列(ncbi genbank:acv97158.1)。具有如seq id no:1中所示氨基酸序列的蛋白质针对多种鳞翅目昆虫具有活性，所述昆虫包括棉铃虫(helicoverpa armigera)-棉铃虫(cotton bollworm)和玉米穗虫(corn earworm)、稻纵卷叶螟(cnaphalocrocis medinalis)-稻纵卷叶螟(rice leaffolder)以及三化螟(scirpophaga incertulas)-稻黄茎螟(rice yellow stem borer)和棉红铃虫(pectinophora gossypiella)。
19.虽然本公开内容已通过用于分别在稻、茄子和鹰嘴豆中表达的经茄子、稻和豆科作物优化的bt cry2ai核苷酸的合成来示例，但认识到经茄子优化的bt cry2ai核苷酸也可
用于优化蛋白质在其他植物(例如番茄、玉蜀黍和棉花)中的表达。此外，认识到经稻优化的bt cry2ai核苷酸也可用于优化蛋白质在其他植物中的表达。同样，认识到经豆科作物优化的bt cry2ai核苷酸也可用于优化蛋白质在其他植物中的表达。
20.因此，本公开内容的一个方面是提供经密码子优化的合成核苷酸序列，其编码具有如seq id no:1中所示氨基酸序列的蛋白质，其中所述核苷酸序列是：
21.a.如seq id no:2中所示的，或与其互补的核苷酸序列，或者
22.b.与如seq id no:2中所示核苷酸序列的从第251位至第402位和/或从第1456位至第1628位核苷酸的至少10个核苷酸特异性杂交的核苷酸序列，或与其互补的序列。
23.本公开内容的另一方面是提供重组dna，其包含如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与异源调节元件可操作地连接。
24.本公开内容的另一方面是提供用于表达目的杀虫蛋白的dna构建体，其包含5'非翻译序列、编码包含seq id no:1的氨基酸序列的杀虫cry2ai蛋白或其杀虫部分的编码序列以及3'非翻译区，其中所述5'非翻译序列包含在植物细胞中发挥功能的启动子，所述编码序列是如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列，并且其中所述3'非翻译序列包含转录终止序列和多腺苷酸化信号。
25.本公开内容的另一方面是提供包含本文所公开的重组dna或如本文所公开的dna构建体的质粒载体。
26.本公开内容的另一方面是提供包含如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列的宿主细胞。
27.本公开内容的另一方面是提供用于赋予植物昆虫抗性的方法，所述方法包括：
28.(a)将如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列插入植物细胞中，其中所述核苷酸序列与(i)在植物细胞中发挥功能的启动子和(ii)终止子可操作地连接；
29.(b)从步骤(a)的所述植物细胞获得转化的植物细胞，其中所述转化的植物细胞包含如本文所公开的所述经密码子优化的合成核苷酸序列；以及
30.(c)从步骤(b)的所述转化的植物细胞产生转基因植物，其中所述转基因植物包含如本文所公开的所述经密码子优化的合成核苷酸序列。
31.本公开内容的另一方面是提供包含如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列的转基因植物。
32.本公开内容的另一方面是提供组合物，其包含含有如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列的苏云金芽孢杆菌，所述核苷酸序列编码具有如seq id no:1中所示氨基酸序列的cry2ai蛋白。
33.本公开内容的另一方面是提供在作物植物中控制昆虫侵袭和提供昆虫抗性管理的方法，其中所述方法包括将所述作物植物与杀虫有效量的如本文所公开的组合物接触。
34.本公开内容的又一方面是如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列、dna构建体或质粒用于产生昆虫抗性转基因植物的用途。
35.本公开内容的又一方面是如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列用于产生杀虫组合物的用途，其中所述组合物包含含有所述核苷酸序列的苏云金芽孢杆菌细胞。
36.附图简述
37.图1示出了pgreen0179-camv35s-201m1的t-dna构建体图谱。
38.图2示出了转基因稻植物的遗传转化和再生。
39.图3示出了pgreen0029-camv35s-201m1的t-dna构建体图谱。
40.图4示出了转基因番茄植物的遗传转化和再生。
41.图5示出了针对稻黄茎螟幼虫三化螟(s.incertulas)的携带201m1核苷酸序列的转基因稻植物的分离茎位(stem bit)生物测定。
42.图6示出了针对稻黏虫(rice armyworm)幼虫灰翅夜蛾(s.mauritia)的携带201m1核苷酸序列的转基因稻植物的分离叶位(leaf bit)生物测定。
43.图7示出了针对棉铃虫(h.armigera)幼虫的携带201m1核苷酸序列的转基因番茄植物的叶盘生物测定。
44.序列简述
45.seq id no:1是cry2ai蛋白序列(ncbi genbank:acv97158.1)。
46.seq id no:2是编码cry2ai蛋白(seq id no:1)的单子叶植物偏倚密码子优化的合成cry2ai基因(201m1)的全长dna序列。
47.seq id no:3是编码cry2ai蛋白(seq id no:1)的单子叶植物偏倚密码子优化的合成cry2ai基因(201m2)的全长dna序列。
48.seq id no:4是编码cry2ai蛋白(seq id no:1)的单子叶植物偏倚密码子优化的合成cry2ai基因(201m3)的全长dna序列。
49.seq id no:5是编码cry2ai蛋白(seq id no:1)的单子叶植物偏倚密码子优化的合成cry2ai基因(201m4)的全长dna序列。
50.seq id no:6是编码cry2ai蛋白(seq id no:1)的单子叶植物偏倚密码子优化的合成cry2ai基因(201m5)的全长dna序列。
51.seq id no:7是编码cry2ai蛋白(seq id no:1)的单子叶植物偏倚密码子优化的合成cry2ai基因(201m6)的全长dna序列。
52.seq id no:8是用于扩增201m1 dna序列(seq id no:2)的正向引物序列。
53.seq id no:9是用于扩增201m1 dna序列(seq id no:2)的反向引物序列。
54.seq id no:10是用于扩增nptii dna基因的正向引物序列。
55.seq id no:11是用于扩增nptii dna基因的反向引物序列。
56.seq id no:12是用于扩增hptii基因的正向引物。
57.seq id no:13是用于扩增hptii基因的反向引物。
58.发明详述
59.本文提供的详细描述是为了帮助本领域技术人员实施本发明，并且不应被解释为不适当地限制本发明的范围，因为本领域技术人员可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下对本文讨论的实施方案进行修改和变化。在下文中将参照附图和/或序列表更全面地描述本发明，在附图和/或序列表中示出和/或描述了本发明的一些但非全部实施方案。本发明可以以许多不同的形式体现并且不应被解释为限于本文所阐述的实施方案。
60.尽管本文中采用了特定术语，但是其仅以一般和描述性意义使用，而不是出于限制的目的。提供以下定义以便于理解实施方案。
61.必须注意，如在说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确指示，
否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种(即，指至少一个/种)。因此，例如，提及“探针”意指在组合物中可以存在多于一个这样的探针。类似地，提及“元件”意指一个或更多个元件。
62.在本说明书通篇，词语“包括/包含”或其变化形式将被理解为意指包括所述要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤的组。
63.单位、前缀和符号可以以其si认可的形式表示。除非另外指出，否则分别地，核酸以5'至3'的方向从左至右书写，氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左至右书写。数字范围包括限定范围的数字。本文中氨基酸可以通过它们通常已知的三字母符号或由iupac-iub生物化学定名委员会推荐的单字母符号来指代。同样地，核苷酸可用它们普遍接受的单字母代码来指代。以上定义的术语通过参考作为整体的说明书更全面地定义。
64.术语“核酸”通常指大的多核苷酸。术语“核酸”和“核苷酸序列”在本文中可互换使用。其包括提及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，否则涵盖具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如肽核酸)，因为它们以类似于天然存在核苷酸的方式与单链核酸杂交。核苷酸是聚合(连接成长链)以制备核酸(dna和rna)的亚基。核苷酸由三种较小的组分组成：核糖糖、含氮碱基和一个或更多个磷酸基团。
[0065]“多核苷酸”意指核酸的单链或者平行和反平行链。因此，多核苷酸可以是单链或双链核酸。
[0066]
术语“寡核苷酸”通常指短多核苷酸，通常不超过约50个核苷酸。应当理解，当核苷酸序列通过dna序列(即a、t、g、c)表示时，这还包括其中“u”替换“t”的rna序列(即a、u、g、c)。
[0067]
术语“经密码子优化的合成核苷酸序列”是非基因组核苷酸序列，并且在本文中可互换使用以指与天然或基因组核苷酸序列相比在核苷酸序列中具有一个或更多个改变的合成核苷酸序列或核酸分子。在一些实施方案中，对天然或基因组核酸分子的改变包括但不限于：由于在特定生物体(例如植物)中表达的核酸序列的密码子优化而引起的核酸序列的改变，遗传密码的简并，与天然或基因组序列相比引入至少一个氨基酸替换、插入、缺失和/或添加的核酸序列的改变，引入限制酶位点的核酸序列的改变，去除与基因组核酸序列相关的一个或更多个内含子，插入一个或更多个异源内含子，缺失与基因组核酸序列相关的一个或更多个上游或下游调节区，插入一个或更多个异源上游或下游调节区，缺失与基因组核酸序列相关的5’和/或3’非翻译区，插入异源5’和/或3’非翻译区，和修饰多腺苷酸化位点。
[0068]
在本发明的上下文中，使用以下常见核酸碱基的缩写。“a”指腺苷，“c”指胞苷，“g”指鸟苷，“t”指胸苷，和“u”指尿苷。
[0069]
在一些实施方案中，非基因组核酸分子为cdna。在一些实施方案中，非基因组核酸分子是合成核苷酸序列。可使用本领域已知的方法，例如murray et al.(1989)nucleic acids res.17:477-498为任何目的生物体制备经密码子优化的核苷酸序列。经优化的核苷酸序列可用于提高植物中农药蛋白的表达，所述植物例如单子叶和双子叶植物，例如稻、番茄和棉花植物。
[0070]
本文公开的新设计的cry2ai dna序列称为“经密码子优化的合成cry2ai核苷酸序
列”。
[0071]
术语“dna构建体”、“核苷酸构建体”和“dna表达盒”在本文中可互换使用，并且不旨在将实施方案限制为包含dna的核苷酸构建体。本领域的普通技术人员将认识到，核苷酸构建体，特别是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合构成的多核苷酸和寡核苷酸也可用于本文公开的方法中。
[0072]“重组”核酸分子或dna或多核苷酸在本文中用于指已由人的手改变或产生且在重组细菌或植物宿主细胞中的核酸分子或dna多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以是从基因组分离的多核苷酸、通过rna逆转录产生的cdna、合成核酸分子或两个另外分离的序列区段的人工组合(例如通过化学合成或通过基因工程技术操纵分离的多核苷酸区段)。
[0073]
本文中使用的术语“同源”是指同一核酸链的两个区域之间或两个不同核酸链的区域之间的核苷酸序列相似性。当两个区域中的一个核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据时，则该区域在该位置处是同源的。如果每个区域的至少一个核苷酸残基位置被相同残基占据，则第一区域与第二区域同源。两个区域之间的同源性以两个区域的被相同核苷酸残基占据的核苷酸残基位置的比例表示。举例来说，具有核苷酸序列5
’‑
attgcc-3’的区域和具有核苷酸序列5
’‑
tatggc-3’的区域共有50％同源性。优选地，第一区域包含第一部分，并且第二区域包含第二部分，其中，每个部分的至少约50％、并且优选至少约75％、至少约90％或至少约95％的核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据。更优选地，每个部分的所有核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据。
[0074]
用于比较的序列的最佳比对可通过本领域已知算法的计算机实施(wisconsin genetics software package,genetics computer group(gcg),575science dr.,madison,wi中的gap、bestfit、blast、pasta和tfasta)或通过检查来进行。
[0075]
本文中使用的“序列同一性百分比”是通过在比较窗口内比较两个最佳对齐的序列而确定，其中比较窗口中的多核苷酸或氨基酸序列片段与用于两个序列的最佳对齐的参考序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(例如空位或突出端)。百分比通过以下来计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗口中位置的总数目，并将结果乘以100，以得到序列同一性的百分比。
[0076]
用于比较的序列的最佳比对可通过本领域已知算法的计算机实施(wisconsin genetics software package,genetics computer group(gcg),575science dr.,madison,wi中的gap、bestfit、blast、pasta和tfasta)或通过检查来进行。
[0077]
本文中使用的术语核苷酸序列之间的“显著序列同一性”是指包含与参考序列相比具有至少65％序列同一性、优选至少69％至77％序列同一性的序列的多核苷酸。
[0078]
本文中使用的术语“启动子/调节序列”意指表达与启动子/调节序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在另一些情况下，该序列还可包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调节元件。例如，启动子/调节序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
[0079]“组成型”启动子是在细胞中以恒定方式驱动与其可操作地连接的基因的表达的启动子。例如，驱动细胞管家基因表达的启动子被认为是组成型启动子。
[0080]“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可
操作地连接时引起该基因产物在活细胞中显著产生(仅当与该启动子对应的诱导子存在于该细胞中时)。
[0081]“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时引起该基因产物在活细胞中显著产生(仅当该细胞是与该启动子对应的组织类型的细胞时)。
[0082]
本文中使用的“可操作地连接”意指调节序列和编码序列之间的任何连接，无论方向或距离如何，其中该连接允许调节序列控制编码序列的表达。术语“可操作地连接”还意指所连接的核酸序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，是连续的并且在同一阅读框中。术语“可操作地连接”还指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列引起并介导与第二序列对应的dna序列的转录。
[0083]
本文中使用的“异源dna编码序列”或“异源核酸”或“异源多核苷酸”意指除天然编码cry2ai蛋白或cry2ai蛋白的任何同源物的编码序列以外的任何编码序列。
[0084]
本文中使用的“编码区”是指基因、dna或核苷酸序列的编码蛋白质的部分。术语“非编码区”是指基因、dna或核苷酸序列中不是编码区的部分。
[0085]
本文中使用的术语“编码”当在指定核酸的背景下使用时意指该核酸包含指导将核苷酸序列翻译成指定蛋白质所需的信息。编码蛋白质的信息通过使用密码子来指定。编码蛋白质的核酸可包含在核酸的翻译区域内的非翻译序列(例如，内含子)，或可缺少这样的间插非翻译序列(例如，如在cdna中)。
[0086]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指由通过肽键连接的氨基酸残基相关的天然存在结构变体及其合成的非天然存在类似物构成的聚合物。合成的多肽可例如使用自动多肽合成仪合成。该术语适用于其中一个或更多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在氨基酸聚合物。术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用以指并入蛋白质、多肽或肽(统称“蛋白质”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在氨基酸，并且除非另有限制，否则可涵盖天然氨基酸的可以以与天然存在氨基酸类似的方式发挥功能的已知类似物。
[0087]
术语“蛋白质”通常指大多肽。术语“肽”通常指短多肽。然而，术语“多肽”在本文中用于指由通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基构成的任何氨基酸聚合物。
[0088]
本文中使用的“表达盒”意指可并入载体中的包含基因及其表达所必需的调节区的遗传模块。
[0089]“载体”是包含核酸分子并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。在本领域中已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
[0090]
术语“表达载体”指包含重组核酸的载体，该重组核酸包含与待表达核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域中所有已知的那些，例如并入重组核酸的黏粒、质粒(例如裸的或包含在脂质体中)和病毒。
[0091]
本文中使用的术语“宿主细胞”是指预期含有载体并支持表达载体复制和/或表达
的细胞。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌(e.coli)，或真核细胞例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞，或者单子叶植物或双子叶植物植物细胞。单子叶植物宿主细胞的一个实例是稻宿主细胞，并且双子叶植物宿主细胞的一个实例是茄子或番茄宿主细胞。当可能时，对序列进行修饰以避免预测的发夹二级mrna结构。
[0092]
本文中使用的术语“毒素”是指显示出农药活性或杀虫活性的多肽。“bt”或“苏云金芽孢杆菌”毒素旨在包括在多种bt菌株中发现的更广泛类别的cry毒素，其中包括这样的毒素。
[0093]
术语“探针”或“样品探针”是指这样的分子，该分子由其互补物或特定微阵列元件识别。可由本发明研究的探针实例包括但不限于dna、rna、寡核苷酸、寡糖、多糖、糖、蛋白质、肽、单克隆抗体、毒素、病毒表位、激素、激素受体、酶、酶底物、辅因子和药物，包括细胞表面受体的激动剂和拮抗剂。
[0094]
本文中使用的术语“互补”或“互补物”指在双链核酸中通过氢键缔合的碱基、嘌呤和嘧啶的配对。以下碱基对是互补的：鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸苷；腺嘌呤和尿嘧啶。本文中使用的该术语包括完全和部分互补性。
[0095]
本文中使用的术语“杂交”是指其中核酸链通过碱基配对与互补链连接的过程。两条不完全相同但非常相似的互补核酸杂交所采用的条件随两条链的互补程度和链的长度而变化。因此，该术语考虑了部分以及完全杂交。这样的技术和条件是该领域的从业者公知的。
[0096]
术语“杀虫活性”和“农药活性”在本文中可互换使用以指生物体或物质(例如蛋白质)的这样的活性，其可以通过但不限于在取食和暴露适当时间长度之后有害生物(pest)死亡率、有害生物体重减轻、有害生物驱避性以及有害生物的其他行为和身体变化来测量。因此，具有农药活性的生物体或物质对有害生物适应性的至少一个可测量参数产生不利影响。例如，“杀虫蛋白”是通过它们自身或与其他蛋白组合表现出杀虫活性的蛋白质。
[0097]
本文中使用的术语“影响害虫”是指在任何发育阶段控制昆虫取食、生长和/或行为的变化，包括但不限于杀死昆虫、延缓生长、阻止繁殖能力、拒食活性等。
[0098]
本文中使用的术语“农药有效量”意指当存在于有害生物环境中时具有农药活性的物质或生物体的数量。对于每种物质或生物体，根据经验确定在特定环境中受影响的每种有害生物的农药有效量。类似地，当有害生物为害虫时，“杀虫有效量”可用于指“农药有效量”。
[0099]
本文中使用的术语“转化的植物”和“转基因植物”指在其基因组内包含一种或更多种异源多核苷酸的植物。异源多核苷酸稳定地整合在转基因或转化的植物的基因组内，从而使得多核苷酸传递给连续的世代。异源多核苷酸可单独或作为重组dna分子的部分整合到基因组中。
[0100]
应理解，本文中使用的术语“转基因”包括任何植物细胞、植物细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型因一种或更多种异源核酸的存在而改变。该术语包括最初使用本领域已知的遗传转化方法获得的那些转基因以及通过从初始转基因有性杂交或无性繁殖产生的那些。
[0101]
本文中使用的术语“初始转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或者通过天然存在事件例如随机交叉受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变的基
因组(染色体或染色体外)改变。
[0102]
本文中使用的术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物原生质体、植物可从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其在植物或植物的部分(例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、籽粒(kernel)、穗(ear)、穗轴、壳(husk)、秆(stalk)、根、根尖、花药等及其后代)中是完整的。转基因植物的部分在实施方案的范围内，并包括例如植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚，以及花、茎、果实、叶和根，其源自先前用实施方案的dna分子转化并因此至少部分由转基因细胞组成的转基因植物或其后代。
[0103]
苏云金芽孢杆菌cry基因和密码子优化
[0104]
现已对大约400种编码δ-内毒素的cry基因进行了测序(crickmore,n.2005.using worms to better understand how bacillus thuringiensis kills insects.trends in microbiology,13(8):347-350)。已基于氨基酸序列相似性将多种δ-内毒素分为类别(cry 1、2、3、4等)。这些类别由数个亚类(cry1a、cry1b、cry1c等)构成，这些亚类本身又细分为亚家族或变体(cry1aa、cry1ab、cry1ac等)。每个类别的基因彼此之间的同一性超过45％。每个单独的cry基因的产物通常具有有限的活性谱，限于少数物种的幼虫阶段。然而，不可能在cry蛋白的同一性程度与其活性谱之间建立相关性。cry1aa和cry1ac蛋白84％相同，但仅cry1aa对家蚕(bombyx mori)(l.)有毒。相反，仅33％相同的cry3aa和cry7aa针对科罗拉多马铃薯甲虫leptinotarsa decemlineata都有活性。其他cry毒素针对昆虫完全没有活性，但针对其他无脊椎动物有活性。例如，cry5和cry6蛋白类别针对线虫类有活性。最近，还表征了针对叶甲科家族的多种鞘翅目害虫具有活性的定名为cry34ab1/cry35ab1的来自bt的双元毒素。它们已被分配为cry名称，但它们与cry毒素家族的其他成员几乎没有同源性。
[0105]
为了在转基因植物中实现期望的异源蛋白质表达水平，已发现以多种方式改变天然的、有时称为野生型或原始基因组dna编码序列是有益的，以便密码子使用更接近地匹配宿主植物物种的密码子使用，类似地，编码序列的g c含量更接近地匹配宿主植物物种的g c含量。
[0106]
植物分子生物学领域的技术人员将理解，可设计多个dna序列来编码单个氨基酸序列。提高目的蛋白质编码区表达的常用手段是以这样的方式修饰编码区，使得其密码子组成类似于其中基因被靶向表达的宿主的总体密码子组成。
[0107]
可以优化基因组/天然核酸以用于提高在宿主生物体中的表达。因此，在宿主生物体为植物的情况下，可使用植物偏好密码子来合成合成核酸以提高表达。例如，尽管实施方案的核酸序列可在单子叶植物和双子叶植物物种两者中表达，但可修饰序列以说明单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好和gc含量偏好，因为这些偏好已显示出是不同的(murray et al.(1989)nucleic acids res.17:477-498)。因此，对于特定氨基酸的稻偏好密码子可来源于稻的已知基因序列，而对于特定氨基酸的茄子偏好密码子可来源于茄子的已知基因序列。
[0108]
已知增强细胞宿主中基因表达的另外的序列修饰。这些包括消除编码虚假多腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复序列和其他可能有害于基因表达的充分表征的序列。可调整序列的gc含量至给定细胞宿主的平均水平，如通过参考宿主细胞中表达的已知基因所计算的。
[0109]
vaeck等(vaeck m,reynaerts a, h,jansens s,de beukeleer m,dean c,
zabeau m,van montagu m,leemans j(1987)transgenic plants protected from insect attack.nature 327:33
–
37)报道了表达bt cry1ab基因的昆虫抗性转基因烟草植物的产生，以用于保护免受欧洲玉米螟(美国和欧洲攻击玉蜀黍的主要有害生物之一)的侵害。然而，尽管使用了强启动子，但植物中的毒素产生最初对于有效的农业利用来说太弱(koziel g m,beland g l,bowman c,carozzi n b,crenshaw r,crossland l,dawson j,desai n,hill m,kadwell s,launis k,maddox d,mcpherson k,heghji m,merlin e,rhodes r,warren g,wright m,evola s(1993)field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from bacillus thuringiensis.biotechnology 11:194
–
200)。与植物基因不同，bt基因具有高a t含量(66％)，这是对于植物来说是次优密码子使用，并潜在地导致转录的错误剪接或提前终止(de la riva和adang，1996)。
[0110]
perlak等(perlakf j,fuchs r l,dean d a,mcpherson s l,fishhoff d a(1991)modification of the coding sequences enhances plant expression of insect control protein genes,proc.natl.acad.sci.(usa)88:3324
–
3328.)在不修饰编码的肽序列的情况下修饰cry基因的编码序列，以确保植物的最佳密码子使用，其与天然基因相比允许在植物中产生两倍毒素。该策略已成功地用于许多植物，例如用经修饰cry1基因转化的棉花、稻和玉蜀黍，以及用经修饰cry3a基因转化的马铃薯。bt玉蜀黍和bt棉花在全世界大规模种植。
[0111]
因此，生物体中天然存在的密码子偏倚导致异源生物体中基因的次优表达。在本发明中，来自苏云金芽孢杆菌的天然cry2ai基因在电脑中被重新配置以用于在植物包括双子叶植物和单子叶植物中最佳表达重组蛋白。通过多变量分析进行设计时，稀有和高度稀有的密码子被双子叶/单子叶植物的高度偏好密码子所替代。人工检查通过基因设计者工具设计的重新配置的合成基因的稀有密码子使用、mrna二级结构的稳定性、基因二级转录的任何开始，以避免截短蛋白的表达。通过mrna优化器对经优化的mrna的结构和稳定性进行检查和确认。
[0112]
本发明的特定方面提供了编码cry2ai杀虫蛋白的经密码子优化的合成核酸，包含本发明核酸分子的杀虫组合物、多核苷酸构建体、重组核苷酸序列、重组载体、转化的微生物和植物。这些组合物可用于控制害虫，尤其是作物植物害虫的方法中。
[0113]
本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列可与多种启动子包括组成型、诱导型、暂时调节型、发育调节型、组织偏好型和组织特异性启动子融合以制备重组dna分子。当与天然cry2ai基因相比时，本文公开的经密码子优化的合成cry2ai核苷酸序列(编码序列)在转化的植物中提供了显著更高水平的表达。因此，可产生对鳞翅目有害生物(例如棉铃虫-棉铃虫和玉米穗虫、稻纵卷叶螟-稻纵卷叶螟以及三化螟-稻黄茎螟和棉红铃虫)具有抗性的植物。
[0114]
本发明的一个实施方案提供了具有植物偏好密码子的合成的经密码子优化的cry2ai核苷酸序列。本发明的另一个实施方案提供了在植物例如稻、番茄和茄子中合成的经密码子优化的cry2ai核苷酸序列的表达。本发明的另一个实施方案提供了dna表达盒，植物转化载体，其包含本发明的合成的cry2ai核苷酸序列。本发明的另一个实施方案提供了组合物，其包含本文公开的合成的经密码子优化的cry2ai核苷酸序列或由本文公开的合成
的经密码子优化的cry2ai核苷酸序列编码的杀虫多肽。本文公开的组合物可以是包含本发明的农药和/或杀虫蛋白质/多肽的农药和或杀虫组合物。另一个实施方案提供了转基因植物，其包含表达cry2ai毒素蛋白的本发明经密码子优化的合成cry2ai核苷酸序列。
[0115]
特别地，本发明提供了如seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6和seq id no:7中所示的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中所述核苷酸编码具有如seq id no:1中所示氨基酸序列的杀虫cry2ai蛋白。
[0116]
在一些实施方案中，本发明还提供了用本文公开的经密码子优化的cry2ai核苷酸序列转化的植物和微生物，以及涉及使用这样的核苷酸序列、农药组合物、转化的生物体及其产物来影响害虫的方法。
[0117]
实施方案的多核苷酸序列可用于转化任何生物体，例如植物和微生物例如苏云金芽孢杆菌，以产生所编码的杀虫和/或农药蛋白。提供了涉及使用这样的转化的生物体来影响或控制植物害虫的方法。实施方案的核酸和核苷酸序列也可用于转化细胞器，例如叶绿体。期望生物体的转化方法在本领域中是公知的，其使得本领域技术人员能够使用本发明中公开的多核苷酸序列进行转化。
[0118]
实施方案的核酸涵盖已针对特定生物体的细胞表达而优化的核酸或核苷酸序列，例如，已使用基于具有农药活性的多肽的氨基酸序列的植物偏好密码子回译(back-translated)(即反向翻译)的核酸序列。
[0119]
本公开内容提供了编码杀虫cry2ai蛋白的经密码子优化的合成核酸/核苷酸序列。合成编码序列特别适用于在双子叶(双子叶植物)和单子叶(单子叶植物)植物例如稻、番茄、茄子、玉蜀黍、棉花和豆科作物中表达蛋白质。
[0120]
本公开内容提供了编码cry2ai蛋白的合成核苷酸序列，其特别适于在植物中良好表达。所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列利用植物优化的密码子，其使用频率与它们在植物物种中天然存在的基因中的平均使用频率大致相同。本公开内容还包括用于赋予植物昆虫抗性的经密码子优化的合成核苷酸序列。对于植物转化，本公开内容中使用了选择标记基因。含有本文所公开的合成序列的dna构建体和转基因植物被教导为用于使用农业上重要的植物的方法和组合物。
[0121]
由经密码子优化的合成核苷酸序列编码的蛋白质各自表现出鳞翅目物种抑制生物活性。双子叶植物和/或单子叶植物可用本文公开的每种核苷酸序列单独或与其他编码杀虫剂(例如设计成抑制一种或更多种目标有害生物内基因的蛋白质、晶体蛋白、毒素和/或有害生物特异性双链rna等)的核苷酸序列组合转化，以通过仅使用来源于苏云金芽孢杆菌菌株的已知鳞翅目杀虫蛋白实现在该领域以前是不可行的昆虫抗性管理手段。
[0122]
本发明的经密码子优化的合成核苷酸序列还可与编码杀虫毒素的其他类型的核苷酸序列组合用于植物中以实现将植物转化为包含用于控制选自以下的每种常见植物有害生物中的一种或更多种的至少一种手段：鳞翅目害虫、鞘翅目害虫、刺吸害虫等。
[0123]
调节序列
[0124]
转录和翻译调节信号包括但不限于启动子、转录起始位点、操纵子、激活剂、增强子、其他调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。
[0125]
多核苷酸/dna构建体将在转录的5’至3’方向上包括：转录和翻译起始区(即启动子)、实施方案的dna序列以及在用作宿主的生物体中发挥功能的转录和翻译终止区(即终
止区)。转录起始区(即启动子)对于宿主生物体和/或实施方案的序列可以是天然的、类似的、外来的或异源的。此外，启动子可以是天然序列，或者是合成序列。本文中使用的术语“外来的”表示在引入启动子的天然生物体中未发现该启动子。在启动子对于实施方案的序列是“外来的”或“异源的”的情况下，预期该启动子不是用于实施方案的可操作地连接的序列的天然或天然存在的启动子。
[0126]
在实施方案的实施中可以使用许多启动子。可基于期望的结果选择启动子。本发明的经密码子优化的核苷酸序列可与组成型、组织偏好型、诱导型或其他启动子组合用于在宿主生物体中表达。用于植物宿主细胞中的合适组成型启动子包括例如核心camv 35s启动子；稻肌动蛋白；泛素；als启动子等。
[0127]
取决于期望的结果，通过诱导型启动子表达基因可能是有益的。对调节植物中实施方案的核苷酸序列的表达特别感兴趣的是伤口诱导型启动子。这样的伤口诱导型启动子可对昆虫取食造成的损害有响应，并且包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin ii)基因；wun1和wun2、win1和win2；wip1；mpi基因等。
[0128]
此外，病原体诱导型启动子可用于一些实施方案的方法和核苷酸构建体中。这样的病原体诱导型启动子包括来自在病原体感染后被诱导的病程相关蛋白(pr蛋白)的启动子；例如，pr蛋白、sar蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。
[0129]
化学调节启动子可用于通过外源化学调节剂的应用来调节植物中基因的表达。取决于目的，启动子可以是化学诱导型启动子，其中化学物质的应用诱导基因表达，或者是化学抑制型启动子，其中化学物质的应用抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉蜀黍in2-2启动子、由用作出土前施用的除草剂的疏水亲电化合物激活的玉蜀黍gst启动子和由水杨酸激活的烟草pr-1a启动子。其他目的化学调节启动子包括类固醇响应型启动子。
[0130]
在特定组织中具有“偏好”表达的启动子在该组织中的表达程度大于在至少一种其他植物组织中的表达程度。一些组织偏好启动子显示出几乎仅在特定组织中表达。组织偏好启动子可用于靶向特定植物组织内增强的农药蛋白表达。如果有必要的话，可对这样的启动子进行修饰以进行弱表达。
[0131]
一些组织特异性启动子的实例包括但不限于叶偏好启动子、根特异性或根偏好启动子、种子特异性或种子偏好启动子、花粉特异性启动子和髓特异性启动子。
[0132]
根偏好或根特异性启动子是已知的，并且可选自可从文献中获得的或从多种相容物种中从头分离的启动子。
[0133]“种子偏好”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育过程中有活性的那些启动子，例如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(在种子萌发过程中有活性的那些启动子)二者。γ-玉米醇溶蛋白和glob-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于β.-菜豆蛋白、β.-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kda玉米醇溶蛋白、22kda玉米醇溶蛋白、27kda玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、蜡质、shrunken 1、shrunken 2、球蛋白1等。
[0134]
在期望低水平表达的情况下，将使用弱启动子。通常，本文中使用的术语“弱启动子”是指驱动编码序列以低水平表达的启动子。这样的弱组成型启动子包括例如rsyn7启动
子的核心启动子、核心35s camv启动子等。
[0135]
终止区可从根癌农杆菌(a.tumefaciens)的ti质粒获得，例如章鱼碱合酶(octopine synthase，ocs)和胭脂碱合酶(nopaline synthase，nos)终止区。
[0136]
dna表达盒可另外包含5’前导序列。这样的前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导是本领域已知的并且包括：小rna病毒前导，例如emcv前导(脑心肌炎5’非编码区)；马铃薯y病毒组(potyvirus)前导，例如tev前导(烟草蚀纹病毒)、mdmv前导(玉蜀黍矮花叶病毒)、来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mrna的非翻译前导(amv rna 4)；烟草花叶病毒前导(tmv)；和玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导(mcmv)。
[0137]
在本文公开和要求保护的本发明的一个具体实施方案中，组织偏好或组织特异性启动子与本公开内容的编码杀虫蛋白的合成dna序列可操作地连接，并且转基因植物用至少一种这样的重组分子稳定转化。得到的植物将对以那些在其中表达dna的植物部分为食的特定昆虫具有抗性。
[0138]
选择标记基因
[0139]
通常，表达盒将包含用于选择转化的细胞的选择标记基因。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶ii(neomycin phosphotransferase ii，nptii)和潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase，hptii)的那些，以及赋予对除草化合物例如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮类和2,4-二氯苯氧乙酸盐/酯(2,4-dichlorophenoxyacetate，2,4-d)的抗性的基因。合适的选择标记基因的另外的实例包括但不限于编码对以下的抗性的基因：氯霉素、甲氨蝶呤、链霉素、壮观霉素、博来霉素、磺胺、溴苯腈、草甘膦、草丁膦(phosphinothricin)。
[0140]
以上选择标记基因列表并不意味着限制。在实施方案中可使用任何选择标记基因。
[0141]
dna构建体和载体
[0142]
本发明的经密码子优化的dna/核苷酸序列在dna构建体中提供，用于在目的生物体中表达。该构建体将包括与本发明的序列可操作地连接的5’和3’调节序列。
[0143]
这样的多核苷酸构建体具有多个限制性位点以用于插入编码cry2ai毒素蛋白序列的dna序列，以处于调节区的转录调节之下。多核苷酸构建体可另外包含选择标记基因。所述构建体可另外包含至少一个待共转化到期望生物体中的另外的基因。或者，可在多个多核苷酸构建体上提供另外的基因。
[0144]
在制备dna构建体/表达盒时，可操纵多种dna片段，以便提供正确方向的dna序列，并在适当的情况下以正确的阅读框提供。为此，可使用适配子或接头来连接dna片段，或可涉及其他操作以提供方便的限制性位点、去除多余dna、去除限制性位点等。为此，可能涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、重新替换，例如转换和颠换。
[0145]
根据本发明，可将本文公开的dna构建体/表达盒插入重组表达载体。表述“重组表达载体”意指细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。一般来说，只要可以在宿主中复制和稳定，就可以使用任何质粒或载体。表达载体的重要特征是它具有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
[0146]
包含大肠杆菌中的复制系统和允许选择转化的细胞的标记的大量克隆载体可用于准备将外来基因插入高等植物中。载体包括例如pbr322、puc系列、m13mp系列、pacyc184
等。因此，可将具有编码bt毒素蛋白的序列的dna片段在合适限制性位点处插入载体中。所得质粒用于转化到大肠杆菌中。将大肠杆菌细胞在合适的营养培养基中培养，然后收获并裂解。回收质粒。序列分析、限制性分析、电泳和其他生化分子生物学方法通常作为分析方法进行。每次操作之后，所使用的dna序列可被切割并与下一个dna序列连接。每个质粒序列都可在相同或其他质粒中克隆。取决于将期望基因插入植物的方法，可能需要其他dna序列。例如，如果ti或ri质粒用于植物细胞的转化，则至少必须将ti或ri质粒t-dna的右边界，但经常是右边界和左边界连接起来作为待插入的基因的侧翼区域。
[0147]
包含本公开内容的经密码子优化的核苷酸序列和用于调节转录/翻译的合适信号的表达载体可通过本领域技术人员公知的方法构建。这样的方法的实例包括体外重组dna技术、dna合成技术和体内重组技术。可将dna序列与表达载体中合适的启动子有效地连接，以诱导mrna的合成。此外，表达载体可包含核糖体结合位点和转录终止子作为翻译起始位点。
[0148]
本发明的重组载体的一个优选实例是ti质粒载体，当该载体存在于合适宿主例如根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)中时，其可将自身的一部分(即所谓的t区)转移至植物细胞。其他类型的ti质粒载体目前用于将杂交基因转移至原生质体，原生质体可通过将植物细胞或杂交dna适当插入植物基因组而产生新植物。
[0149]
表达载体可包含至少一个选择标记基因。选择标记基因是具有这样的特性的核苷酸序列，基于该特性可通过常规化学方法对该选择标记基因进行选择。可用于区分转化的细胞与未转化的细胞的每个基因都可以是选择标记。实例包括对除草剂(例如草甘膦和phosphintricin)具有抗性的基因，以及对抗生素(例如卡那霉素、潮霉素、g418、博来霉素和氯霉素)具有抗性的基因，但不限于此。
[0150]
对于本发明的重组载体，启动子可以是camv 35s、肌动蛋白或泛素启动子中的任何一种，但不限于此。由于可以在不同阶段以多种机制选择转化体，因此对于本发明可优选组成型启动子。因此，本文不限于选择组成型启动子的可能性。
[0151]
对于本发明的重组载体，可使用任何常规终止子。其实例包括胭脂碱合成酶(nos)、稻α-淀粉酶ramy1 a终止子、菜豆碱终止子和根癌农杆菌的optopine基因终止子等，但不限于此。关于终止子的必要性，众所周知，这样的区域可提高植物细胞中转录的可靠性和效率。因此，考虑到本发明的情况，终止子的使用是高度偏好的。
[0152]
本领域技术人员将知晓，本文公开的dna构建体和载体可用于产生昆虫抗性转基因植物和/或产生杀虫组合物，其中所述组合物可包含包含所述核苷酸序列的苏云金芽孢杆菌细胞或能够表达本文公开的核苷酸序列以产生cry2ai杀虫蛋白的任何其他微生物。
[0153]
重组细胞
[0154]
实施方案还涵盖用至少一种本发明的经密码子优化的核酸、用包含所述核酸的表达盒或用包含所述表达盒的载体转化的微生物。在一些实施方案中，微生物是在植物上繁殖的微生物。本发明的一个实施方案涉及包封的农药蛋白，其包含能够表达本发明cry2ai蛋白的转化的微生物。
[0155]
另一个实施方案涉及转化的生物体，例如选自植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻类的生物体。转化的生物体包含本发明的经密码子优化的合成dna分子、包含所述dna分子的表达盒或包含所述表达盒的载体，其可稳定地并入到转化的
生物体的基因组中。
[0156]
认识到编码cry2ai蛋白的基因可用于转化昆虫病原生物体。这样的生物体包括杆状病毒、真菌、原生动物、细菌和线虫。
[0157]
可通过合适的载体将编码实施方案的cry2ai蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列引入微生物宿主中，并将所述宿主施加于环境或植物或动物。在将核酸插入细胞中的背景下，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”并且包括提及将核酸并入到真核或原核细胞中，其中可将核酸并入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体dna)中，转化成自主复制子，或瞬时表达(例如转染的mrna)。
[0158]
在允许dna稳定维持和表达的条件下，有多种方法可用于将表达农药蛋白的外来dna引入微生物宿主中。例如，可构建表达盒，其包含与用于表达核苷酸构建体的转录和翻译调节信号可操作地连接的目的核苷酸构建体以及与宿主生物体中的序列同源的核苷酸序列，由此将发生整合，和/或在宿主中发挥功能的复制系统，由此将发生整合或稳定维持。植物转化方法与转基因植物的产生
[0159]
可使用本领域公知的多种技术将本发明的编码bt cry2ai毒素蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列(dna序列)插入植物细胞中。一旦插入的dna被整合到植物基因组中，它就是相对稳定的。转化载体通常包含赋予转化的植物细胞对杀生物剂或抗生素(例如卡那霉素、双丙氨膦(bialaphos)、g418、博来霉素或潮霉素)的抗性的选择标志物。因此，单独使用的标志物应允许选择转化的细胞，而不是不含插入的dna的细胞。
[0160]
有许多技术可用于将dna插入植物宿主细胞中。那些技术包括使用根癌农杆菌或发根农杆菌(agrobacterium rhizogenes)作为转化剂的t-dna转化、融合、注射、基因枪法(微粒轰击)，或电穿孔以及其他可能的方法。如果使用农杆菌进行转化，则待插入的dna必须克隆到特定质粒中，即中间载体或双元载体中。由于与t-dna中的序列同源的序列，可通过同源重组将中间载体整合到ti或ri质粒中。ti或ri质粒还包含t-dna转移所必需的vir区。
[0161]
中间载体不能在农杆菌中自我复制。中间载体可通过辅助质粒(缀合)转移到根癌农杆菌中。双元载体可在大肠杆菌和农杆菌二者中自我复制。它们包含选择标记基因和由右和左t-dna边界区域构成的接头或多接头。它们可直接转化到农杆菌中。用作宿主细胞的农杆菌将包含携带毒力(vir)区域的质粒。vir区域对于将t-dna转移到植物细胞中是必需的。可包含另外的t-dna。如此转化的细菌用于植物细胞的转化。植物外植体可有利地与根癌农杆菌或发根农杆菌一起培养以用于将dna转移到植物细胞中。然后可以在合适的培养基中从被感染的植物材料(例如，叶片、秆段、根，以及原生质体或悬浮培养的细胞)再生整株植物，该培养基可包含用于选择的抗生素或杀生物剂。然后可检测如此获得的植物是否存在插入的dna。在注射和电穿孔的情况下，对质粒没有特殊要求。可使用普通质粒，例如puc衍生物。
[0162]
已经转化的细胞可以按照传统的方法生长成植物。然后可使这些植物生长，并用相同的转化品系或者不同的品系授粉，并且鉴定出具有期望表型特征的组成型或诱导型表达的所得杂种。可生长两代或更多代以确保稳定维持和遗传期望表型特征的表达，然后收获种子以确保已实现期望表型特征的表达。它们可形成生殖细胞并将转化的性状传递给后代植物。这样的植物可以以正常方式生长，并与具有相同转化遗传因子或其他遗传因子的
植物杂交。产生的杂交个体具有相应的表型特性。
[0163]
本发明的植物转化方法涉及将本发明的多核苷酸引入植物中，并且不依赖于用于将多核苷酸引入植物中的特定方法。用于将多核苷酸引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
[0164]
在本发明的一个实施方案中，用本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列转化植物。转化的植物的一些非限制性实例是包含本发明的编码cry2ai蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列的可育转基因稻和番茄植物。稻和番茄的转化方法是本领域已知的。还可使用本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列转化多种其他植物。
[0165]“稳定转化”旨在意指将引入植物中的核苷酸构建体整合到植物基因组中，并能被其后代遗传。“瞬时转化”旨在意指将多核苷酸引入植物中而不整合到植物基因组中，或将多肽引入植物中。
[0166]
转化方案以及用于将核苷酸序列引入植物中的方案可因转化所靶向的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而异。将核苷酸序列引入植物细胞中并随后插入植物基因组中的合适方法包括微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化和弹道粒子加速。
[0167]
在本发明的一个实施方案中，本发明的编码cry2ai毒素的经密码子优化的合成核苷酸序列在高等生物体(例如使用本公开内容的经密码子优化的核苷酸序列的植物)中表达。在这种情况下，表达有效量毒素的转基因植物保护自己免受害虫的侵害。当昆虫开始以这样的转基因植物为食时，它也会摄入所表达的毒素。这将阻止昆虫进一步咬入植物组织，或可甚至伤害或杀死该昆虫。将本发明的核苷酸序列插入到表达盒中，接下来将其稳定整合到植物基因组中。
[0168]
实施方案还涵盖包含所述实施方案的至少一种核苷酸序列的转化或转基因植物。在一些实施方案中，植物用包含实施方案的至少一种核苷酸序列的核苷酸构建体稳定转化，所述核苷酸序列与驱动植物细胞中表达的启动子可操作地连接。
[0169]
虽然实施方案不依赖于提高植物对植物有害生物抗性的特定生物机制，但在植物中表达实施方案的核苷酸序列可导致实施方案的农药蛋白的产生以及植物对植物有害生物的抗性提高。这些实施方案的植物可用于影响害虫的农业方法中。某些实施方案提供了转化的作物植物，例如稻和番茄植物，其可用于影响植物害虫的方法中，所述害虫例如多种鳞翅目昆虫，包括稻纵卷叶螟-稻纵卷叶螟以及三化螟-稻黄茎螟。
[0170]“对象植物或植物细胞”是其中目的基因的遗传改变(例如转化)已受影响的植物或植物细胞，或是来源于如此改变的植物或细胞并且包含这种改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了用于测量对象植物或植物细胞表型变化的参考点。对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型植物或细胞，即与导致对象植物或细胞的遗传改变的起始材料相同的基因型；(b)与起始材料具有相同基因型但已用无效构建体(即，用对目的性状没有已知影响的构建体，例如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)作为对象植物或植物细胞后代中的未转化分离子的植物或植物细胞；(d)与对象植物或植物细胞在遗传上相同但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)在目的基因在其中不表达的条件下的对象植物或植物细胞本身。
[0171]
cry2ai核苷酸确定的性状转移(或渐渗(introgression))到近交植物例如棉花、稻、茄子(brinjal)、番茄和豆科作物品系中可通过轮回选择育种例如通过回交来实现。在
这种情况下，首先将期望的轮回亲本与携带本文公开的用于cry2ai确定的性状的核苷酸序列的近交供体(非轮回亲本)杂交。然后将该杂交的后代与轮回亲本回交，然后在产生的后代中选择待从非轮回亲本转移的期望性状。在与轮回亲本进行三代、优选四代、更优选五代或更多代回交并选择期望性状之后，对于控制所转移性状的基因座，后代将是杂合的，但对于大多数或几乎所有其他基因将与轮回亲本相似。
[0172]
实施方案还涉及实施方案的转化的植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶以及根和枝条的插条。
[0173]
可在实施方案的方法中使用的植物类别通常与适于转化技术的高等植物类别一样广泛，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的实例包括但不限于谷物、谷类植物(cereal)、蔬菜、油、果实、观赏植物、草坪植物等。例如，稻(水稻(oryza sativa)、稻属(oryza spp.))、玉米(玉蜀黍(zea mays))、黑麦(secale cereale)、高粱(双色高粱(sorghum bicolor)、普通高粱(sorghum vulgare))、粟(例如珍珠粟(pennisetum glaucum)、黍(panicum miliaceum)、谷子(setaria italica)、龙爪稷(eleusine coracana)、小麦(triticum aestivum、小麦属(triticum sp.))、燕麦(avena sativa)、大麦(hordeum vulgare l)、甘蔗(saccharum spp.)、棉花(陆地棉(gossypium hirsutum)、海岛棉(gossypium barbadense)、棉花属(gossypium sp.))、番茄(lycopersicon esculentum)、茄子(solanum melongena)、马铃薯(solanum tuberosum)、甜菜(beta vulgaris)、甘薯(ipomoea batatus)、木薯(manihot esculenta)、莴苣(lactuca sativa)、甘蓝(brassica oleracea var.capitata)、花椰菜(brassica oleracea var.botrytis)、青花菜(brassica oleracea var.indica)、芸薹属(例如甘蓝型油菜(b.napus)、芜菁(b.rapa)、芥菜(b.juncea))(特别是可用作种子油来源的那些芸薹属物种)、大豆(glycine max)、向日葵(helianthus annuus)、红花(carthamus tinctorius)、花生(arachis hypogaea)、木豆(cajanus cajan)、鹰嘴豆(cicer arietinum)、青豆(phaseolus vulgaris)、利马豆(phaseolus limensis)、豌豆(pisum sativum)、豌豆(lathyrus spp.)、黄瓜(cucumis sativus)、哈密瓜(cucumis cantalupensis)、和甜瓜(cucumis melo)、苜蓿(medicago sativa)、烟草(nicotiana tabacum)和拟南芥(arabidopsis thaliana)。
[0174]
目的植物包括提供目的种子的谷物植物、油籽植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦、谷子等。油籽植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸薹、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、刺槐豆、葫芦巴、大豆、菜豆(garden bean)、豇豆(cowpea)、绿豆(mungbean)、利马豆、蚕豆(fava bean)、扁豆(lentil)、鹰嘴豆等。
[0175]
在某些实施方案中，至少一种本发明的经密码子优化的合成核苷酸序列可与目的多核苷酸序列的任何组合堆叠，以创建具有期望表型的植物。例如，经密码子优化的合成核苷酸序列可与任何其他编码具有农药和/或杀虫活性的多肽(例如其他bt毒性蛋白等)的多核苷酸堆叠。所产生的组合还可包含任何一种目的多核苷酸的多个拷贝。实施方案的核苷酸序列还可与任何其他基因或基因组合堆叠，以产生具有多种期望性状组合的植物，所述性状组合包括但不限于动物饲料期望的性状，例如高油基因、平衡的氨基酸、非生物胁迫抗性等。
[0176]
本发明的核苷酸序列还可与以下堆叠：疾病或除草剂抗性期望的性状、无毒性和
疾病抗性基因、乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，als)、谷氨酰胺合酶抑制剂(例如草丁膦或basta(例如bar基因))、草甘膦抗性、加工(processing)或加工(process)产物期望的性状例如高油、改性油、改性淀粉(例如adpg焦磷酸化酶(agpase)、淀粉合酶(starch synthase，ss)、淀粉分支酶(starch branching enzyme，sbe)和淀粉脱支酶(starch debranching enzyme，sdbe))。还可将实施方案的多核苷酸与提供农艺学性状(例如雄性不育性、秆强度、开花时间)或转化技术性状(例如细胞周期调节或基因靶向)的多核苷酸组合。
[0177]
这些堆叠组合可通过任何方法创建，包括但不限于通过任何常规、遗传转化或本领域已知的任何其他方法杂交育种植物。如果这些性状是通过对植物进行遗传转化而堆叠的，则目的多核苷酸序列可以在任何时候并且以任何顺序被组合。例如，包含一个或更多个期望性状的转基因植物可用作通过后续转化引入更多性状的靶标。这些性状可以在共转化方案中与由任何转化盒组合提供的目的多核苷酸同时引入。例如，如果将引入两种序列，则这两种序列可以包含在分开的转化盒(trans)中或包含在同一个转化盒(cis)中。序列的表达可由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可期望引入将抑制目的多核苷酸表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任意组合组合，以在植物中产生期望的性状组合。进一步认识到，可使用位点特异性重组系统将多核苷酸序列堆叠在期望的基因组位置处。
[0178]
转基因植物分析
[0179]
聚合酶链反应(pcr)
[0180]
本发明提供了用于对本发明公开的如seq id no:2中所示的经密码子优化的核苷酸序列的片段进行pcr扩增的方法，所述核苷酸序列编码具有如seq id no:1中所示氨基酸序列的cry2ai蛋白，所述方法包括在存在如seq id no:8至9中所示引物组的情况下通过pcr扩增dna。类似地，本发明公开的如seq id no:3至8中所示的经密码子优化的核苷酸序列的片段可使用对所述核苷酸序列具有特异性的引物来扩增。本领域技术人员可设计用于扩增所述核苷酸的引物组。用于从模板dna pcr扩增dna片段的方案和条件在本文中其他地方描述或以其他方式在本领域中已知。
[0181]
寡核苷酸引物可设计成用于pcr反应以从本发明的经密码子优化的dna序列扩增相应的dna序列。设计pcr引物和pcr克隆的方法在本领域中是公知的，并在sambrook et al.(1989)molecular cloning:a laboratory manual(第二版,cold spring harbor laboratory press,plainview,n.y.)(以下称为“sambrook”)中公开。已知的pcr方法包括但不限于使用成对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
[0182]
在一个实施方案中，本发明提供了适合于pcr扩增编码农药多肽的本发明经密码子优化的合成核苷酸序列的片段的引物组以及在dna的pcr扩增中使用该引物组的方法。引物组包括正向和反向引物，其被设计成与本发明的核苷酸序列退火。
[0183]
用于扩增本发明的如seq id no:2中所示核苷酸序列的引物组包含如seq id no:8和seq id no:9中所示的正向和反向引物。
[0184]
southern杂交
[0185]
在杂交技术中，已知核苷酸序列的全部或部分被用作探针，其选择性地与克隆基
因组dna片段群中存在的或来自所选生物体的其他相应核苷酸序列杂交。杂交探针可以是本发明经密码子优化的dna序列的pcr扩增的dna片段，或者含有核苷酸序列或能够与本文所公开的合成核苷酸的相应序列杂交的其他寡核苷酸的线性化质粒，并且可用可检测基团例如
32
p或任何其他可检测标志物来标记。因此，例如用于杂交的探针可通过基于实施方案的序列标记合成的寡核苷酸来制备。用于杂交的探针的制备方法在本领域中是公知的，并在sambrook中公开。
[0186]
例如，本文公开的整个序列或其一个或更多个部分可用作能够与相应序列特异性杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，这样的探针包括对于实施方案的序列而言是独特的且长度通常为至少约10或20个核苷酸的序列。这样的探针可用于通过pcr扩增核苷酸序列的相应cry2ai核苷酸序列。
[0187]
这样的序列的杂交可在严格条件下进行。本文中使用的术语“严格条件”或“严格杂交条件”是指这样的条件，在该条件下，探针与其靶序列杂交的程度会比与其他序列的杂交程度明显更高(例如，至少是背景的2倍、5倍或10倍)。严格条件是顺序依赖性的，并且在不同的情况下会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可调整严格条件以允许序列中的一些错配，以使得检测到较低程度的相似性(异源探测)。
[0188]
通常，严格条件将是，在ph为7.0至8.3下，盐浓度为小于约1.5m na离子，通常约0.01至1.0m na离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃并且对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度为至少约60℃。也可通过添加去稳剂(例如甲酰胺)来实现严格条件。示例性低严格条件包括在37℃下用30％至35％甲酰胺、1m nacl、1％sds(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50℃至55℃下在1
×
至2
×
ssc(20
×
ssc＝3.0m nacl/0.3m柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0m nacl、1％sds中杂交，并在55至60℃下在0.5
×
至1
×
ssc中洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1m nacl、1％sds中杂交，并在60℃至65℃下在0.1
×
ssc中最终洗涤至少约20分钟。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％sds。杂交持续时间通常小于约24小时，通常约4至约12小时。
[0189]
特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因子是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于dna-dna杂交，tm(热熔点)可从meinkoth和wahl(1984)anal.biochem.138:267-284的方程近似：tm＝81.5℃ 16.6(log m) 0.41(％gc)-0.61(％form)-500/l；其中m是单价阳离子的摩尔浓度，％gc是dna中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，“％form”是杂交溶液中甲酰胺的百分比，以及l是以碱基对表示的杂交长度。tm是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和ph下)。洗涤通常至少进行到达到平衡并实现低背景杂交水平，例如2小时、1小时或30分钟。对于每1％的错配，tm降低约1℃；因此，可调整tm杂交和/或洗涤条件，以与期望同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有90％同一性的序列，则tm可降低10℃。通常，严格条件选择为比特定序列及其互补序列在限定的离子强度和ph下的tm低约5℃。然而，严格的严格条件可在低于t
m 1、2、3或4℃下利用杂交和/或洗涤；中等严格条件可在低于tm6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下利用杂交和/或洗涤；低严格条件可在低于t
m 11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下利用杂交和/或洗涤。
[0190]
使用方程、杂交和洗涤组合物以及期望的tm，普通技术人员将理解杂交和/或洗涤
溶液的严格性的变化是固有地描述的。如果期望的错配程度导致tm低于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则可以提高ssc浓度，以便可以使用更高的温度。对于核酸杂交的广泛指南可见于tijssen(1993)laboratory techniques in biochemistry and molecular biology
‑‑
hybridization with nucleic acid probes,part i,第二章(elsevier,new york)；和ausubel et al.,eds.(1995)current protocols in molecular biology,第二章(greene publishing and wiley-interscience,new york)。另见sambrook et al。
[0191]
本发明涵盖与如seq id no:2中所示核苷酸序列互补的核苷酸序列，或者与如seq id no:2中所示核苷酸序列的从第251至402位和/或从第1456至1628位核苷酸的至少10个核苷酸特异性杂交的核苷酸序列或其互补序列。本领域技术人员将知晓基于本文公开的用于核酸杂交的核苷酸序列的探针的制备。
[0192]
生物测定
[0193]
本领域技术人员已知多种生物测定技术。一般操作包括将实验化合物或生物体添加至封闭容器中的饮食源。农药活性可通过但不限于在取食和暴露适当时间长度之后的死亡率变化、体重减轻、吸引力、驱避性以及其他行为和身体变化来测量。本文所述的生物测定可用于幼虫或成虫阶段的任何取食害虫。
[0194]
杀虫组合物
[0195]
生物农药是传统化学农药最有希望的替代品之一，其对环境和生物区系(biota)的危害较小或没有。苏云金芽孢杆菌(通常称为bt)是在其生长的静止期或衰老期期间产生称为δ-内毒素(δ-内毒素)的晶体蛋白的杀虫革兰氏阳性孢子形成细菌。bt最初由shigetane ishiwatari于1902年从患病的蚕(家蚕(bombyx mori))中发现。但其在1915年由ernst berliner从患病的地中海粉螟(ephestia kuhniella)中进行正式表征。首次将其应用于控制昆虫的记录是在1920年底在匈牙利，并且在1930年代初在南斯拉夫将其应用于控制欧洲玉米螟。bt作为主要的生物合理性农药最初被表征为昆虫病原体，并且其杀虫活性主要或完全归因于伴孢晶体。它针对多于150种害虫具有活性。bt培养物的毒性在于其产生晶体蛋白的能力，这一观察结果导致了基于bt的生物杀虫剂的开发以用于控制鳞翅目、双翅目和鞘翅目中的某些昆虫物种。
[0196]
实施方案的组合物可用于以多种方式保护植物、种子和植物产品。例如，组合物可用于涉及通过选自喷施、撒粉、撒播或种子包衣的操作将有效量的农药组合物置于有害生物的环境中的方法。
[0197]
在植物繁殖材料(果实、块茎、鳞茎、球茎、谷粒、种子)，但尤其是种子作为商业产品出售之前，其通常用保护剂包衣(其包含除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制剂中的数种的混合物)与另外的载体、表面活性剂或通常用于制剂领域的促进施加的辅助剂一起(如果期望的话)进行处理，以提供保护免受细菌、真菌或动物有害生物造成的损害。为了处理种子，可通过用液体制剂浸渍块茎或谷粒，或通过用组合的湿或干制剂进行包覆来将保护剂包衣施加至种子。此外，在特殊情况下，可以是其他施加于植物的方法，例如针对芽或果实进行处理。
[0198]
可用包含种子处理化合物的种子保护剂包衣对包含编码实施方案的农药蛋白的核苷酸序列的实施方案的植物种子进行处理，该化合物例如克菌丹(captan)、萎锈灵(carboxin)、福美双(thiram)、甲霜灵(methalaxyl)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)和
常用于种子处理的其他化合物。在一个实施方案中，将包含实施方案的农药组合物的种子保护剂包衣单独使用或与通常用于种子处理的种子保护剂包衣之一组合使用。实施方案的组合物可以是适合于直接施加的形式或作为需要在施加前用适量的水或其他稀释剂进行稀释的主要组合物的浓缩物。农药浓度将根据特定制剂的性质(具体地，其是浓缩物还是待直接使用)而变化。组合物含有1至98％的固体或液体惰性载体，以及0至50％或0.1至50％的表面活性剂。这些组合物将以商业产品的标示速率施用，例如，当在干燥状态下时每英亩约0.01lb至5.0lb.，和当在液体状态下时每英亩约0.01pts.至10pts.。
[0199]
本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列还可用于产生能够产生cry2ai蛋白的转化的苏云金芽孢杆菌。转化的苏云金芽孢杆菌随后可用于产生可用于农业活动(例如害虫管理)的杀虫和/或农药组合物。
[0200]
在一些实施方案中，转化的微生物(其包括整个生物体、细胞、孢子(例如用本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列转化的苏云金芽孢杆菌)、农药蛋白、农药组分、影响有害生物的组分、突变体、活或死细胞和细胞组分(包括活和死细胞与细胞组分的混合物并且包括破碎的细胞和细胞组分))或分离的杀虫蛋白可以与可接受的载体一起配制成农药组合物，其例如为混悬剂、溶液剂、乳剂、撒粉剂、可分散颗粒剂或丸粒剂、可湿性散剂和可乳化浓缩物、气雾剂或喷剂、浸渍的颗粒剂、辅助剂、可包衣糊剂、胶体，以及在例如聚合物物质中的胶囊剂。这样的配制的组合物可通过如对包含所述多肽的细胞培养物进行干燥、冻干、匀浆、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩这样的常规手段来制备。
[0201]
上文公开的这样的组合物可通过添加表面活性剂、惰性载体、防腐剂、润湿剂、取食刺激剂、引诱剂、包封剂、黏合剂、乳化剂、染料、uv保护剂、缓冲剂、流动剂或肥料、微量营养素供体或其他影响植物生长的制剂来获得。一种或更多种农用化学品，包括但不限于除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、落叶剂(harvest aid)和肥料，可与通常用于制剂领域的载体、表面活性剂或辅助剂或者有助于针对特定目标有害生物的产品处理和应用的其他组分组合。合适的载体和辅助剂可以是固体或液体，并对应于制剂技术中通常使用的物质，例如天然或再生的矿物物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增黏剂、黏合剂或肥料。实施方案的活性成分通常以组合物的形式施加，并且可施加于待处理的作物区域、植物或种子。例如，实施方案的组合物可施加于准备储存于粮仓或筒仓中或者在储存于粮仓或筒仓期间的谷物等。实施方案的组合物可与其他化合物同时或接连施加。施加含有至少一种由实施方案的细菌菌株产生的农药蛋白的实施方案的活性成分或实施方案的农用化学品组合物的方法包括但不限于叶面施加、种子包衣和土壤施加。施加次数和施加速率取决于相应有害生物的侵袭强度。
[0202]
在另一个实施方案中，可在配制之前对实施方案的组合物以及转化的微生物和农药蛋白进行处理以延长当施加于目标有害生物的环境时的农药活性，只要预处理对农药活性无害即可。这样的处理可通过化学和/或物理手段进行，只要该处理不有害地影响组合物的性质即可。化学试剂的实例包括但不限于卤化剂；醛，例如甲醛和戊二醛；抗感染剂，例如氯化苯甲烃铵(zephiran chloride)；醇，例如异丙醇和乙醇。
[0203]
在另一些实施方案中，在将实施方案的农药蛋白组合物施加于目标害虫的环境之前，用蛋白酶(例如胰蛋白酶)处理cry毒素多肽以激活蛋白质可能是有利的。通过丝氨酸蛋白酶激活原毒素的方法在本领域是公知的。
hubner(尺蠖(elm spanworm))；erannis tiliaria harris(椴尺蠖(linden looper))；euproctis chtysorrhoea linnaeus(棕尾蛾(browntail moth))；harrisina americana guerin-meneville(葡萄叶雕叶虫(grapeleaf skeletonizer))；hemileuca oliviae cockrell(range caterpillar)；hyphantria cunea drury(秋结网毛虫(fall webworm))；keiferia lycopersicella walsingham(番茄蛲虫(tomato pinworm))；lambdina fiscellaria fiscellaria hulst(东部铁杉尺蠖(eastern hemlock looper))；l.fiscellaria lugubrosa hulst(西部铁杉尺蠖(western hemlock looper))；leucoma salicis linnaeus(柳毒蛾(satin moth))；lymantria dispar linnaeus(舞毒蛾(gypsy moth))；manduca quinquemaculata haworth(五斑鹰蛾(five spotted hawk moth)，番茄天蛾(tomato hornworm))；m.sexta haworth(番茄天蛾、烟草天蛾(tobacco hornworm))；operophtera brumata linnaeus(冬蛾(winter moth))；paleacrita vemata peck(春尺蠖(spring cankerworm))；papilio cresphontes cramer(大黄带凤蝶(giant swallowtail)，橙色狗(orange dog))；phryganidia californica packard(加州橡木虫(california oakworm))；phyllocnistis citrella stainton(柑桔潜叶蛾(citrus leafminer))；phyllonotycter blancardella fabricius(斑纹潜叶蛾(spotted tentiform leafminer))；pieris brassicae linnaeus(大白蝶(large white butterfly))；p.rapae linnaeus(小白蝶(small white butterfly))；p.napi linnaeus(青脉白蝶(green veined white butterfly))；platyptilia carduidactyla riley(洋蓟羽蛾(artichoke plume moth))；plutella xylostella linnaeus(小菜蛾(diamondback moth))；pectinophora gossypiella saunders(棉红铃虫(pink bollworm))；pontia protodice boisduval&leconte(南部卷心菜虫(southern cabbageworm))；sabulodes aegrotata guenee(杂食尺蠖(omnivorous looper))；schizura concinna j.e.smith(红色驼峰粉螟(red humped caterpillar))；sitotroga cerealella olivier(麦蛾(angoumois grain moth))；thaumetopoea pityocampa schiffermuller(pine processionary caterpillar)；tineola bisselliella hummel(负袋夜蛾(webbing clothesmoth))；tuta absolute meyrick(番茄潜叶蛾(tomato leafminer))；yponomeuta padella linnaeus(巢蛾(ermine moth))；heliothis subflexa guenee；天幕毛虫属(malacosoma spp.)和古毒蛾属(orgyia spp.)。
[0207]
可测试害虫在早期发育阶段(例如，作为幼虫或其他未成熟形式)的实施方案组合物的农药活性。这些昆虫可在约20℃至约30℃和约30％至约70％相对湿度下在完全黑暗中饲养。饲养昆虫幼虫和进行生物测定的方法为本领域普通技术人员所公知。
[0208]
根据本发明的用于控制昆虫，特别是鳞翅目昆虫的方法可包括将本文所公开的杀虫/农药组合物施加(例如，喷施)至待保护的区域或植物到待保护的地点(区域)，包含用本发明经密码子优化的cry2ai核苷酸序列转化的宿主细胞。待保护的地点可包括例如害虫的栖息地或生长的植被或将要生长植被的区域。
[0209]
本公开内容涉及控制鳞翅目茄子害虫的方法，该方法包括通过种植用本发明cry2ai核苷酸序列转化的茄子植物或喷施含有本发明cry2ai蛋白的组合物来将本文公开的杀虫/农药组合物施加于待保护的区域或植物。本发明还涉及本发明组合物针对鳞翅目茄子害虫以使对茄子植物的损害最小化的用途。
[0210]
本公开内容还涉及用于控制鳞翅目稻害虫的方法，所述鳞翅目稻害虫特别是鳞翅目稻茎螟、稻纵卷叶螟、稻包虫、稻地老虎、稻黏虫、或稻绦虫(rice caseworm)，优选选自以下的昆虫：二化螟(chilo suppressalis)、斑禾草螟(chilo partellus)、三化螟、大螟(sesamia inferens)、稻纵卷叶螟、marasmia patnalis、稻显纹刷须野螟(marasmia exigua)、marasmia ruralis、scirpophaga innotata，该方法包括通过种植用本发明cry2ai核苷酸序列转化的稻植物或喷施含有本发明cry2ai蛋白的组合物来将本文公开的杀虫/农药组合物施加至待保护的区域或植物到待保护的区域或植物。本发明还涉及本文所公开的组合物针对鳞翅目稻害虫以使对稻植物的损害最小化的用途。
[0211]
本公开内容还涉及用于控制鳞翅目番茄害虫，特别是鳞翅目棉铃虫的方法，该方法包括通过种植用本发明cry2ai核苷酸序列转化的番茄植物或喷施含有本发明cry2ai蛋白的组合物来将本文公开的杀虫/农药组合物施加至待保护的区域或植物到待保护的区域或植物。本发明还涉及本文所公开的组合物针对鳞翅目番茄害虫以使对番茄植物的损害最小化的用途。
[0212]
本公开内容还涉及控制鳞翅目棉花害虫的方法，该方法包括通过种植用本发明cry2ai核苷酸序列转化的棉花植物或喷施含有本发明cry2ai蛋白的组合物来将本文公开的杀虫/农药组合物施加至待保护的区域或植物到待保护的区域或植物。本发明还涉及本文所公开的组合物针对鳞翅目棉花害虫以使对棉花植物的损害最小化的用途。
[0213]
为了获得cry2ai毒素蛋白(seq id no:1)，表达cry2ai蛋白的重组宿主的细胞可在合适的培养基上以常规方式生长，然后使用常规手段(例如酶降解或洗涤剂等)进行裂解。然后可通过标准技术(例如色谱法、提取、电泳等)分离和纯化毒素。
[0214]
因此，本发明提供了用于影响害虫，特别是植物害虫的组合物和方法。更具体地，本发明提供了经密码子优化的多核苷酸，其编码针对害虫的生物活性杀虫多肽，所述害虫例如但不限于鳞翅目有害生物的害虫，例如棉铃虫-棉铃虫和玉米穗虫、稻纵卷叶螟-稻纵卷叶螟以及三化螟-稻黄茎螟和棉红铃虫。
[0215]
根据本公开内容，在一个实施方案中，提供了经密码子优化的合成核苷酸序列，其编码具有如seq id no:1中所示氨基酸序列的蛋白质，其中所述核苷酸序列是：
[0216]
a.如seq id no:2中所示的，或与其互补的核苷酸序列，或者
[0217]
b.与如seq id no:2中所示核苷酸序列的从第251位至第402位和/或从第1456位至第1628位核苷酸的至少10个核苷酸特异性杂交的核苷酸序列，或与其互补的序列。
[0218]
在另一个实施方案中，提供了本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中与seq id no:2中所示核苷酸序列特异性杂交的核苷酸序列选自seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6和seq id no:7。
[0219]
在另一个实施方案中，提供了包含本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列的重组dna，其中所述核苷酸序列与异源调节元件可操作地连接。另一个实施方案涉及如本文所公开的重组dna，其中所述经密码子优化的合成核苷酸序列任选地包含选择标记基因、报道基因或其组合。与如本文所公开的重组dna相关的又一个实施方案，其中所述经密码子优化的合成核苷酸序列任选地包含编码用于靶向液泡、线粒体、叶绿体、质体或用于分泌的靶向或转运肽的dna序列。
[0220]
在另一个实施方案中，提供了用于表达目的杀虫蛋白的dna构建体，其包含5'非翻
译序列、编码包含seq id no:1的氨基酸序列的杀虫cry2ai蛋白或其杀虫部分的编码序列以及3'非翻译区，其中所述5'非翻译序列包含在植物细胞中发挥功能的启动子，所述编码序列是如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列，并且其中所述3'非翻译序列包含转录终止序列和多腺苷酸化信号。
[0221]
另一个实施方案提供了包含本公开内容的重组dna或dna构建体的质粒载体。
[0222]
另一个实施方案提供了包含本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列的宿主细胞。本公开内容的宿主细胞涵盖植物、细菌、病毒、真菌和酵母细胞。在另一个实施方案中，如所公开的宿主细胞是植物细胞、农杆菌(agrobacterium)或大肠杆菌。
[0223]
本发明的另一个实施方案提供了用于赋予植物昆虫抗性的方法，所述方法包括：
[0224]
(a)将如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列插入植物细胞中，其中所述核苷酸序列与(i)在植物细胞中发挥功能的启动子和(ii)终止子可操作地连接；
[0225]
(b)从步骤(a)的所述植物细胞获得转化的植物细胞，其中所述转化的植物细胞包含如本公开内容的所述经密码子优化的合成核苷酸序列；以及
[0226]
(c)从步骤(b)的所述转化的植物细胞产生转基因植物，其中所述转基因植物包含如本公开内容的所述经密码子优化的合成核苷酸序列。
[0227]
另一个实施方案涉及通过如本文所公开的用于赋予昆虫抗性的方法获得的转基因植物。本发明的又一个实施方案涉及包含如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列的转基因植物。本发明的另一个实施方案涉及包含经密码子优化的合成核苷酸序列的转基因植物，其中所述核苷酸序列选自seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6和seq id no:7。本公开内容的又一个实施方案涉及本文公开的转基因植物，其中所述植物选自稻、小麦、玉米、高粱、燕麦、粟、豆科作物、棉花、番茄、茄子、甘蓝、花椰菜、青花菜、芸薹属、豆类、豌豆、木豆、马铃薯、胡椒、葫芦、莴苣、甘薯芥花籽、大豆、苜蓿、花生、向日葵、红花、烟草、甘蔗、木薯、咖啡、菠萝、柑橘、可可、茶、香蕉和甜瓜。
[0228]
本公开内容的另一个实施方案涉及从本发明的转基因植物获得的组织、种子或后代，其中所述种子或后代包含如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列。本发明的又一个实施方案涉及来源于如本文所公开的组织或种子或后代的生物样品，其中所述样品包含可检测量的本发明的所述经密码子优化的合成核苷酸序列。本发明的另一个实施方案提供了来源于本公开内容中公开的转基因植物的商品产品，其中所述产品包含可检测量的如本文所公开的所述经密码子优化的合成核苷酸序列。
[0229]
本发明的另一个实施方案提供了组合物，其包含含有本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列的苏云金芽孢杆菌，所述核苷酸序列编码具有如seq id no:1中所示氨基酸序列的cry2ai蛋白。如本文所公开的组合物可任选地包含另外的杀虫剂，其与所述杀虫蛋白针对相同的害虫有毒但表现出不同的杀虫活性模式。本公开内容的组合物的杀虫剂选自芽孢杆菌(bacillus)毒素、致病杆菌(xenorhabdus)毒素、发光杆菌(photorhabdus)毒素和对抑制所述害虫中的一种或更多种必需基因具有特异性的dsrna。
[0230]
本发明的又一个实施方案提供了在作物植物中控制昆虫侵袭和提供昆虫抗性管理的方法，其中所述方法包括将所述作物植物与杀虫有效量的如上述的组合物接触。
[0231]
本发明的另一个实施方案涉及本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列、dna构建体或质粒用于产生昆虫抗性转基因植物的用途。本发明的又一个实施方案涉及如
et al.,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,second edition,1989中进行了描述。
[0242]
实施例1：设计编码cry2ai蛋白(seq id no:1)的经密码子优化的序列
[0243]
设计并合成了具有单子叶植物密码子偏倚的dna序列，以用于在转基因植物中表达具有如seq id no:1中所示氨基酸序列的cry2ai蛋白。用于单子叶植物的密码子使用表是根据从seq id no:1(ncbi genbank acv97158.1)的cry2ai蛋白序列获得的编码序列计算得出的。使用monte carlo算法(villalobos a,ness j e,gustafsson c,minshull j和govindarajan s(2006)gene designer:a synthetic biology tool for constructing artificial dnasegments；bmc bioinformatics 67:285-293)作为密码子选择的主要标准来优化dna序列。在优化dna序列时，考虑了密码子使用表的概率。罕见和不太频繁的密码子被最丰富的密码子所替代。在省略用于该氨基酸的少于总密码子使用的约10％的任何冗余密码子之后计算加权平均植物密码子集。使用下式计算每种密码子的加权平均表示：
[0244]
ci的加权平均％＝1/(％c1 ％c2 ％c3 等)
×
％c1
×
100，其中ci是所讨论的密码子，并且％c2、％c3等表示其余同义密码子的平均％使用值。
[0245]
为了获得编码seq id no:1的cry2ai蛋白的单子叶植物密码子优化的dna序列，对编码cry2ai蛋白的dna序列进行密码子替换，以使得所得dna序列具有单子叶植物优化的密码子偏倚表的总密码子组成。对序列进行了进一步改进以消除不期望的限制酶识别位点、潜在的植物内含子剪接位点、a/t或c/g残基的长运行以及可能干扰植物细胞中rna稳定性、转录或编码区翻译的其他基序。通过使用基因设计软件以6.0kcal/摩尔的截止值在电脑上对基因进行优化，用于形成稳定的mrna二级结构。进行了其他改变以并入期望的限制酶识别位点并消除长内部开放阅读框(除 1以外的框)。在起始密码子atg之前并入xbai、ncoi和bamhi的限制性识别位点，并在终止密码子之前插入限制性识别位点smai，以使得能够在原核载体中克隆经优化的基因以融合c末端蛋白标签。在终止密码子之后并入ecori、hindiii和saci的限制性识别位点。终止密码子tga用于经优化的基因。
[0246]
这些改变都是在保留近似单子叶植物偏倚的密码子组成的限制之内进行的。编码cry2ai蛋白(seq id no:1)的完整单子叶植物密码子优化的序列如seq id no:2至7中所示。单子叶植物偏倚的密码子优化的dna序列的电脑中翻译显示出与天然cry2ai蛋白(seq id no:1)具有100％同一性。单子叶植物密码子优化的dna序列(seq id no:2至7)定名为201m1、201m2、201m3、201m4、201m5和201m6。201m1至m6 dna片段(seq id no:2至7)的合成由商业供应商(genscript inc，usa)进行。通过使用本领域已知的方法将201m1dna片段克隆到puc57载体中，并定名为puc57-201m1。同样，将201m2 dna、201m3 dna、201m4 dna、201m5 dna和201m6 dna片段克隆到puc57载体中，并分别定名为puc57-201m2、puc57-201m3、puc57-201m4、puc57-201m5和puc57-201m6。
[0247]
实施例2：表达载体的构建
[0248]
用bamhi和hindiii消化实施例1的puc57-201m1载体以获得201m1dna(seq id no:2)片段(反应体积-20μl，质粒dna-8.0μl，10
×
缓冲液-2.0μl，限制酶bamhi-0.5μl，限制酶hindiii-0.5μl，蒸馏水-9.0μl)。将所有试剂混合以获得反应混合物，并在37℃下孵育30分钟，随后在2％琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳对反应混合物进行分析，并在uv照射下使用干净锋利的手术刀从琼脂糖凝胶上切下201m1 dna片段。使用凝胶洗脱试剂盒从凝胶中洗脱dna
片段。将含有dna片段的凝胶切片转移到2ml的eppendorf管中，并添加3
×
样品体积的缓冲液de-a。通过涡旋将凝胶重悬于缓冲液de-a中，并将内容物加热至75℃直到凝胶完全溶解，然后添加混合在一起的0.5
×
缓冲液de-a和de-b。通过将柱放入eppendorf管中来准备eppendorf管，并将结合混合物转移至柱。对具有柱的eppendorf管进行短暂离心。将柱放入新鲜的eppendorf管中，并添加500μl的缓冲液洗涤缓冲液-w i(qiagen试剂盒)，然后离心。弃去上清液，并沿柱壁添加700μl的洗涤缓冲液-w 2以洗掉所有残余缓冲液，然后离心。用700μl的缓冲液w 2的等分试样重复该步骤。将柱转移到新鲜的eppendorf管中，并在6000rpm下离心1分钟以去除残余缓冲液。再次将柱置于新的eppendorf管中，并在膜中心处添加40μl的洗脱缓冲液。将具有洗脱缓冲液的柱在室温下静置1分钟，并将管在12000rpm下离心1分钟。洗脱的201m1 dna片段在-20℃下储存直到进一步使用。
[0249]
将由此获得的分离和经纯化的201m1 dna片段与线性化的pet32a载体连接。使用t4dna连接酶进行连接(反应体积-30μl，10
×
连接缓冲液-3.0μl，载体dna-5.0μl，插入dna-15.0μl，t4 dna连接酶-1.0μl，蒸馏水-6.0μl)。将试剂充分混合，并将所得反应混合物在16℃下孵育2小时。随后，用包含携带201m1 dna的pet32a载体的连接混合物通过将10μl连接混合物添加至100μl的bl21 de3感受态细胞来转化大肠杆菌bl21(de3)菌株的感受态细胞。将由此获得的细胞混合物置于冰上30分钟，并在42℃下在水浴中孵育60秒进行热休克，并将其放回冰上5至10分钟。随后，向混合物添加1ml lb肉汤，并在37℃下在培养摇床中以200rpm进一步孵育1小时。将细胞混合物铺展在lb琼脂加50μg/ml羧苄青霉素上，并在37℃下孵育过夜。通过限制性消化分析确定阳性克隆。由此获得的表达载体定名为pet32a-201m1。
[0250]
类似地构建了携带其他单子叶植物密码子优化的dna序列(如seq id no:3至7中所示)的表达载体，并将其定名为pet32a-201m2、pet32a-201m3、pet32a-201m4、pet32a-201m5和pet32a-201m6。
[0251]
实施例3：由201m1(seq id no:2)编码的cry2ai蛋白的表达
[0252]
使定名为pet32a-201m1的克隆到pet32a中的201m1 dna(seq id no:2)在大肠杆菌bl21d3中表达。在约od nm＝0.5至1.0的细胞密度下，用1mm iptg诱导表达。诱导之后，将大肠杆菌细胞在摇床中在16℃下孵育24至40小时以用于蛋白质产生。cry2ai蛋白(seq id no:1)在细胞中以可溶性形式表达(未分泌)。随后，将培养物转移至离心管，并以10000rpm离心5分钟。弃去上清液，并将10ml细胞用溶菌酶消化并在室温下孵育1小时。将样品以10000rpm离心5分钟，并弃去上清液。将沉淀悬浮在无菌蒸馏水中，并以10000rpm离心10分钟。重复该步骤两次，并将沉淀在-20℃下储存。在10％sds-page上分析含有来自诱导的重组菌株的蛋白质的沉淀。
[0253]
类似地，将如seq id no:3至7中所示的dna序列克隆到pet32a中，并使其在大肠杆菌bl21d3中表达。
[0254]
实施例4：包含编码cry2ai蛋白(seq id no:1)的201m1 dna(seq id no:2)的植物转化载体的构建
[0255]
将携带201m1 dna(seq id no:2)的puc57-201m1载体用限制酶消化以释放201m1 dna片段(反应体积
–
20μl，质粒dna-8.0μl，10
×
缓冲液-2.0μl，限制酶ecorv-0.5μl，蒸馏水-9.5μl)。混合所有试剂，并将混合物在37℃下孵育30分钟。通过凝胶电泳分析限制性消
化之后获得的产物并进一步纯化。
[0256]
ti质粒pgreen0029载体通过使用ecorv酶的限制性消化制备(反应体积
–
20μl，质粒dna-8.0μl，10
×
缓冲液-2.0μl，限制酶ecorv-0.5μl，蒸馏水-9.5μl)。混合所有试剂，并将混合物在37℃下孵育30分钟。通过凝胶电泳分析限制性消化之后获得的产物。
[0257]
将经纯化的201m1 dna片段(seq id no:2)与线性化的pgreen0029载体连接。使用t4dna连接酶进行连接(反应体积-30μl，10
×
连接缓冲液-3.0μl，载体dna-5.0μl，插入dna-15.0μl，t4 dna连接酶-1.0μl，蒸馏水-6.0μl)。将试剂充分混合，并将所得反应混合物在16℃下孵育2小时。随后，用包含携带201m1 dna(seq id no:2)的pgreen0029载体的连接混合物通过将10μl连接混合物添加至100μl的bl21 de3感受态细胞来转化大肠杆菌bl21(de3)菌株的感受态细胞。将由此获得的细胞混合物置于冰上30分钟，并在42℃下在水浴中孵育60秒进行热休克，并将细胞混合物放回冰上5至10分钟。随后，向混合物添加1ml lb肉汤，并在37℃下在培养摇床中以200rpm进一步孵育1小时。将细胞悬液(100μl)均匀铺展在含有50μg/ml羧苄青霉素的lb琼脂培养基上。将板在37℃下孵育过夜。通过限制性消化分析确定阳性克隆。由此获得的重组载体定名为pgreen0029 camv35s-201m1。
[0258]
因此，重组质粒pgreen0029-camv35s-201m1含有在35scamv启动子的转录控制下的植物优化的201m1 dna序列(seq id no:2)。此外，pgreen0029-camv35s-201m1含有nptii基因，其是在nos启动子的转录控制下的植物选择标记基因。pgreen0029-camv35s-201m1 t区的组件的物理排列如下所示：
[0259]
rb》35scamv:201m1 cds:camv polya》nos启动子:nptii cds:nos poly a》lb
[0260]
类似地，将如seq id no:3至7中所示的dna序列克隆到ti质粒pgreen0029中，并将由此获得的重组载体定名为pgreen0029-camv35s-201m2、pgreen0029-camv35s-201m3、pgreen0029-camv35s-201m4、pgreen0029-camv35s-201m5和pgreen0029-camv35s-201m6。在t区中携带所述dna序列(seq id no:3至7)的pgreen0029-camv35s组件的物理排列如下所示：
[0261]
rb》35scamv:201m2 cds:camv polya》nos启动子:nptii cds:nos poly a》lb
[0262]
rb》35scamv:201m3 cds:camv polya》nos启动子:nptii cds:nos poly a》lb
[0263]
rb》35scamv:201m4 cds:camv polya》nos启动子:nptii cds:nos poly a》lb
[0264]
rb》35scamv:201m5 cds:camv polya》nos启动子:nptii cds:nos poly a》lb
[0265]
rb》35scamv:201m6 cds:camv polya》nos启动子:nptii cds:nos poly a》lb
[0266]
此外，还将如seq id no:2至7中所示的dna序列克隆到ti质粒pgreen0179中，并且将由此获得的重组载体定名为pgreen0179-camv35s-201m1、pgreen0179-camv35s-201m2、pgreen0179-camv35s-201m3、pgreen0179-camv35s-201m4、pgreen0179-camv35s-201m5和pgreen0179-camv35s-201m6。因此，重组质粒pgreen0179-camv35s-201m1含有在35scamv启动子的转录控制下的植物优化的201m1 dna序列(seq id no:2)。此外，pgreen0029-camv35s-201m1含有hptii基因，其是在camv35s启动子的转录控制下的植物选择标记基因。在t区中携带dna序列的pgreen0179-camv35s组件的物理排列如下所示：
[0267]
rb》35scamv启动子:201m1:camv polya》35scamv启动子:hptii:camvpolya》lb
[0268]
rb》35scamv启动子:201m2:camv polya》35scamv启动子:hptii:camvpolya》lb
[0269]
rb》35scamv启动子:201m3:camv polya》35scamv启动子:hptii:camvpolya》lb
[0270]
rb》35scamv启动子:201m4:camv polya》35scamv启动子:hptii:camvpolya》lb
[0271]
rb》35scamv启动子:201m5:camv polya》35scamv启动子:hptii:camvpolya》lb
[0272]
rb》35scamv启动子:201m6:camv polya》35scamv启动子:hptii:camvpolya》lb
[0273]
用重组载体pgreen0179-camv35s-201m1转化根癌农杆菌
[0274]
用携带如seq id no:2中所示dna序列的重组pgreen0179-camv35s-201m1质粒转化根癌农杆菌菌株lba440。将200ng的pgreen0179-camv35s-201m1质粒dna添加至一份100μl的根癌农杆菌菌株lba440感受态细胞。将混合物在冰上孵育30分钟，并转移至液氮20分钟，然后在室温下解冻。然后将农杆菌细胞转移至1ml lb肉汤，并在水浴摇床中在28℃下以200rpm孵育24小时。将细胞悬液均匀铺展在含有50μg/ml利福平、30μg/ml卡那霉素和5μg/ml四环素的lb琼脂培养基上。将板在28℃下孵育过夜。用质粒提取和限制性消化法对转化的农杆菌细胞进行分析，并选择阳性的根癌农杆菌菌落并储存用于进一步使用。
[0275]
实施例5(a)使用pgreen0179-camv35s-201m1构建体的农杆菌介导的稻转化
[0276]
使用包含如图1中t-dna的重组载体pgreen0179-camv35s-201m1进行农杆菌介导的稻转化。在印度coimbatore的tamil nadu agricultural大学植物分子生物学和生物技术中心植物生物技术系进行了将稻未成熟胚用作外植体进行转化(hiei,y.和t.komari,2008,agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.nat.protocols.,3:824-834)。稻转化的实验细节在下文描述。
[0277]
稻转化领域的技术人员将理解，当使用其他植物可表达的选择标记基因时，其他方法可用于稻转化和用于选择转化的植物。
[0278]
植物材料
[0279]
在转化实验中，使用了来自印度coimbatore的tamil nadu agricultural大学(tnau)植物育种和遗传中心稻系的本地优质稻品种asd16。tnau已获取该植物材料。
[0280]
用于转化的未成熟稻胚外植体的制备
[0281]
从tnau稻育种站授粉之后12至14天收集未成熟稻种子用于转化试验。将未成熟种子去皮，并用70％乙醇处理一分钟，然后用1.5％次氯酸钠溶液(含有一滴吐温-20)处理，并随后用无菌水洗涤。使用无菌镊子在显微镜(zeiss，germany或leica，switzerland)下从种子中无菌切除未成熟胚，并在0.8％(w/v)琼脂板上培养。使用1.3mm至1.8mm尺寸的未成熟胚进行转化。
[0282]
未成熟胚的预处理
[0283]
将未成熟胚在水浴中在43℃下孵育30分钟，立即在冰浴上冷却1分钟，并在25℃下以1100rpm离心10分钟。经预处理的胚用作进一步转化实验的外植体。
[0284]
用根癌农杆菌预处理和共培养外植体
[0285]
在共培养之前三天，将携带如实施例4中所述质粒pgreen0179-camv35s-201m1的根癌农杆菌lba4404接种到含有利福平(20mg/l)、卡那霉素(100mg/l)、链霉素(50mg/l)和四环素(5mg/l)的5ml yep肉汤中，并在摇床中在28℃下以200rpm孵育2至3天。在转化未成熟胚的时间时，将一环的根癌农杆菌培养物悬浮在1.0ml的aa感染培养基(表1；ph 5.2)中，密度为1
×
109菌落形成单位(cfu)/ml，在660nm处的o.d为1.0。
[0286]
·
yep培养基组成：
[0287]
酵母提取物：10.0g
[0288]
蛋白胨：10.0g
[0289]
nacl：5.0g
[0290]
蒸馏水：至1000.0ml
[0291]
琼脂：18.0g
[0292]
ph：6.8
[0293]
对于yep肉汤，组成相同，不含琼脂
[0294]
然后将经预处理的未成熟胚转移至nb-as培养基(表2)，盾片朝上。将5μl的如上所述的根癌农杆菌悬浮培养物滴到每个未成熟胚上，并在25℃下孵育15。然后将胚转移至含有nb-as培养基的培养皿，盾片朝上，并在25℃下在黑暗中孵育7天。
[0295]
愈伤组织诱导和选择
[0296]
在共培养7天之后，由未成熟胚形成愈伤组织。将由此获得的愈伤组织转移至ccmc培养基(表3)中，并在31℃下在连续光照(5,000lx)下孵育5天。5天之后，将愈伤组织切成4片(取决于愈伤组织的尺寸)，并将其转移到ccmc培养基上，并在31℃下在连续光照(5,000lx)下孵育10天。将愈伤组织进一步转移到含有潮霉素(表4)的选择培养基ccmch50上，并在31℃下在连续光照(5,000lx)下孵育10天，并在ccmch50培养基上定期选择。
[0297]
在ccmch50培养基上进行两轮选择之后，将对潮霉素具有抗性的愈伤组织转移到预再生培养基nbprch40(表5)上，并在31℃下在连续光照(5,000lx)下孵育7天。
[0298]
将黄白色增殖良好的愈伤组织进一步转移到再生培养基rnmh30(表6)上，并在31℃下在连续光照(5,000lx)下孵育14天以获得芽。将由此获得的芽转移至含有30mg/l潮霉素b的生根培养基1/2ms(murashige,t；skoog,f,1962,"arevised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures".physiologia plantarum.15(3):473
–
497)，并在31℃下在连续光照(5,000lx)下孵育14天以进一步发育。然后将生长良好的再生稻植物转移至包含含有30mg/l潮霉素b的生根培养基的培养瓶，并将根发育良好的稻植物转移至土壤，并在温室中维持。因此，从潮霉素抗性愈伤组织中获得了八株t0推定(putative)转基因稻植物(图2)，每个事件的再生植物数量不同。
[0299]
实施例5(b)用201m1 dna序列(seq id no:2)转化的推定的转基因稻植物的分子分析
[0300]
(i)基因组dna分离
[0301]
从获自实施例5(a)的推定的转基因稻植物和品种asd16的对照非转基因植物的叶组织提取总基因组dna。从推定的转基因稻植物和非转基因稻植物收集叶，并使用qiagen tissuelyser ii(retsch)使用300μl提取缓冲液(1m tris-hcl，ph 7.5，1m nacl，200mm edta和10％sds)匀浆，并以12000rpm离心10分钟。将上清液转移至无菌微量离心管。向上清液添加氯仿-异戊醇(24:1)，并以12000rpm离心10分钟。将水性层转移至微量离心管。向其添加等体积的冰冷异丙醇，并在-20℃下保持20分钟。然后弃去上清液，并向沉淀添加300μl的乙醇。以10000rpm离心5分钟之后，弃去上清液，并将dna沉淀风干15分钟，并随后溶解在40μl的0.1
×
te缓冲液(tris-ph 8.0:10.0mm和edta-ph 8.0:1.0mm)中。使用nanodrop分光光度计(thermo scientific，usa)通过在260nm处测量od来评估基因组dna的质量和数量。此外，通过使用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳来评估dna的完整性。
[0302]
pcr分析
[0303]
对推定的转基因稻植物和非转基因对照稻植物的基因组dna(100ng)进行聚合酶链反应(pcr)，以使用如seq id no:8和seq id no:9中所示引物对合成的cry2ai-201m1 dna进行分析以及使用如seq id no:12和seq id no:13中所示引物对hptii基因进行分析。
[0304]
pcr条件
[0305]
94℃进行5分钟：1个循环
[0306]
94℃进行45秒
[0307]
58
°
至62℃进行45秒30个循环
[0308]
72℃进行45秒
[0309]
72℃进行10分钟：1个循环
[0310]
发现所有八株推定的转基因稻植物对具有如seq id no:2中所示核苷酸序列的cry2ai-201m1 dna和hptii基因均呈阳性。
[0311]
(ii)通过elisa对推定的转基因稻(t0)系进行生化分析
[0312]
使用envirologix quantiplate试剂盒(envirologix inc.，usa)根据制造商的说明进行夹心elisa，以定量估计推定的转基因pcr阳性稻植物中的cry2ai蛋白(seq id no:1)。与试剂盒一起提供的阳性和阴性对照用作参考。本实验采用来自推定的转基因稻植物主分蘖的第二叶。将约30mg的叶组织在500μl的提取缓冲液中匀浆，并在4℃下以6,000rpm离心7分钟，并使用上清液进行测定。将上清液(100μl)装载到抗cry2ai蛋白抗体预包被板中。将板用石蜡膜覆盖，并在室温(24℃
±
2)下孵育15分钟。将酶缀合物(100μl)添加到每个孔中。一小时之后，用1
×
洗涤缓冲液彻底洗涤孔。将底物(100μl)添加到每个孔中并孵育30分钟。通过添加终止溶液(0.1n盐酸)终止反应。使用阴性对照作为空白，在450nm处读取板的光密度(o.d.)。每个样品重复两次，并且每个孔被视为重复。
[0313]
绘制不同浓度校准物(可通过试剂盒获得)的光密度之间的图。cry2ai蛋白(seq id no:1)的浓度通过绘制其o.d.值相对于图上相应的浓度水平来确定。如下所述计算浓度，
[0314][0315]
样品中存在的cry2ai蛋白(seq id no:1)量表示为微克/克新鲜叶组织。发现通过cry2ai定量elisa试剂盒筛选的所有八株pcr阳性转基因稻植物(t0)在转基因稻植物的幼龄转基因稻叶组织中cry2ai蛋白(seq id no:1)的表达呈阳性。发现在这些转基因稻植物中cry2ai蛋白(seq id no:1)在营养阶段期间的表达范围在0.083至0.766μg/g新鲜叶组织之间(表a)。
[0316]
表a：cry2ai蛋白(seq id no:1)在t0转基因稻植物中的表达
[0317][0318][0319]
*两次重复的平均值
[0320]
(iii)southern杂交
[0321]
选择七株elisa阳性稻植物(os-1至os-7)用于southern杂交。用ncoi或xbai或bamhi限制酶消化elisa阳性t0转基因稻植物的基因组dna(每种5μg)，并使用[α-32p]-dctp标记的1077bp cry2ai探针进行southern印迹杂交。
[0322]
在37℃下将pcr和elisa阳性转基因稻植物和非转基因稻植物的基因组dna用ncoi限制酶消化16小时。质粒dnapgreen0179-camv35s-201m1用作阳性对照。将经消化的基因组dna样品和质粒dna在0.8％琼脂糖凝胶中以20v在1
×
tae缓冲液中溶解过夜，在uv透照器下溴化乙锭染色后显现，并将其记录在凝胶记录系统(syngene)中。
[0323]
通过将凝胶浸入两体积的变性溶液中30分钟并轻轻搅拌使限制性消化和电泳分离的基因组dna变性。将凝胶浸入两体积的中和溶液30分钟中并轻轻搅拌以中和凝胶。将凝胶在无菌去离子水中进行短暂洗涤，并按照标准方案在20
×
ssc缓冲液中通过向上毛细管转移将dna转移至带正电的尼龙膜(sigma)，持续16小时。在基因组dna完全转移之后，将尼龙膜在2
×
ssc缓冲液中短暂洗涤，并风干5分钟。通过将膜在1100μj下在uv交联剂(uv1800stratagene，ca，usa)中暴露1分钟来交联dna。将交联的膜密封在塑料袋中，并在4℃下保存直到用于southern印迹杂交。
[0324]
·
变性溶液：
[0325]
nacl：1m
[0326]
naoh：0.5n
[0327]
·
中和溶液：
[0328]
nacl：1.5m
[0329]
tris：0.5m
[0330]
·
20
×
ssc：
[0331]
nacl：3.0m
[0332]
柠檬酸钠：0.3m
[0333]
ph：7.0，用浓hcl
[0334]
20
×
ssc溶液可按以下进行稀释：
[0335]
最终ssc浓度20
×
ssc溶液蒸馏水或去离子水3
×
ssc30ml170ml2
×
ssc20ml180ml1
×
ssc10ml190ml0.5
×
ssc5ml195ml
[0336]
探针的制备
[0337]
将从双元载体扩增并使用凝胶提取miniprep试剂盒(bio basic inc.,canada)纯化的约100ng的1077bp的cry2ai-201m1 dna片段用[α-32p]-dctp进行放射性标记，用作标记探针。将4μl模板dna(cry2ai-201m1dna)与10μl的随机引物(decalabel dna标记试剂盒，thermo fisher scientific inc.usa)在微量离心管中混合。用无菌蒸馏水使体积达到40μl，并通过在沸水浴上加热5分钟使其变性，并在冰上冷却。向变性dna添加5μl含有datp、dgtp、dttp的标记混合物，5μl的[α-32p]-dctp(50μci)以及1μl的dna聚合酶i的klenow片段，并在水浴中在37℃下孵育10分钟。通过添加1μl的0.5m edta终止反应，并在沸水浴中孵育4分钟并转移到冰上4至5分钟。
[0338]
用探针进行预杂交和杂交
[0339]
将如上所述的dna交联的膜轻轻放入含有30ml杂交缓冲溶液的杂交瓶中。将瓶紧闭，并将其在烘箱中在65℃下放置45分钟至1小时，以进行预杂交处理。
[0340]
从瓶中倒掉杂交缓冲液，并用30ml含有变性的[α-32p]-dctp标记的dna探针的杂交溶液(维持在65℃下)替换。将装有杂交溶液的瓶紧闭，并在烘箱中在65℃下放置16小时。
[0341]
·
杂交溶液：
[0342]
na2hpo4，ph 7.2：0.5m
[0343]
sds：7％(w/v)
[0344]
edta，ph 7.2：1mm
[0345]
从瓶中倒掉杂交缓冲液。添加关于wash i的溶液，并将瓶置于缓慢旋转平台上的65℃下烘箱中10分钟。10分钟之后，用30ml的wash ii溶液替换wash i溶液，并在轻轻搅拌下在65℃下孵育5至10分钟。然后倒掉wash ii溶液，并使用gregor-muller计数器检查膜中的放射性计数。根据计数，向瓶中添加30ml wash iii，并在轻轻搅拌下在65℃下孵育30秒至1分钟。随后，去除wash iii溶液，并将膜在whatman 1号滤纸上在室温下干燥5至10分钟，并将其在暗室中在信号增强器屏(hyper来自amersham,usa)中在-80℃下暴露于x射线胶片(kodak xar)2天。
[0346]
暴露2天之后，在暗室中取出x射线胶片，并浸入显影液中1分钟，然后浸入水中1分钟。最后，将x射线胶片浸入定影液中2分钟，然后在水中冲洗1至2分钟，然后风干。
[0347]
·
洗涤溶液
[0348]
wash i：3
×
ssc 0.1％sds
[0349]
wash ii：0.5
×
ssc 0.1％sds
[0350]
wash iii：0.1
×
ssc 0.1％sds
[0351]
·
显影液：
[0352]
将13.2g的pack a内容物溶解在800ml蒸馏水中，在完全溶解之后，添加89g的pack b组分并通过缓慢搅拌溶解。在完全溶解之后，使体积达到1000ml，并储存在琥珀色瓶中。
[0353]
·
定影液：
[0354]
通过缓慢搅拌将268g定影剂溶解在800ml蒸馏水中，在完全溶解之后，使体积达到1000ml，通过country滤纸过滤并储存在琥珀色瓶中。
[0355]
所有七个elisa阳性转基因稻事件均显示出不同大小的杂交信号，表明转基因整合到稻基因组中。转基因稻植物os-6显示出cry2ai基因在单个基因座的整合。在阳性对照中也看到了杂交信号，而非转基因稻对照(asd16)植物没有显示出任何杂交信号。
[0356]
(iv)cry2ai转基因稻(t2)系os6的产生进展
[0357]
将转基因稻植物os-6的30个t1种子播种在托盘(pro-tray)中。23个种子萌发，并将15日龄的幼苗转移至盆并在温室中建立。通过定量elisa发现转基因稻植物os 6的23个t1后代中有20个表达cry2ai基因。在转基因稻植物-os 6的t1植物中表达的cry2a蛋白(seq id no:1)的浓度范围对于55das为0.192至0.588μg/g新鲜叶组织，并且对于84das为0.082至0.387μg/g新鲜叶组织。使用ncoi酶对转基因稻植物os6的六株t1植物进行的southern杂交分析揭示，cry2aim1(seq id no:2)的单基因座整合与t0转基因稻植物的相似。
[0358]
播种来自转基因t1稻植物即os 6至8和os 6至20的五十(50)个种子，以获得t2转基因稻植物。使用聚合酶链反应(pcr)筛选46株来自os 6-8和37株来自os 6-20的总共83株t2植物中是否存在cry2aim1dna(seq id no:2)。pcr揭示在所有83株转基因t2稻植物中都存在所述dna。代表性的十株t2植物的定量elisa结果显示，在77播种后天数(days after sowing，das)cry2ai蛋白(seq id no:2)的浓度为0.433至0.857μg/g新鲜叶组织(表b)。
[0359]
表b：t2稻植物中cry2ai蛋白的表达和杀虫活性
[0360]
[0361][0362]
实施例5(c)昆虫生物测定
[0363]
针对稻黄茎螟的分离茎位生物测定
[0364]
从稻田(稻田育种站，tnau)直接收集稻黄茎螟(scirpophaga incertulas)的卵块，并在实验室中在25℃
±
1、60％相对湿度下孵育以用于孵化。或者，从田间收集稻黄茎螟成虫，并将其释放到装有30日龄易感品种tn1稻幼苗的昆虫笼中用于产卵。然后从笼中收集产在叶上的卵，并在实验室中通过将带有卵的叶在25℃
±
1、60％的相对湿度下保持在微量离心管上来孵育以用于孵化。对从卵块孵化出的新生昆虫进行昆虫生物测定。
[0365]
将来自elisa阳性转基因稻植物的茎切成六片(约5cm长)，并将每个假茎位放在单独的塑料培养皿中的湿滤纸上，并在每个假茎上释放出五个稻黄茎螟新生幼虫(chakraborty et al.,2016)。使用从非转基因稻asd16收集的假茎维持对照。用薄膜覆盖培养皿以防止幼虫从培养皿中逃逸，并将培养皿保持在25℃
±
1、60％的相对湿度下。6天之后，使用细刀片轻轻切开假茎位，并评价转基因和对照植物的幼虫死亡率。使用稻黄茎螟新生幼虫对t2稻植物的进行的分离茎位生物测定显示，幼虫死亡率范围在80％和85％之间。对于对照植物，没有幼虫死亡。在六天的期间之后，对照中存活的幼虫消耗了茎组织的大部分内部部分并在茎位上形成了钻孔，其中含有大量的虫粪(图5)。
[0366]
针对稻黏虫的生物测定
[0367]
从稻田(稻田育种站，tnau)直接收集稻黏虫(灰翅夜蛾(spodoptera mauritia))的卵块，并在实验室中在25℃
±
1、60％相对湿度下孵育以用于孵化。对从卵块孵化出的新生昆虫进行昆虫生物测定。
[0368]
使用elisa阳性转基因稻植物和相应的对照系的叶位对稻黏虫进行了生物测定，并进行了后续分析。
[0369]
使用稻黏虫新生幼虫进行的分离叶位生物测定显示了t2稻植物中的幼虫死亡率。对于对照植物，没有幼虫死亡，并且存活的幼虫在六天的期间内消耗了大部分叶组织(图6)。
[0370]
使用新生黏虫(灰翅夜蛾)进行的昆虫生物测定研究揭示，在十株受试t2植物中有八株中的死亡率为100％，并且在另外两株植物中的死亡率为90％和95％(表b)。
[0371]
实施例6(a)：农杆菌介导的番茄转化
[0372]
使用包含如图3中的t-dna构建体的重组载体pgreen0029-camv35s-201m1进行农
杆菌介导的稻转化。使用番茄的子叶外植体作为外植体用于转化。
[0373]
农杆菌介导的番茄转化的使用在印度coimbatore的tamil nadu agricultural大学植物分子生物学和生物技术中心植物生物技术系进行。番茄转化的实验细节在下文描述。
[0374]
番茄转化领域的技术人员将理解，当使用其他植物可表达的选择标记基因时，其他方法可用于番茄转化和用于选择转化的植物。
[0375]
植物资源
[0376]
番茄种子cv.pkm1从印度coimbatore的园艺学院和研究所(tamil nadu agricultural大学(tnau)，pn pudur，coimbatore，tamil nadu-641003，印度)获得。番茄种子已由tnau植物分子生物学和生物技术中心植物生物技术系获取。
[0377]
体外种子萌发和预培养
[0378]
将番茄种子cv.pkm1用无菌蒸馏水洗涤3次，用70％乙醇处理5分钟，并用含吐温20的4％次氯酸钠溶液处理5至7分钟。将种子用无菌蒸馏水冲洗进一步洗涤，然后在无菌纸巾上风干。使无菌种子在半强度ms培养基(如上所述)上在黑暗下萌发8至10天，然后在植物生长室中使用冷白色荧光管灯(110至130nm/m2/s强度)进行16小时的光周期和在25℃下8小时黑暗的循环。
[0379]
从体外生长的8至10日龄幼苗中切下子叶外植体，并在包含含有玉米素(1.0mg/l)的改良ms培养基的预培养基上培养两天，然后共培养。
[0380]
·
改良ms培养基组成/l
[0381]
改良ms培养基粉(pt025-himedia，mumbai)：4.2g
[0382]
蔗糖：30.0g
[0383]
琼脂：8.0g
[0384]
蒸馏水：1000ml
[0385]
ph：5.8
[0386]
共培养、选择和植株再生
[0387]
两天之后，使来自预培养基的外植体用含有质粒pgreen0029-camv35s-201m1的根癌农杆菌lba4404的悬浮培养物感染10至12分钟。通过用无菌滤纸印迹干燥去除过量的悬浮培养物，并转移至包含改良ms培养基 玉米素(1.0mg/l) 乙酰丁香酮(100μm)的共培养培养基中。在黑暗中在26℃下共培养48小时之后，将外植体用无菌蒸馏水和含有250mg/l的头孢噻肟的水性溶液洗涤，然后用无菌蒸馏水洗涤2次。将共培养的外植体在无菌滤纸上进行印迹干燥，并在包含改良ms培养基 玉米素(1.0mg/l) 卡那霉素(50mg/l) 头孢噻肟(250mg/l)的选择培养基上培养。将外植体在相同的培养基上以15至20天的间隔传代培养三次。将获得的发育良好的芽转移至含有半强度的1.0ms iba(1mg/l) 卡那霉素(30mg/l)的生根培养基(图4)。
[0388]
在大量生根(15至20天)之后，将小植株从组织培养瓶中小心地取出，并在含有硬化混合物(红土:黑土:蚯蚓粪，比例为1:1:1)的小纸杯中硬化，在25
±
2℃下保持7至8天，然后转移至温室中。
[0389]
实施例6(b)：推定的转基因番茄植物的分子和生化分析
[0390]
通过pcr分析筛选推定的转基因番茄植物是否存在cry2ai dna201m1(seq id no:
2)片段，并使用elisa分析蛋白质表达。
[0391]
番茄基因组dna的分离及pcr分析
[0392]
从推定的番茄转基因植物和未转化番茄植物(作为阴性对照)的叶中提取基因组dna。按照如上所述的过程进行dna分离。
[0393]
使用如seq id no:8和seq id no:9中所示的引物，对分离的基因组dna进行如上所述的pcr，以确认cry2ai dna片段(201m1)的存在。29株推定的转基因番茄植物(t0)中的23株被证实对于cry2ai dna(201m1)片段的存在呈阳性。
[0394]
使用用于扩增nptii基因(选择标记基因卡那霉素抗性)的如seq id no:10和seq id no:11中所示的引物进行pcr分析，以检查推定的番茄转化体(t0)中nptii基因的存在。分析显示了nptii基因的扩增。
[0395]
通过定量elisa和southern分析筛选番茄t0转基因植物
[0396]
发现23株pcr阳性的番茄植物中的17株在elisa(使用envirologix cry2a试剂盒)中呈阳性，并且营养阶段期间cry2a蛋白的浓度范围在0.006至0.159μg/g新鲜叶组织之间。
[0397]
使用用xbai酶消化的dna对五个番茄elisa阳性事件进行了southern杂交分析。southern结果揭示了t0植物中转基因的一到两个基因座整合，并且事件sl-34显示了cry2ai基因在单基因座中整合。
[0398]
cry2ai转基因番茄事件sl-34的产生进展
[0399]
将来自番茄事件sl-34的单个果实的所有18个种子置于半强度ms培养基上用于萌发。转移12日龄的幼苗用于硬化。从萌发的16株幼苗中，在温室中建立了12个t1后代，并通过pcr进行了筛选。在pcr中发现12个t1后代中有11个阳性，并且通过elisa发现所有11个后代均表达cry2ai基因。对于82das，11株t1植物中表达的cry2ai蛋白的浓度范围在0.320至0.695μg/g新鲜叶组织之间(表c)。对5株t1植物的southern杂交分析揭示，cry2ai基因的单基因座整合与t0植物的相似。
[0400]
表c.番茄事件sl-34的t1后代中cry2ai蛋白的表达和杀虫活性
[0401][0402]
在温室中从t1植物sl-34-11的单个果实的所有19个种子建立14个t2后代。通过elisa进行定量，发现所有14个t2后代均表达cry2ai基因。在t2转基因植物中表达的cry2ai蛋白的浓度范围对于80das在0.540至0.783μg/g新鲜叶组织，并且对于104das在0.287至0.547μg/g新鲜叶组织。
[0403]
在温室中从t2植物sl-34-11-1的一个果实的所有33个种子建立26株植物。在温室中从同一植物(sl-34-11-1)的另一个果实的所有42个种子建立37株幼苗。从同一t2植物的两个果实的所有75个种子总共建立了63个t3后代。在通过pcr和定性elisa筛选中，发现所有63株t3植物均呈阳性。这表明t2植物sl-34-11-1具有纯合子性质。在37株t3转基因植物中，通过定量elisa估计cry2ai蛋白的浓度，并且对于42das，浓度范围为0.329至0.881μg/g新鲜叶组织。在119和128das期间，发现四个t3后代的未成熟和成熟的果实中cry2a蛋白的浓度为约0.118至0.330μg/g新鲜果实组织。
[0404]
实施例7：昆虫生物测定
[0405]
cry2ai转基因番茄植物针对棉铃虫的昆虫生物测定
[0406]
对经elisa证实存在cry2ai蛋白的番茄转化体进行生物测定，以评估其针对棉铃虫的抗性。在实验室条件下进行了叶盘生物测定，以确定cry2a转基因番茄植物的昆虫抗性程度。来自转基因植物和对照(未转化)番茄植物顶部的第二叶在生殖期期间被切下，并用于叶盘生物测定。将叶盘放在内衬有湿滤纸的无菌培养皿上。使用细骆驼毛刷将棉铃虫的一个新生幼虫释放到覆盖在滤纸上的每个叶位上。在昆虫释放之后，将板用klinfilm包裹并置于黑暗条件下。每个处理重复两次，每次重复10个板。保持26至28℃和60％相对湿度的实验条件。在48小时之后以24小时间隔持续6天记录幼虫死亡率和叶面积损伤。
[0407]
生物测定结果显示，在12株elisa阳性t0植物中，有5株的棉铃虫死亡率为100％。使用棉铃虫新生幼虫对cry2ai转基因番茄事件sl-34的t1、t2和t3后代的叶盘进行的昆虫生物测定也显示，所有受试转基因植物的死亡率均为100％(图7)。对照植物的叶盘中没有死亡。
[0408]
尽管出于清楚理解的目的，已经通过举例说明和实例的方式详细地描述了前述发明，但是显然可在本公开内容的范围内进行某些变化和修改。
[0409]
[0410][0411]
ph至5.2，并使用0.22mm乙酸纤维素过滤器进行灭菌
[0412]
[0413][0414]
分别准备10
×
n6主盐、100
×
feedta、100
×
b5次盐、100
×
维生素、100mg l-1 2,4-d、100mg l-1 naa、100mg l-1 6ba，并将所需量或以上储备溶液与蔗糖、葡萄糖、脯氨酸和维生素测定酪蛋白氨基酸一起混合，在将ph调节至5.2之后添加所需量的琼脂糖并灭菌，灭菌之后在无菌条件下从储液中添加所需量的乙酰丁香酮。
[0415]
[0416][0417]
分别准备10
×
cc主盐、100
×
feedta、100
×
cc次盐、100
×
cc维生素、100mg l-1 2,4-d、100mg l
1 naa、100mg l-1 6ba、250g l1头孢噻肟并将所需量或以上储备溶液与麦芽糖、甘露糖醇、脯氨酸和维生素测定酪蛋白氨基酸混合。在将ph调节至5.8之后添加所需量
的结冷胶并灭菌。灭菌之后在无菌条件下从储液中添加所需量的头孢噻肟。
[0418]
[0419][0420]
分别准备10
×
cc主盐、100
×
feedta、100
×
cc次盐、100
×
cc维生素、100mg l-1 2,4-d、100mg l-1
naa、100mg l-1 6ba、50g l-1
潮霉素b并将所需量或以上储备溶液与麦芽糖、甘露糖醇、脯氨酸和维生素测定酪蛋白氨基酸混合。在将ph调节至5.8之后添加所需量的琼脂糖并灭菌。灭菌之后从储液中添加所需量的50g l-1
潮霉素b。
[0421]
[0422][0423]
分别准备10
×
n6主盐、100
×
feedta、100
×
b5次盐、100
×
维生素、100mg l-1 2,4-d、100mg l-1
naa、100mg l-1 6ba、30g l-1
谷氨酰胺、250g l-1
头孢噻肟、50g l-1
潮霉素b并将所需量或以上储液与麦芽糖、脯氨酸和维生素测定酪蛋白氨基酸混合，在将ph调节至5.8之
后添加所需量的琼脂糖并灭菌，灭菌之后在无菌条件下从储液中添加所需量的谷氨酰胺、头孢噻肟和潮霉素b。
[0424]
[0425][0426]
分别准备10
×
n6主盐、100
×
feedta、100
×
b5次盐、100
×
维生素、100mg l-1
naa、100mg l-1 6ba、30g l-1
谷氨酰胺、250g l-1
头孢噻肟、50g l-1
潮霉素b并将所需量或以上储液与麦芽糖、脯氨酸和维生素测定酪蛋白氨基酸混合，在将ph调节至5.8之后添加所需量的琼脂糖并灭菌，灭菌之后在无菌条件下从储液中添加所需量的谷氨酰胺、头孢噻肟和潮霉素b。